冶昡青，郭壽清，喬自林，劉振斌

（1.西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心 甘肅省動(dòng)物細(xì)胞技術(shù)創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030；3.西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心 生物工程與技術(shù)國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730030）

流感（influenza）是由流感病毒（influenza virus）引起的一種可在禽類和哺乳動(dòng)物間進(jìn)行傳播的呼吸道傳染病。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計(jì)，全球每年流感感染人數(shù)達(dá)到10億以上，25～50萬人感染致死。該病對(duì)社會(huì)經(jīng)濟(jì)和人類的健康造成極大的威脅。

普遍認(rèn)為，免疫接種是控制流感流行最為有效的措施。采用基于動(dòng)物細(xì)胞的流感疫苗生產(chǎn)工藝，具有較高的安全性、有效性、低致敏性等優(yōu)勢。MDCK細(xì)胞系通常是以貼壁方式生長的上皮樣細(xì)胞，由于其病毒感染效率高、增殖快，且不易變異，MDCK細(xì)胞系被公認(rèn)為最適于甲、乙型流感病毒疫苗生產(chǎn)的3種細(xì)胞系之一。但MDCK細(xì)胞貼壁性狀難以實(shí)現(xiàn)疫苗大規(guī)模生產(chǎn)，單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)更適合流感爆發(fā)期疫苗的批量生產(chǎn)。常規(guī)的懸浮細(xì)胞馴化過程周期較長，培養(yǎng)成本較高，并且細(xì)胞多次傳代很可能降低細(xì)胞的活性和增值效率。

因此，利用基因工程的手段對(duì)MDCK細(xì)胞貼壁性相關(guān)基因進(jìn)行改造，人工建立穩(wěn)定的具有懸浮性狀的MDCK細(xì)胞系，對(duì)于促進(jìn)疫苗生產(chǎn)的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程具有重要意義。CDH1基因是E-鈣黏蛋白(cadherin)的編碼基因，E-cadherin是鈣粘蛋白家族成員。研究發(fā)現(xiàn)E-鈣粘蛋白在很多上皮細(xì)胞的粘附功能中發(fā)揮著重要的作用，理論上當(dāng)細(xì)胞的黏附能力降低或被抑制時(shí)，細(xì)胞就會(huì)向懸浮的狀態(tài)轉(zhuǎn)化，本研究試圖用分子生物學(xué)手段，通過慢病毒介導(dǎo)建立沉默CDH1基因的MDCK細(xì)胞株，驗(yàn)證細(xì)胞貼壁性（懸浮性）的變化情況，在細(xì)胞株建立過程中，最佳的MOI值及嘌呤霉素濃度的測定尤為重要，直接決定著穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系構(gòu)建的成敗。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞及病毒 CDH1干擾陰性對(duì)照慢病毒（病毒滴度：5×108TU/mL）（上海吉?jiǎng)P生物科技有限公司）；MDCK貼壁細(xì)胞系（ATCC，# CCL-34）

1.1.2 試劑與儀器 DMEM（蘭州百靈，#BGL M101.01）；胎牛血清（Cellmax，# SA311.01）；0.25% 胰酶（Cell Max，CPT101.02）；嘌呤霉素（blasticidin）；HitransGP試劑（上海吉?jiǎng)P）。

CO2培養(yǎng)箱（SANYO，MCO-175型）；熒光顯微鏡（OLYMPUS，IX83）；生物安全柜（BAKER，BCG401）。

1.2 方法

1.2.1 慢病毒感染MDCK細(xì)胞的最佳MOI值測定取對(duì)數(shù)生長期的MDCK細(xì)胞，以1.5×104個(gè)/孔密度鋪板于96孔板中，37℃，5% CO2培養(yǎng)16 h，細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%，以MOI值為0、10、50、100（TU number/cell）（每個(gè)MOI值設(shè)6個(gè)復(fù)孔）的熒光標(biāo)記的CDH1干擾陰性對(duì)照慢病毒分別侵染MDCK細(xì)胞，同時(shí)加入HitransGP助染試劑，病毒侵染期間每4 h觀察細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞發(fā)生病變趨勢或明顯病變則換液為細(xì)胞完全培養(yǎng)基，細(xì)胞形態(tài)良好則病毒侵染24 h后換液為完全培養(yǎng)基，病毒感染細(xì)胞72 h后使用熒光顯微鏡觀察，熒光比率達(dá)到80%～90%且細(xì)胞形態(tài)基本不變，對(duì)應(yīng)的MOI值確定為最佳MOI值。熒光比率=細(xì)胞熒光表達(dá)量/白光細(xì)胞總量×100%

1.2.2 嘌呤霉素最佳濃度的測定 取對(duì)數(shù)生長期的MDCK細(xì)胞，以1.5×104個(gè)/孔密度鋪板于96孔板中，37℃，5% CO2培養(yǎng)16 h，細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%，向細(xì)胞中分別加入0～11μg/ml Puromycin，每1μg/ml設(shè)置一個(gè)濃度梯度，每個(gè)濃度梯度設(shè)置六個(gè)復(fù)孔，每24 h進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算活細(xì)胞比率，兩天換一次液，第4天細(xì)胞全部死亡的最低濃度確定為嘌呤霉素最佳濃度。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒感染MDCK細(xì)胞的最佳MOI值測定結(jié)果

隨著MOI值的增加，細(xì)胞形態(tài)基本沒有改變，當(dāng)MOI≤10時(shí)，熒光比率為0%，MOI=50時(shí)，熒光比率為40%～50%，當(dāng)MOI=100時(shí)，細(xì)胞的熒光比率為80%～90%，此時(shí)細(xì)胞形態(tài)正常，MOI=100被確定為慢病毒感染MDCK細(xì)胞的最佳MOI值，見圖1。

圖1 不同MOI值下MDCK細(xì)胞熒光率鏡檢結(jié)果（×200）

2.2 嘌呤霉素的最佳濃度測定

加入Puromycin第四天，當(dāng)Puromycin濃度為0μg/ml時(shí)，細(xì)胞存活率為95%，形態(tài)正常；當(dāng)Puromycin濃度為6μg/ml時(shí)，細(xì)胞存活率為15%，大部分細(xì)胞形態(tài)變圓，失去貼壁性，該濃度Puromycin明顯抑制了細(xì)胞的增殖。當(dāng)Puromycin≥7μg/ml時(shí)，MDCK細(xì)胞存活率為0%，細(xì)胞形態(tài)已全部變成圓形，細(xì)胞失去原有的貼壁性。因此7μg/ml被確定為Puromycin最佳濃度。見圖2、圖3。

圖2 不同濃度Puromycin加入第四天細(xì)胞鏡檢結(jié)果（×100）

圖3 不同濃度Puromycin加入第四天MDCK細(xì)胞存活率結(jié)果

3 討論

在整個(gè)測定細(xì)胞最佳MOI值試驗(yàn)設(shè)計(jì)中，需要增加一個(gè)空白對(duì)照，通過觀察完全培養(yǎng)基中添加HitransGP的細(xì)胞狀態(tài)，得知HitransGP對(duì)細(xì)胞有無影響。在慢病毒侵染細(xì)胞的前4～6 h，可適當(dāng)減少細(xì)胞培養(yǎng)體積，從而增加病毒濃度，加快和增強(qiáng)病毒進(jìn)入細(xì)胞，6 h左右酌情補(bǔ)液，24 h換成完全培養(yǎng)基即可，之后細(xì)胞培養(yǎng)過程中可以不再換液。若換液過于頻繁，可能會(huì)影響細(xì)胞生長狀態(tài)，不利于細(xì)胞最佳MOI值的結(jié)果判斷。通過試驗(yàn)得知，當(dāng)MOI值為100時(shí)，細(xì)胞的熒光率在80%～90%，細(xì)胞的死亡率較低，病毒的侵染效果最佳。

導(dǎo)入細(xì)胞的目的基因中載有特殊的抗性基因，產(chǎn)生的基因表達(dá)產(chǎn)物，使細(xì)胞對(duì)特定抗生素有抗性，空白細(xì)胞缺少抗性產(chǎn)物而被殺死，本實(shí)驗(yàn)中慢病毒載體帶有抗Puromycin的抗性基因，在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入一定濃度Puromycin時(shí)，不含抗性基因的MDCK空白細(xì)胞被殺死，含抗性基因的慢病毒載體導(dǎo)入細(xì)胞后表現(xiàn)為陽性細(xì)胞，陽性細(xì)胞能夠存活。Puromycin濃度過低會(huì)導(dǎo)致MDCK空白細(xì)胞無法全部殺死，影響最終感染效率，Puromycin濃度過高則造成陽性細(xì)胞表達(dá)下降，因此正式實(shí)驗(yàn)前需要測定Puromycin最佳作用濃度。結(jié)果顯示加Puromycin第四天濃度為6μg/ml時(shí)，細(xì)胞存活率為15%，不能達(dá)到對(duì)空白細(xì)胞的理想殺滅效果，當(dāng)Puromycin濃度≥7μg/ml時(shí)，細(xì)胞死亡率達(dá)100%，7μg/ml是第四天細(xì)胞全部死亡的最低濃度，故7μg/ml被確定為嘌呤霉素的最佳濃度。

經(jīng)過對(duì)最佳的MOI值及嘌呤霉素濃度的篩選測定，為后續(xù)慢病毒介導(dǎo)沉默CDH1基因的MDCK細(xì)胞株的建立奠定了夯實(shí)的基礎(chǔ)。