田 瑩檀 軍趙 帥郭建軍?

（1.貴州大學(xué)昆蟲研究所，貴州山地農(nóng)業(yè)病蟲害重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2.遵義醫(yī)科大學(xué)，組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，貴州 遵義 563000）

腫瘤是機(jī)體在各種致瘤因素作用下，部分細(xì)胞增殖與分化調(diào)控異常而形成，細(xì)胞凋亡調(diào)控機(jī)制的失常在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。乳腺癌是女性癌癥中最常見的一種，約占所有女性所患癌癥的18%［1］，中國每年乳腺癌發(fā)病數(shù)可達(dá)16.9萬，占全球總發(fā)病數(shù)的12.25%［2］?；熕幬镌谥委煱┌Y中療效顯著，但有較大的不良反應(yīng)，故發(fā)掘不良反應(yīng)小、能抑制腫瘤細(xì)胞生長的活性物質(zhì)是抗腫瘤藥物研究的熱點之一［3-4］。中藥具有不良反應(yīng)小、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡等特點，在臨床治療腫瘤中受到重視［5］。九香蟲是具有此類功能的傳統(tǒng)中藥，屬于昆蟲綱半翅目兜蝽科昆蟲［6］，主要分布于東南亞地區(qū)，包括中國、日本、印度、印度尼西亞、馬來半島等地，在我國廣泛分布于長江以南地區(qū)［7］，始載于《本草綱目》，具有理氣止痛、溫中助陽的功效，中醫(yī)用其治療胃痛、痛經(jīng)、腎炎、遺精等疾??；現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，九香蟲也具有抗腫瘤、抗菌、溶解血栓、治療常見的消化道疾病及血管瘤等功效［8-10］。

九香蟲在抗癌方面具有較好研究基礎(chǔ)，可用于治療食管癌、胃癌等［11］；含九香蟲的中藥復(fù)方香龍散（半夏、天龍、九香蟲等）能夠誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞（HS-746T）凋亡［12］；中藥癌痛克（全蝎、土元、九香蟲等）可抑制HepG2 細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)其凋亡而發(fā)揮抗肝癌作用［13］。課題組前期研究表明，九香蟲血淋巴可抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7 和胃癌細(xì)胞SGC-7901 增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［10，14-15］；九香蟲含藥血清對人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480 具有抑制增殖、促進(jìn)凋亡的作用［16］；九香蟲三氯甲烷浸提物能抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901 和肝癌細(xì)胞HepG2 增殖，對HepG2 細(xì)胞抗腫瘤活性可能是通過阻滯細(xì)胞周期［17］。于聲等［18］研究表明，九香蟲水提液可通過阻滯細(xì)胞周期抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901、肝癌細(xì)胞HepG2 增殖，但九香蟲水提液的主要成分及其對乳腺癌細(xì)胞是否具有抑制增殖作用目前尚未見報道。本研究制備九香蟲水提液后分析其主要成分，檢測其對乳腺癌細(xì)胞的增殖抑制作用，以期為該昆蟲開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 九香蟲購自貴州省凱里市下司鎮(zhèn)，置于恒溫干燥箱烘干備用。人乳腺癌細(xì)胞系MDAMB-453、HCC-1937 及小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1 購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2 試劑與藥物 L-15 培養(yǎng)基（武漢博士德生物工程有限公司）；RPMI-1640 培養(yǎng)基（美國賽默飛公司）；甲醇（德國CNW Technologies 公司）；L-2-氯苯丙氨酸（上海恒柏生物科技有限公司）；0.22 μm針管式過濾器（美國密理博公司）；SDSPAGE 凝膠配制試劑盒（北京康為世紀(jì)有限公司）；考馬斯亮藍(lán)R250（北京索萊寶科技有限公司）。

1.3 儀器 倒置相差顯微鏡（廈門麥克奧迪有限公司）；202 型電熱恒溫干燥箱（北京永光明醫(yī)療儀器廠）；超低溫冰箱、Heraeus Fresco17 離心機(jī)、酶聯(lián)免疫檢測儀（美國賽默飛公司）；Agilent 7890A 氣相色譜儀（美國安捷倫公司）；PEGASUS HT 質(zhì)譜儀（美國力可公司），PS-60AL 超聲儀（深圳雷德邦電子有限公司）；LNG-T98 真空干燥儀（太倉華美生化儀器廠）；垂直電泳系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)（美國伯樂公司）。

1.4 方法

1.4.1 樣品制備 九香蟲用純水清洗2 次，濾紙吸干蟲體表面水分，置于80 ℃電熱恒溫干燥箱中烘烤4 h。將干燥的九香蟲研磨成粉末，稱取10 g蟲粉，加入20 mL 純水，置于4 ℃冰箱中浸泡7 d，制備成質(zhì)量濃度為0.5 g／mL 的水提液，4 ℃、6 000×g離心10 min，吸取上清液，0.22 μm 微孔濾頭過濾除菌，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

取200 μL 九香蟲水提液于1.5 mL EP 管中，加入800 μL 甲醇，再加入5 μLL-2-氯苯丙氨酸（1 mg／mL 溶于純水中）作為內(nèi)標(biāo)，渦旋30 s，于-20 ℃下靜置10 min，冰水浴中超聲5 min，12 000×g離心15 min，小心吸取上清液400 μL，在真空干燥儀中干燥，向干燥后的物質(zhì)加入甲氧胺鹽試劑（甲氧胺鹽酸鹽溶于吡啶中，20 mg／mL），輕輕混勻后放入80 ℃烘箱中孵育30 min，向每個樣品中加入BSTFA（含有1% TMCS），將混合物在70 ℃下孵育1.5 h，隨機(jī)作上機(jī)檢測。

1.4.2 分析條件

1.4.2.1 GC DB-5MS 毛細(xì)管色譜柱（30 m×250 μm，0.25 μm）；載氣高純度氦氣，前進(jìn)樣口體積流量3 mL／min；柱體積流量1 mL／min；進(jìn)樣量1 μL；初始溫度50 ℃，持續(xù)1 min，然后以10 ℃／min的速率上升到310 ℃，保持8 min。

1.4.2.2 MS 前進(jìn)樣口、傳輸線和離子源溫度280、280、250 ℃；離子源EI；電子能量70 eV；質(zhì)譜數(shù)據(jù)在全掃描模式下獲得，質(zhì)量掃描范圍m／z50～500。

1.4.3 Bradford 法測蛋白含有量 用純水將蛋白對照品BSA 稀釋成0、0.125、0.250、0.500、0.750、1、1.500 mg／mL，分別取5 μL 蛋白對照品、九香蟲水提液加入96 孔板，各孔加入250 μL考馬斯亮藍(lán)G250 染色液，每組重復(fù)5 次。酶聯(lián)免疫檢測儀測定595 nm 波長處吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品蛋白濃度。

1.4.4 SDS-PAGE 電泳分析 取100 μL 水提液，加入25 μL 蛋白上樣緩沖液（5×），于沸水中加熱15 min，6 000×g離心1 min，取上清液。SDSPAGE 凝膠由12% 分離膠和5% 濃縮膠組成。取20 μL上清液（蛋白質(zhì)量濃度0.843 mg／mL）和8 μL 蛋白對照品（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）加到凝膠加樣孔中進(jìn)行電泳，樣品重復(fù)4 次。電壓80 V 下電泳30 min，再調(diào)整為110 V 繼續(xù)電泳90 min，直至溴酚藍(lán)遷移至凝膠底部1 cm 左右時停止，取出凝膠，放入考馬斯亮藍(lán)R250 染色液中染色2 h，再取出，放入脫色液中脫色8 h，每隔1 h更換脫色液，直至色帶清晰，通過凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。

1.4.5 人乳腺癌細(xì)胞及小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1 培養(yǎng) 人乳腺癌HCC-1937 與小鼠乳腺癌4T1 細(xì)胞使用含10%胎牛血清（FBS）、1%青鏈霉素混合液的RPMI-1640 培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；人乳腺癌MDA-MB-453 使用含10% FBS、1%青鏈霉素混合液的L-15 培養(yǎng)基，置于37 ℃、空氣相培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔48 h 換液，細(xì)胞鋪滿至細(xì)胞培養(yǎng)瓶底部80%時進(jìn)行傳代，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.4.6 九香蟲水提液對乳腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用 使用0.25%胰酶消化處于對數(shù)生長期的MDAMB-453、HCC-1937、4T1 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105／mL，分別接種于96 孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，設(shè)置實驗組、無藥對照組（細(xì)胞組）及空白對照組。用對應(yīng)培養(yǎng)基將九香蟲水提液稀釋成質(zhì)量濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 g／mL（生藥比），并用0.22 μm 微孔濾頭過濾除菌，24 h后棄舊培養(yǎng)液，加入梯度水提液，每個質(zhì)量濃度設(shè)5個復(fù)孔。藥物作用48 h 后，倒置相差顯微鏡拍攝細(xì)胞形態(tài)圖，每孔加MTT（5 g／L）20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后吸去培養(yǎng)液，每孔加200 μL 二甲基亞砜，恒溫?fù)u床振蕩10 min 以徹底溶解紫色結(jié)晶，酶標(biāo)儀在570 nm 波長處檢測光密度（OD），每組實驗重復(fù)3 次。計算細(xì)胞增殖率，公式為增殖率＝［（OD實驗組-OD空白組）／（OD無藥組-OD空白組）］×100%，并計算半數(shù)抑制濃度（IC50）。

1.4.7 九香蟲水提液對小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1 遷移的影響 取對數(shù)生長期的4T1 細(xì)胞，用胰酶消化并接種于24 孔板（4×104／孔），置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長90%融合時，用RPMI-1640 培養(yǎng)液稀釋九香蟲水提液，加藥質(zhì)量濃度分別為0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 g／mL，每個質(zhì)量濃度4 個復(fù)孔。培養(yǎng)24 h 后，用200 μL移液槍槍頭沿每個孔的中軸劃痕，無菌PBS 洗滌3次，加培養(yǎng)液培養(yǎng)，分別在0、24 h 用倒置相差顯微鏡拍照，觀察各組細(xì)胞遷移情況，并采用Image J、SPSS 17.0 軟件對實驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。細(xì)胞遷移率＝ ［（劃痕寬度0h-劃痕寬度24h）／劃痕寬度0h］×100%。

1.5 數(shù)據(jù)處理 通過SPSS 17.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，所有數(shù)據(jù)以（±s）表示。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 GC-MS 測定 通過ChromaTOF 軟件對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行峰提取、基線矯正、解卷積、峰積分等處理［19］，離子流色譜圖見圖1，再使用LECO-Fiehn Rtx5 數(shù)據(jù)庫，包括質(zhì)譜匹配及保留時間指數(shù)匹配，對物質(zhì)進(jìn)行定性分析，峰面積歸一化法得出各成分相對含有量。根據(jù)數(shù)據(jù)庫匹配相似性≥800，篩選相對含有量較高的20 個化合物，見表1。

圖1 九香蟲水提液GC-MS 總離子流圖Fig.1 GC-MS total ion current chromatogram of aqueous extract from A.chinensis

2.2 九香蟲水提液蛋白含有量測定 根據(jù)不同濃度牛血清白蛋白對照品溶液（BSA）的平均光密度，繪制蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，方程為Y＝0.22X+0.54（R2＝0.948 6）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和九香蟲水提液平均光密度值（0.726），測得九香蟲水提液蛋白含有量為0.843 mg／mL，RSD 為5.234%。

2.3 九香蟲水提液蛋白組成 從SDS-PAGE 電泳圖中可見電泳譜帶清晰，重復(fù)性好，九香蟲水提液主要蛋白分子量約為75、35、30、25、12 kDa，蛋白組成較豐富。見圖2。

2.4 水提液對乳腺癌細(xì)胞增殖抑制的作用 不同濃度九香蟲水提液作用于乳腺癌MDA-MB-453 細(xì)胞48 h 后，通過細(xì)胞形態(tài)圖比較和MTT 法檢測九香蟲水提液對MDA-MB-453 細(xì)胞的增殖作用。結(jié)果，實驗組細(xì)胞皺縮，體積變小，細(xì)胞貼壁能力降低，漂浮細(xì)胞較多，對照組細(xì)胞呈飽滿的圓形，貼壁細(xì)胞數(shù)量較多，細(xì)胞輪廓清晰。見圖3。

MTT 顯示，九香蟲水提液可顯著抑制MDA-MB-453、HCC-1937 及4T1 細(xì)胞的生長。HCC-1937 細(xì)胞對九香蟲水提液較為敏感（IC50為0.059 g／mL），MDA-MB-453 次之（IC50為0.142 g／mL），4T1 細(xì)胞耐受性最強(qiáng)（IC50為0.190 g／mL），表明九香蟲水提液具有抑制人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-453、HCC-1937 及小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1 增殖的作用，且呈濃度依賴性。見圖4～6。

圖2 九香蟲水提液SDS-PAGE 電泳圖譜Fig.2 SDS-PAGE electrophoresis of aqueous extract from A.chinensis

圖3 九香蟲水提液作用48 h 對MDA-MB-453 細(xì)胞形態(tài)的影響（×200）Fig.3 Effects of aqueous extract from A.chinensis on the morphology of MDA-MB-453 cells for 48 h（×200）

圖4 九香蟲水提液作用48 h 對MDA-MB-453 細(xì)胞增殖的影響Fig.4 Effects of aqueous extract from A.chinensis on the proliferation of MDA-MB-453 cells for 48 h

圖5 九香蟲水提液作用48 h 對4T1 細(xì)胞增殖的影響Fig.5 Effects of aqueous extract from A.chinensis on the proliferation of 4T1 cells for 48 h

2.5 不同濃度水煎液對4T1 細(xì)胞遷移的影響 通過4T1 劃痕實驗觀察細(xì)胞愈合情況，發(fā)現(xiàn)對照組遷移距離大于實驗組，表明九香蟲水提液能夠抑制4T1 細(xì)胞的遷移能力。另外，對照組4T1 細(xì)胞遷移率為59.28%，0.02、0.04、0.06、0.08 g／mL 水提液作用于4T1 細(xì)胞24 h 后遷移率分別為54.37%、32.42%、29.78%、14.53%，但0.1 g／mL水提液作用于4T1 細(xì)胞24 h 后，大量細(xì)胞漂浮，無法測得遷移率。見圖7～8。

圖6 九香蟲水提液作用48 h 對HCC-1937 細(xì)胞增殖的影響Fig.6 Effects of aqueous extract from A.chinensis on the proliferation of HCC-1937 cells for 48 h

3 結(jié)論與討論

圖7 九香蟲水提液作用0、24 h 對4T1 細(xì)胞遷移的影響（×40）Fig.7 Effects of aqueous extract from A.chinensis on the migration of 4T1 cells for 0 h and 24 h（×40）

圖8 九香蟲水提液作用24 h 對4T1 遷移的影響Fig.8 Effects of aqueous extract from A.chinensis on the migration of 4T1 cells for 24 h

乳腺癌是嚴(yán)重威脅女性健康的惡性腫瘤之一，發(fā)病率居于女性腫瘤疾病之首［20］。隨著對乳腺癌認(rèn)識的逐步深入，乳腺癌治療的觀念也正在轉(zhuǎn)變。傳統(tǒng)的乳腺癌治療方式主要包括手術(shù)、化療、放療以及內(nèi)分泌治療，其中化療藥物在治療癌癥中起了很大作用，但不良反應(yīng)較大，給患者造成了極大的痛苦，尋找不良反應(yīng)低，又可以抑制腫瘤細(xì)胞生長，促進(jìn)其凋亡的非細(xì)胞毒性藥物成為研究的重要方向。中醫(yī)藥治療癌癥受到中外學(xué)者的廣泛重視，發(fā)掘傳統(tǒng)中醫(yī)藥資源，已成為我國抗腫瘤新藥篩選研究的重點之一［21］。九香蟲作為傳統(tǒng)中藥，其藥用價值越來越受到重視。GC-MS 分析結(jié)果顯示，九香蟲水提液中含有量較多的物質(zhì)有L-蘋果酸、核糖、乳糖酸、棕櫚酸、絲氨酸、硬脂酸等物質(zhì)。研究表明，L-蘋果酸具有抗氧化和抗疲勞的功能［22］；L-核糖進(jìn)入生物體合成L-核糖核酸［23］，后者可干擾病毒或者腫瘤細(xì)胞DNA 合成，影響核酸轉(zhuǎn)錄過程，抑制蛋白合成，達(dá)到抑制腫瘤的作用［24］；絲氨酸廣泛參與人體內(nèi)細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)和功能蛋白的合成［25］；棕櫚酸可誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞AR42 J 凋亡［26］；肌酐可抑制胃癌BGC-823 細(xì)胞株酵解活性，阻斷腫瘤細(xì)胞的主要能量來源［27］。九香蟲水提液主要成分為糖類、氨基酸、脂肪酸類物質(zhì)，未發(fā)現(xiàn)對人體有害物質(zhì)，但其在體內(nèi)作用的安全性仍需進(jìn)一步實驗明確。

本實驗所用的HCC-1937 細(xì)胞是高轉(zhuǎn)移和高侵襲性的三陰性人乳腺癌細(xì)胞［28］，即雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、人類表皮生長因子受體-2（HER-2）均為陰性的人乳腺癌細(xì)胞。MDAMB-453 細(xì)胞是成纖維細(xì)胞生長因子-1（FGF-1）受體過表達(dá)、HER-2 陽性、PR 和ER 陰性的人乳腺癌細(xì)胞［29-30］，對于不同類型的乳腺癌細(xì)胞，九香蟲水提液均具有抑制其增殖的作用。4T1 為高轉(zhuǎn)移和高侵襲的三陰性小鼠乳腺癌細(xì)胞［31］，乳腺癌4T1 移植瘤模型細(xì)胞生長和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移與人類乳腺癌Ⅳ期非常相似［32］，為便于后期構(gòu)建乳腺癌動物模型，探究九香蟲水提液對小鼠乳腺癌的體內(nèi)抗腫瘤作用，本研究檢測了九香蟲水提液對小鼠乳腺癌4T1 細(xì)胞增殖及遷移的影響，結(jié)果顯示，九香蟲水提液能顯著抑制4T1 細(xì)胞的增殖與遷移，以期為九香蟲的深層次開發(fā)利用提供參考。