姚海蘭，宋娟，王欣玲，王瑞芳，宋芹芹，史冰田，韓俊

1. 首都兒科研究所生物化學與免疫室， 北京 100020； 2. 中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所傳染病預防控制國家重點實驗室， 北京 102206

柯薩奇病毒(Coxsackie virus, CV)是微小RNA病毒科腸道病毒屬的單股正鏈RNA病毒，可分為A(Coxsackie virus groups A, CVA)和B(Coxsackie virus groups B, CVB)兩組。CVA分為23個型別，CVA1～23；CVB分為6個型別，CVB1～6。其中，柯薩奇病毒B3型(Coxsackie virus B3, CVB3)是引起人類病毒性心肌炎的重要病原體之一[1]。

目前，已有確鑿證據(jù)表明，病毒來源的小RNA (viral small RNA，vsRNA)存在于哺乳動物。在微小RNA病毒科病毒感染的宿主細胞中發(fā)現(xiàn)了2種vsRNA，1種是病毒來源的小干擾RNA (virus-derived small interfering RNA，vsiRNA)，它是在RNA復制過程中由病毒雙鏈RNA中間體加工而成；另1種來自高度堿基配對的單鏈基因組區(qū)域的小RNA，例如微小RNA病毒的內(nèi)部核糖體進入位點序列(internal ribosome entry site, IRES)。微小RNA病毒科病毒，如腦心肌炎病毒、腸道病毒A71 (EV-A71)和脊髓灰質炎病毒(poliovirus)等，均已被證實可誘導哺乳動物細胞產(chǎn)生病毒衍生小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA )，即vsiRNA[2-5]。

病毒基因在轉錄過程中產(chǎn)生一些雙鏈RNA(double-stranded RNA, dsRNA)[6]。而宿主細胞質中的RNA內(nèi)切酶Dicer可迅速針對dsRNA發(fā)生反應，將其切割成多個特定小片段RNA(21～23 bp)，此為外源性siRNA(exogenous siRNA，exo-siRNA)[7-8]。siRNA也來源于細胞基因組產(chǎn)生的信使RNA(messenger RNA，mRNA)轉錄物、假基因衍生的反義轉錄物的雙鏈體和發(fā)夾RNA(hairpin RNA，hpRNA)[7,9]。

siRNA與 Argonaute(AGO)蛋白家族相互作用，通過RNA干擾(RNA interference，RNAi)過程控制病毒RNA的復制。siRNA在RNA解旋酶的作用下解鏈成正義鏈和反義鏈，繼之反義鏈與解旋酶、內(nèi)外切酶等結合，形成RNA誘導的沉默復合物(RNA-induced silencing complex，RISC)[6]。RISC與外源基因表達的mRNA同源區(qū)進行特異性結合。由于RISC具有核酸酶的功能，可在與siRNA 反義鏈互補結合的兩端切割mRNA，使其降解。此外，siRNA可作為引物與靶RNA結合并在RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase, RdRP)作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割產(chǎn)生大量的次級siRNA，從而使RNAi的作用進一步放大，最終將靶mRNA完全降解[6,9]。siRNA在基因轉錄后修飾、抗病毒感染等方面發(fā)揮了重要作用[7,10-12]。本研究通過小RNA高通量測序，了解CVB3感染是否誘導內(nèi)源性siRNA的產(chǎn)生，期望為進一步研究CVB3感染對siRNA表達的影響及其作用機制以及是否通過siRNA影響病毒復制等奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

HeLa細胞和CVB3由本實驗室保存，細胞培養(yǎng)液和胎牛血清購自GIBCO公司。

1.2 方法

1.2.1 CVB3感染HeLa細胞 HeLa細胞以6×106/孔傳至6孔板，過夜培養(yǎng)至細胞密度為90%。CVB3(MOI=5)接種HeLa細胞，細胞在培養(yǎng)箱(5% CO2、37 ℃)孵育1 h。隨后加入含2%血清的細胞維持液，繼續(xù)培養(yǎng)3 h和6 h后收集細胞。

1.2.2 高通量測序(二代測序) 使用試劑盒(QIAamp RNA kit，德國QIAGEN公司)提取細胞RNA，反轉錄(Superscript Ⅲ First-Strand Synthesis System，美國Invitrogen公司)合成cDNA。取通過質控檢測的樣本進行下游的文庫構建。cDNA經(jīng)純化后生成 Illumina’s Cluster Station上的Cluster，即可加入測序儀(HiSeq 2000，Illumina公司)進行測序。測序過程中使用 Illumina’s sequencing control studio software version 2.8軟件，實時分析測序圖片，提取原始數(shù)據(jù)用于基本數(shù)據(jù)分析(Illumina’s real-time analysis version 1.8.70)。

1.2.3 測序結果分析 過濾數(shù)據(jù)，去除插入片段過長的序列、低質量序列、poly A序列和小片段序列，得到clean tags。將clean tags 和已知的小RNA數(shù)據(jù)庫包括miRBase[13]、Rfam[14]、siRNA、piRNA、snoRNA等進行比對。除Rfam使用cmsearch外[15]，其余都用Bowtie2軟件[16]對clean tag和小RNA數(shù)據(jù)庫進行比對。通過與已知的小RNA數(shù)據(jù)庫比對，鑒定出已知的siRNA。

統(tǒng)計siRNA的種類及數(shù)量，并對其做長度分布統(tǒng)計。使用每千個堿基的轉錄每百萬映射讀取的轉錄本數(shù)(transcripts per kilobase of exonmodel per million mapped reads，TPM)標準化小RNA的表達方式，參照Audic等[17]的差異基因檢測法，篩選兩樣本的差異表達基因。對差異檢驗的P值進行多重假設檢驗校正，通過控制錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate，F(xiàn)DR)決定P值的域值[18]。

1.2.4 反轉錄-聚合酶鏈反應 使用莖-環(huán)結構設計novel_sir3502和novel_sir2806的反轉錄-聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)，引物為5′-CTCAACTGGT-GTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG-3′，使用反向引物進行反轉錄。內(nèi)參：U6 F CTCGCTT-CGGCAGCACA; U6 R AACGCTTCACGAAT-TTGCGT。體系為5×SYBR Green qPCR Mix 4 μL、20×miRNA Primer F 1 μL、20×miRNA Primer R 1 μL、cDNA模板1 μL，ddH2O加至 20 μL。采用兩步法擴增：95 ℃ 15 min；95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s, 35個循環(huán)。通過2-ΔΔCT值計算病毒感染細胞與正常細胞之間siRNA表達量的變化。

2 結果

2.1 CVB3感染HeLa細胞后siRNA的總體出現(xiàn)差異

為了明確CVB3感染HeLa細胞3 h和6 h后，細胞中siRNA種類和表達水平的總體差異，我們分析比較了樣本的公共序列和特有序列。結果顯示，與正常培養(yǎng)3 h和6 h的對照細胞相比，CVB3感染HeLa細胞3 h和6 h后，siRNA增加數(shù)目分別為 1 846、1 154，降低數(shù)目分別為831和 1 009，表明siRNA 在CVB3感染HeLa細胞中發(fā)揮了重要作用。病毒感染HeLa細胞6 h相對感染3 h的siRNA增加數(shù)目為978，降低數(shù)目為 1 662。表明CVB3感染后，細胞中各種siRNA表達量隨時間發(fā)生改變。

2.2 CVB3感染引起HeLa細胞中siRNA的改變

采用Bowtie比對軟件識別出已知的siRNA，濾除其中與已知高度同源的序列，以UNAFold二級結構折疊預測全新的siRNA序列。同時對siRNA的表達量進行歸一化處理，去掉在兩樣本歸一化后表達量log2 ratio<1 的siRNA。篩選與CVB3感染相關的siRNA，對測序樣本中全新siRNA 的表達進行差異分析。相對正常細胞，病毒感染3 h、6 h后，HeLa細胞中發(fā)生變化的siRNA分別為14種和5種。

與正常細胞相比，病毒感染3 h的HeLa細胞中siRNA表達有變化的為novel_sir4680、novel_sir1648、novel_sir3502、novel_sir2806、novel_sir1897、novel_sir509、novel_sir1383、novel_sir1962、novel_sir2353、novel_sir4290、novel_sir2764、novel_sir3623、novel_sir1973和novel_sir2914，其中novel_sir2914表達下調(diào)，其余均升高(表1)。

表1 CVB3感染3 h后細胞中siRNA的表達變化

Tab.1 The change of siRNA after 3 h of CVB3 infection

siRNA idLog2 ratioRegulationnovel_sir46805.08746284Upnovel_sir16484.4429435Upnovel_sir35024.04439412Upnovel_sir28063.9248125Upnovel_sir18973.87651695Upnovel_sir5093.25738784Upnovel_sir13833.24792751Upnovel_sir19622.67807191Upnovel_sir23532.34146828Upnovel_sir42901.66337539Upnovel_sir27641.62803122Upnovel_sir36231.43888424Upnovel_sir19731.16528461Upnovel_sir2914-1.9558002Down

Log2 ratio：CVB3-HeLa_3h_RNA/HeLa RNA.

與正常細胞相比，病毒感染6 h后 HeLa細胞中siRNA表達發(fā)生變化的有novel_sir1399、novel_sir3502、novel_sir2806、novel_sir2627、novel_sir3115，其中novel_sir3115表達下調(diào)，其余均升高(表2)。

相對正常細胞，高通量測序結果顯示，在病毒感染3 h和6 h的 HeLa細胞中novel_sir3502和novel_sir2806均發(fā)生了改變(圖1)。

表2 CVB3感染6 h后細胞中siRNA的表達變化

Tab.2 The change of siRNA after 6 h of CVB3 infection

siRNA idLog2 ratioRegulationnovel_sir13993.594946589Upnovel_sir35023.448460501Upnovel_sir28063.426264755Upnovel_sir26272.906890596Upnovel_sir3125-1.825426495Down

Log2 ratio：CVB3-HeLa_6h_RNA/HeLa RNA.

圖1 CVB3感染3 h和6 h后 novel_sir3502、novel_sir2806的表達水平

Fig.1 The expression of novel_sir3502, novel_sir2806 after 3 h, 6 h of CVB3 infection

2.3 CVB3感染HeLa細胞引起novel_sir3502和novel_sir2806表達升高

為了進一步驗證高通量測序結果，我們對novel_sir3502和novel_sir2806兩種siRNA通過莖-環(huán)結構設計引物進行驗證，熒光定量RT-PCR結果發(fā)現(xiàn)CVB3感染HeLa細胞的確引起了兩種siRNA的升高，相對于正常HeLa細胞，CVB3感染HeLa細胞3 h和6 h后，novel_sir3502和novel_sir2806表達量的增長倍數(shù)分別為1.6，1.52；1.77和1.65，均高于1.5倍(圖2)，雖然升高量稍微低于測序結果。結果表明CVB3感染HeLa細胞誘導兩種新siRNA的升高。

n=3.

圖2 CVB3感染后3 h和6 h細胞中novel_sir3502、 novel_sir2806相對表達量

Fig.2 The relative expression of novel_sir3502, novel_sir2806 after 3 h, 6 h of CVB3 infection

2.4 novel_sir3502和novel_sir2806可識別核糖體前體RNA

為了解novel_sir3502和novel_sir2806調(diào)控細胞作用，將novel_sir3502和novel_sir2806通過美國國立生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)進行序列比對，發(fā)現(xiàn)這兩種siRNA與核糖體RNA序列均有同源序列，均識別45S核糖體前體RNA N1、N3、N4、N5和28S核糖體前體RNA N1、N2、N3、N4、N5。(圖3、圖4)。因此，CVB3感染誘導的兩種新siRNA可能在結合核糖體RNA后干擾核糖體成熟。

圖3 novel_sir3502通過NCBI進行的序列比對

Fig.3 The sequence alignment of novel_sir3502 using BLAST

圖4 novel_sir2806通過NCBI進行的序列比對

Fig.4 The sequence alignment of novel_sir2806 using BLAST

3 討論

內(nèi)源性siRNA在基因調(diào)控通路中發(fā)揮關鍵作用，它們來源于雙鏈固有轉錄物，引導AGO效應蛋白互補性靶向核酸[19-20]。Dicer屬于核糖核酸酶Ⅲ(RNase Ⅲ)家族，能夠裂解病毒的dsRNA分子，產(chǎn)生20～24 nt長的vsiRNA分子。隨后，vsiRNA被RISC中AGO家族蛋白識別。在RISC中，只有1條被稱為導向鏈的保留下來，以針對病毒基因組中的互補序列。目標序列與siRNA完美互補，導致病毒基因組由AGO切割。在秀麗隱桿線蟲中，內(nèi)源性siRNA參與基因組保護和基因調(diào)控[21]。果蠅黑腹內(nèi)siRNA在特定的Dicer和Argonaute蛋白家族成員幫助下產(chǎn)生，在轉座子控制和病毒感染保護中起重要作用[22]。脊椎動物內(nèi)siRNA的生物學功能包括抑制轉座因子、阻止染色質組成及在轉錄和轉錄后水平調(diào)控基因[6, 19, 23]。

與其他小RNA相比，對內(nèi)源性siRNA的研究還不夠深入。內(nèi)源性siRNA來源于由Dicer切割處理的完全互補的內(nèi)源性RNA前體[24]。由此產(chǎn)生的siRNA與一種特定的前體蛋白結合，最終確定了復合物的生物學影響。內(nèi)源性siRNA的合成機制以及生物學作用顯示出物種特異性差異。內(nèi)源性siRNA可抑制轉錄后的基因表達，影響特定基因位點的轉錄和染色體結構。因此，內(nèi)源性siRNA通過在轉錄和轉錄后水平調(diào)控靶基因表達，在許多生物學過程中發(fā)揮重要作用，如保護外來病原體、抑制轉座因子和染色質組成[19, 25]。

目前，對于siRNA調(diào)控基因表達的研究還在不斷摸索中，其調(diào)控模型也在不斷完善。同時，小分子RNA的研究也存在很多問題，雖然小分子RNA的種類在增加，但其功能并不是十分清楚。RNA干擾技術已被迅速而廣泛地應用到基因功能、基因表達調(diào)控等熱門研究領域，但在應用方面仍存在著許多疑難問題[26-27]。

本研究發(fā)現(xiàn)CVB3感染細胞后，siRNA的表達出現(xiàn)變化。將持續(xù)表達的novel_sir3502、 novel_sir2806與核糖體前體RNA進行同源序列比對分析，結果顯示存在互補位點，可以識別45S核糖體前體RNA N1、N3、N4、N5和28S核糖體前體RNA N1、N2、N3、N4、N5。真核細胞核糖體的大小亞基是在核中形成的，在核仁部位rDNA經(jīng)RNA聚合酶Ⅰ轉錄出45S rRNA(纖維部的纖維狀物質)，是rRNA的前體分子，與胞質運來的蛋白質結合，形成RNP復合體。45S rRNA甲基化后，經(jīng)RNA酶裂解為2個分子：18S rRNA和32S rRNA；后者再裂解為28S rRNA和5.8S rRNA。成熟的rRNA僅為45S rRNA的一半，因此，這兩種內(nèi)源性siRNA可能對于HeLa細胞的核糖體成熟具有一定的作用，提示CVB3感染可能干擾核糖體成熟。本文對siRNA的研究，時間周期較短，未對CVB3感染后siRNA發(fā)生變化的機制及對細胞或病毒復制的影響做進一步的探討研究。在后續(xù)實驗中我們將采用MOI=1的病毒感染細胞，觀察感染6 h、12 h等多個時間點的siRNA變化，探討siRNA隨著感染時間不同而產(chǎn)生的變化，并進一步研究CVB3感染對siRNA表達的影響及其作用機制和是否通過siRNA影響病毒復制等。