趙宇紅 陳世堅(jiān) 李坤平 鄭凌云

(廣東藥科大學(xué) 1藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院)

慢性腦缺血是引起老年腦認(rèn)知障礙的主要原因，研究表明，慢性腦缺血發(fā)生后，腦內(nèi)神經(jīng)血管的穩(wěn)態(tài)失衡，繼發(fā)的局部代謝障礙和蛋白代謝異常均可損傷神經(jīng)血管單元各組分，引起血管性癡呆、阿爾茨海默病等認(rèn)知障礙性疾病的發(fā)生〔1，2〕。川陳皮素(NOB)為傳統(tǒng)中藥陳皮中提取到的一種多甲氧基黃酮類化合物，脂溶性好，易于吸收和進(jìn)入中樞。研究表明，NOB可減輕缺血再灌注腦血管損傷，抑制腦內(nèi)炎癥反應(yīng)，具有神經(jīng)營養(yǎng)活性〔3〕，但NOB對腦慢性腦缺血的認(rèn)知改善及其神經(jīng)血管單元保護(hù)機(jī)制研究報(bào)道較少見。本實(shí)驗(yàn)利用慢性低灌注模型，觀察NOB對慢性低灌注環(huán)境下海馬區(qū)神經(jīng)血管單元的影響及機(jī)制。

1 資料及方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 8周齡SPF級昆明小鼠，重20～30 g，購自廣東省實(shí)驗(yàn)動物中心，飼養(yǎng)于廣東藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心SPF飼養(yǎng)室，自由攝食和飲水，12 h光暗交替，相對濕度55%，溫度為22～24℃。適應(yīng)1 w后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2分組與處理 隨機(jī)將小鼠分為假手術(shù)組、模型組、NOB低劑量組〔(25 mg/(kg·d)〕、高劑量組〔50 mg/(kg·d)〕各10只。造模前12 h禁食，用10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉，臥位固定，參照文獻(xiàn)方法〔4〕，沿頸正中切口切開皮膚，分離肌肉，暴露頸總動脈，結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈，假手術(shù)組不結(jié)扎，藥物組于造模前3 d開始給予藥物腹腔注射，術(shù)后繼續(xù)給藥2 w，其余各組給予等量生理鹽水。實(shí)驗(yàn)完成后，同前法麻醉，打開顱骨，迅速取出腦組織，置于冷的D-hank液中，冰上分離海馬，去除表面血管膜，置液氮中速凍，-80℃保存。

1.3藥品與試劑 NOB、水通道蛋白(AQP)4酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒及 Laminin ELISA試劑盒均購自上海江萊生物科技有限公司，Claudin-5 ELISA試劑盒自購武漢華美生物工程有限公司，海馬區(qū)神經(jīng)元生長相關(guān)蛋白(GAP)-43、突觸素(SYN)多克隆抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G購自Abcam公司，RNA提取試劑盒、cDNA合成試劑盒、RNA聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒均購自寶生物工程公司，其他常用試劑購自廣州賽哲生物科技股份有限公司。

1.4曠場實(shí)驗(yàn)〔5〕實(shí)驗(yàn)敞箱為40 cm×40 cm×40 cm大小，箱底部分為16格區(qū)域，將小鼠面朝墻置于箱角暗區(qū)，讓其自由探索環(huán)境10 min，每只接受1次測試，測試結(jié)束后，清水清洗場地并擦干，箱頂用攝像儀記錄內(nèi)小鼠活動總路程及中央?yún)^(qū)停留時(shí)間。

1.5Y迷宮實(shí)驗(yàn) ①新異臂探索實(shí)驗(yàn)：用隔板擋住新異臂，小鼠由起始臂末端放入，讓其自由活動10 min，訓(xùn)練結(jié)束放回籠，1 h后進(jìn)行測試，測試時(shí)取出新異臂隔板，讓其自由活動5 min，記錄其活動情況；②電刺激測試：Y迷宮以亮燈臂為安全區(qū) (不通電)，其他區(qū)均為非安全區(qū) (電擊區(qū)) 。安全區(qū)隨機(jī)變換，亮燈延遲5 s進(jìn)行電擊，以立即逃往安全區(qū)為一次正確反應(yīng)，連續(xù)9次正確反應(yīng)即為學(xué)會。實(shí)驗(yàn)中，將小鼠置于迷宮中適應(yīng)3 min，記錄其學(xué)會所需的訓(xùn)練次數(shù)，24 h后進(jìn)行記憶保持能力的檢測，以正確反應(yīng)次數(shù)占總檢測次數(shù)的百分比表示 (正確反應(yīng)次數(shù)/總檢測次數(shù)×100%)。

1.6腦海馬組織分離及蛋白提取 根據(jù)文獻(xiàn)方法〔6〕，小鼠麻醉后，迅速取出腦組織，冰上分離兩側(cè)海馬，用冰的磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后液氮速凍研碎，加入蛋白裂解液中裂解，4℃、12 000 r/min離心10 min，取上清，Bradford法測定蛋白含量。

1.7Western印跡法測定蛋白表達(dá) 采用Bio-Rad小型垂直電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(美國)，將提取的海馬組織蛋白按5∶1比例加入4×十二烷基硫酸鈉(SDS)緩沖液，100℃沸水變性3～5 min，10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)2 h，半干法轉(zhuǎn)膜35 min，5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入小鼠抗SYN、小鼠抗GAP-43、小鼠抗AQP-4及 Claudin-5，β-Tublin為對照，4℃過夜，磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)洗3次×10 min，HRP-抗小鼠IgG室溫孵育1 h，同前法漂洗，膜上加電化學(xué)發(fā)光(ECL)熒光顯影液，暗室曝光，室溫顯影、定影，沖洗膠片，用Image J program進(jìn)行灰度分析。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、最小顯著差異檢測，如方差不齊，經(jīng)秩和轉(zhuǎn)換后按前法進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1曠場實(shí)驗(yàn)測試 模型組自由活動總時(shí)間較假手術(shù)組稍下降，NOB組自由活動情況有增加，但無顯著性差異(P>0.05)。模型組中心區(qū)活動時(shí)間與假手術(shù)組相比明顯降低(P<0.05)，NOB組與模型組相比中心區(qū)活動時(shí)間延長，但僅NOB高劑量組差異顯著(P<0.05)。見表1。

表1 各組自由活動時(shí)間的

與模型組比較：1)P<0.05;下表同

2.2Y迷宮刺激實(shí)驗(yàn)測試 與假手術(shù)組相比，模型組達(dá)學(xué)會所需訓(xùn)練次數(shù)明顯增加，訓(xùn)練后正確率明顯下降(P<0.05)。NOB組與模型組相比，所需訓(xùn)練次數(shù)減少，訓(xùn)練后正確率下降，僅高劑量組差異顯著(P<0.05)，見表2。提示NOB高劑量對學(xué)習(xí)能力及記憶力均有改善作用。

表2 各組Y迷宮訓(xùn)練學(xué)會次數(shù)及正確反應(yīng)率

2.3各組海馬區(qū)神經(jīng)元可塑性相關(guān)蛋白表達(dá) 與模型組比較，假手術(shù)組GAP-43及SYN蛋白表達(dá)顯著高，NOB高、低劑量可顯著增加海馬區(qū)GAP-43及SYN蛋白的表達(dá)(P<0.05)，其中NOB高量組對蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用更顯著。見表3，圖1。

表3 各組海馬GAP-43及SYN蛋白表達(dá)

圖1 各組海馬GAP-43及 SYN蛋白表達(dá)

2.4各組海馬區(qū)血腦屏障功能變化 與模型組比較，假手術(shù)組AQP-4、Claudin-5蛋白表達(dá)顯著高，NOB高、低劑量組均可顯著增加海馬區(qū)AQP-4及Claudin-5蛋白的表達(dá)(P<0.05)，其中，高劑量組對蛋白表達(dá)的增加作用更顯著。見表4，圖2。

表4 各組海馬AQP-4及Claudin-5蛋白表達(dá)

圖2 各組海馬AQP-4及Claudin-5蛋白表達(dá)

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)CCH不影響小鼠的自主活動情況，但可降低小鼠的探索能力和學(xué)習(xí)記憶能力，而NOB可明顯改善這一現(xiàn)象。

神經(jīng)血管單元是腦結(jié)構(gòu)和功能的基本單位，腦內(nèi)神經(jīng)元與膠質(zhì)細(xì)胞、血管組成的微環(huán)境的改變都可影響腦的功能〔7〕。 海馬是與認(rèn)知記憶相關(guān)的重要腦區(qū)，海馬神經(jīng)細(xì)胞突觸可塑性的改變是認(rèn)知記憶減退的主要原因。GAP-43及 SYN蛋白與突觸可塑性密切相關(guān)，GAP-43高表達(dá)于突觸發(fā)生的神經(jīng)元突觸前膜，與突觸聯(lián)系的建立及突觸的損傷修復(fù)過程關(guān)系密切〔8〕。SYN蛋白位于突觸小泡囊泡膜上，SYN基因敲除小鼠在行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出明顯的學(xué)習(xí)記憶功能損傷〔9〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CCH可使GAP-43及SYN蛋白表達(dá)下調(diào)，而NOB可通過增加海馬區(qū)GAP-43及SYN蛋白的表達(dá)來調(diào)節(jié)神經(jīng)突觸可塑性，改善慢性腦缺血的學(xué)習(xí)記憶損傷。

AQP-4在腦內(nèi)廣泛分布于海馬齒狀回、腦血管表面及神經(jīng)元與突觸接觸的膠質(zhì)細(xì)胞，在血管周圍膠質(zhì)細(xì)胞上呈極性分布的AQP-4表達(dá)多與水分子流動及腦水腫有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，海馬區(qū)AQP-4的表達(dá)與神經(jīng)可塑性相關(guān)，腦片離體培養(yǎng)的研究發(fā)現(xiàn)，AQP-4敲除可引起海馬區(qū)θ波誘導(dǎo)的長時(shí)程增強(qiáng)受損及下調(diào)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1的表達(dá)，減少星形膠質(zhì)細(xì)胞對谷氨酸的重?cái)z取，使谷氨酸興奮性突觸過度激活，使突觸可塑性受損，并影響相關(guān)學(xué)習(xí)記憶行為〔10，11〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明NOB對CCH的學(xué)習(xí)記憶損傷的改善作用，可能與海馬AQP-4增高相關(guān)的海馬神經(jīng)可塑性表達(dá)有關(guān)。

Claudin-5蛋白是腦內(nèi)構(gòu)成內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接的主要蛋白，血腦屏障(BBB)通透性與Claudin-5的表達(dá)密切相關(guān)。動物研究表明，缺血后內(nèi)皮間結(jié)構(gòu)受損可使其表達(dá)下降，影響B(tài)BB的通透性，是神經(jīng)血管系統(tǒng)屏障功能紊亂的標(biāo)志蛋白〔12，13〕。本研究顯示，NOB可抑制CCH模型海馬Claudin-5的下調(diào)，改善由慢性腦缺血引起的BBB的功能紊亂。

總之，NOB可能通過影響神經(jīng)血管單元的多個(gè)靶點(diǎn)，提高神經(jīng)可塑性，調(diào)節(jié)神經(jīng)血管系統(tǒng)功能，在慢性腦缺血腦損傷中發(fā)揮腦保護(hù)作用。