胡歡歡 尹鳳仙 崔鎮(zhèn)花

(延邊大學附屬醫(yī)院腎內科，吉林 延吉 133000)

膜性腎病(MN)發(fā)病機制較為復雜，它是成人原發(fā)性腎病綜合征常見的一種病理類型，其特點是腎小球上皮細胞下電子致密物的沉積及非炎癥性病理變化，最終可導致腎小球基底膜增厚〔1,2〕。本研究通過建立用陽離子化牛血清白蛋白(C-BSA)制成的家兔原位免疫復合物性膜性腎病模型，用小柴胡湯加減中藥方，觀察其療效，并探討可能機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 白色雄性家兔28只，體重2.0～2.5 kg，適應性喂養(yǎng)1 w，視正常生長(期間查尿蛋白全部陰性)，隨機分為正常組(n=5)；模型組(n=8)；中藥組(n=8)；潑尼松組(n=7)。

1.2藥物 中藥復方由小柴胡湯(人參、炙甘草、柴胡、黃芩、半夏、生姜、大棗)去半夏加黃芪、靈芝、絞股藍組成，將上述中藥水煎，濃縮成每毫升含生藥2 g。

1.3模型制備 C-BSA的制備參照文獻〔3,4〕并加以改良。第1周預免疫：每1.5 ml磷酸鹽緩沖液中(pH7.4)含大腸桿菌內毒素1 μg和C-BSA 1 mg。每只兔耳緣靜脈注射1.5 ml。第2周開始正式免疫：家兔每只均耳緣靜脈注射C-BSA 15 mg/d，6次/w，共4 w。第6周起劑量加倍，30 mg/w，6次/w，共2 w。正常組每日注射生理鹽水2 ml。8 w后處死。

1.4給藥 實驗第3周開始中藥組灌飼中藥組按10 g/(kg·d)。潑尼松組灌飼潑尼松15 mg/d，直到第8周末處死動物為止。各實驗組每日喂食顆粒飼料150 g左右，自由飲水。

1.5觀察指標

1.5.1生化指標和尿蛋白測定 用磺基水楊酸法測24 h尿蛋白定量，測血清白蛋白(ALB)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、血尿素氮(BUN)及血肌酐(Scr)檢查(日立公司制7150型全自動生化分析儀測定)，測定24 h尿β2-微球蛋白(MG)、尿ALB、尿免疫球蛋白(Ig)G排出量(放射免疫法測定)。

1.5.2腎臟病理學檢查 ①光鏡檢查：實驗結束時取每只兔子的部分腎組織常規(guī)HE、PAS和PAM-Masson染色，制片后光鏡觀察。圖像分析取每個腎標本連續(xù)計數50個腎小球通過SEM-IPS圖像分析系統(tǒng)(BH2奧林巴士顯微鏡，全部放大倍數400倍)測出每個腎小球的直徑。②電鏡及腎小球基底膜(GBM)陰離子位點檢查：仿Schurer等〔5〕方法略改善，取每組兩只動物腎皮質數塊，用1%聚乙烯亞胺(PEI，分子量1 800 D，用等滲鹽水稀釋，1 mol/L鹽酸溶液調節(jié)pH至7.4)浸泡30 s，再加入二甲砷酸鈉緩沖液沖洗后，置于2%磷鎢酸/2.5%戊二醛溶液中(0.1 mol/L二甲砷酸緩沖液稀釋)室溫下固定2 h，二甲砷酸沖洗后按標準方法制片，在JE-1200EX型透射電鏡下觀察GBM電荷染色情況及毛細血管襻超微結構。

1.6統(tǒng)計學處理 采用SPSS22.0軟件進行方差分析及t檢驗。

2 結 果

2.1動物一般情況 體重：正常組動物體重平均增加0.53 kg；模型組平均增加0.18 kg；中藥治療組平均增加0.45 kg；潑尼松組平均減少0.58 kg。動物生存情況：共死亡兔4只，其中牛血清過敏反應2只(中藥組1只、潑尼松組1只)；死于衰竭2只(模型組1只、潑尼松組1只)。

2.2生化指標及尿蛋白測定 實驗第3周時，與模型組相比，中藥組血TG、血TC，潑尼松組血TC，正常組血ALB、血TG、血TC差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；中藥組與潑尼松組比較各生化指標無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；正常組血TG、血TC與潑尼松組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。實驗第8周時，與模型組相比，中藥組血Scr、血ALB、血TG、血TC，潑尼松組血Scr，正常組血Scr、血ALB、血TG、血TC差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；中藥組與潑尼松組比較血TG、血TC有顯著差異(P<0.01)；正常組血TG、血TC與潑尼松組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表1。模型組實驗第6周末24 h尿蛋白達高峰后呈明顯下降趨勢，第6、8周與中藥組及潑尼松組同期比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。實驗第8周末，中藥組尿蛋白排出量明顯少于潑尼松組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；各時間點各組24 h尿蛋白水平均較正常組顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表2。

表1 各組血液生化指標比較

與模型組比較:1)P<0.01；與潑尼松組比較:2)P<0.01

表2 各組實驗第2、4、6、8周24 h尿蛋白水平

與模型組比較：1)P<0.01；與潑尼松組比較：2)P<0.01；與正常組比較：3)P<0.01

2.3各組實驗第2、8周24 h尿β2-MG、ALB、IgG排出情況 第2周，各組24 h尿β2-MG、ALB、IgG排出量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。第8周，與模型組比較，正常組β2-MG、IgG、ALB排出量，中藥組及潑尼松組IgG、ALB排出量均明顯低于模型組(均P<0.01)，中藥組IgG，模型組IgG、ALB排出量均明顯高于潑尼松組(均P<0.01)。見表3。

表3 各組實驗第2、8周β2-MG、ALB、IgG排出情況

2.4腎臟病理變化 光鏡下除正常組外各實驗組均有不同程度腎小球肥大，腎小球毛細血管壁增厚，系膜增生，蛋白滲出及新月體形成，腎小管管腔擴張，上皮細胞壞死脫落，腎小管腔內有蛋白管型，間質細胞浸潤，動脈壁增厚等變化，見圖1。PAM-Masson染色基膜上皮側可見三色染色呈紅色的蛋白樣物質沉積及嗜銀的釘突形成，其中模型組變化最大。家兔腎小球直徑中藥組為(133.25±36.78)μm，潑尼松組(123.71±26.16)μm，模型組(169.38±32.20)μm，正常組(88.80±23.12)μm。模型組與治療組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。中藥組與潑尼松組無顯著差異(P>0.05)。

電鏡下正常家兔基底膜外疏松層陰離子位點呈高密度，顆粒較大，且規(guī)則分布，內疏松層低密度不規(guī)則分布，上皮細胞表面未發(fā)現PEI染色顆粒。模型組陰離子位點顯著減少，顆粒小。兩治療組陰離子位點部分呈單層，部分雙層，顆粒大小也與正常組近似，部分足突完整。見圖2。

圖1 各組腎臟病理變化(HE，×400)

3 討 論

本實驗結果表明小柴胡湯和潑尼松均能減少尿ALB、尿IgG排出，可減少24 h尿蛋白排出，提高血ALB，糾正脂質代謝紊亂，其中潑尼松組無明顯降血脂作用。兩種藥均能減少基底膜電荷丟失，表明兩組均能對腎小球的電荷屏障和分子屏障起到一定的保護作用。本文中藥組家兔在改善一般狀態(tài)如進食、體重變化及提高血ALB、減少尿蛋白、降血脂等方面明顯優(yōu)于潑尼松組，但后者在尿IgG排出明顯少于中藥組，推測潑尼松組在保護腎小球分子篩屏障方面優(yōu)于中藥組。對實驗家兔形態(tài)學上比較發(fā)現，中藥組和潑尼松組腎小球直徑與模型組相比有顯著差異，表明兩組藥物均能減輕腎小球肥大，潑尼松組更優(yōu)于中藥組。本實驗西藥的治療效果得到了驗證，但其副作用也明確體現出來，表明中藥復方對MN有一定治療效果，同時在改善全身一般狀態(tài)及減少副作用上優(yōu)于西藥。

本中藥復方系小柴胡湯加黃芪、靈芝、絞股藍、減半夏組成。近年來國內外學者對小柴胡湯的藥理作用進行了廣泛深入地研究，發(fā)現其具有糖皮質激素樣作用，具有增強機體免疫功能，進一步改善腎功能的作用〔6～9〕。MN是免疫性疾病同時其血栓和栓塞并發(fā)癥的發(fā)病率是腎病綜合征多種病理類型之冠。故我們在小柴胡湯基礎上增加了黃芪、靈芝、絞股藍增加其免疫調節(jié)和降血脂作用〔10～19〕，觀察該方對MN治療效果。實驗得到了我們預想結果，不僅明顯減少了免疫復合物形成和沉積而且具有明顯升高血ALB和降血脂作用，同時對GBM電荷屏障、分子篩屏障起一定的保護和修復作用。這種作用是該中藥降低腎病家兔尿蛋白的主要原因。推測該藥能中和血液中陽離子因子，阻止其對GBM陰電荷的破壞?，F代醫(yī)學認為免疫功能紊亂、脂質代謝紊亂、脂質過氧化、自由基和腎小球內凝血是腎炎發(fā)生、發(fā)展的重要因素。中藥復方可能亦通過影響這些因素治療、延緩MN進展。

綜合分析本文資料，說明中藥復方治療MN效果確切。它能抑制和減少免疫復合物形成并清除腎小球上皮下沉積的IC，減輕腎小球濾過膜損害，促進GBM屏障的恢復，減少蛋白尿，其作用機制是多個方面的。本研究為這一中藥治療腎炎提供了實驗依據。