馬銀麗 蔣銀 楊丹

[摘要] 目的 研究臨床老年尿毒癥患者分離的尿道致病性大腸埃希菌（UPEC）的毒力基因分布情況及耐藥特征，為老年尿毒癥患者UPEC尿路感染的治療提供臨床研究資料。 方法 采用法國(guó)梅里埃生物VitekⅡ系統(tǒng)鑒定2016年1月～2019年1月我院非植入導(dǎo)尿管老年尿毒癥患者所分離117株UPEC，并行藥敏試驗(yàn)，根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果分為對(duì)照組52株，多重耐藥組65株。多重PCR檢測(cè)兩組菌株粘附因子、鐵載體相關(guān)因子、保護(hù)性物質(zhì)及毒素等毒力基因分布情況。 結(jié)果 美羅培南、亞胺培南、阿米卡星、呋喃妥因?qū)Υ竽c埃希菌均較為敏感;對(duì)照組及多重耐藥組中fimH、feoB檢出較高均在70%以上，經(jīng)χ2檢驗(yàn)分析，對(duì)照組與多重耐藥組毒力基因sfa、afa、iha有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。 結(jié)論 sfa、afa、iha均為粘附因子家族基因，可能與大腸埃希菌的耐藥有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 老年尿毒癥;尿道致病性大腸埃希菌;毒力基因;耐藥;粘附素

[中圖分類號(hào)] R691.3? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2020）06-0104-04

[Abstract] Objective To study the distribution of virulence genes and drug resistance characteristics of urethral pathogenic Escherichia coli （UPEC） isolated from clinical elderly uremia patients， and to provide clinical research data for the treatment of UPEC urinary tract infections in elderly patients with uremia. Methods The French Merrier Biotek Ⅱ system was used to identify 117 UPECs isolated from elderly uremia patients with non-implantable urinary catheters in our hospital from January 2016 to January 2019. Parallel sensitivity testing was performed. According to the drug sensitivity test results， they were divided into 52 strains in the control group and 65 strains in the multi-drug resistance group. Multiplex PCR was used to detect the distribution of virulence genes such as adhesion factors， iron carrier-related factors， protective substances and virulence gene in two groups. Results Meropenem，imipenem，amikacin，and furantoin were more sensitive to Escherichia coli. In the control group and the multi-drug resistance group， the detection of fimH and feoB was higher than 70%. Chi-square test analysis showed that the virulence genes sfa， afa， and iha in the control group and the multidrug resistance group were statistically different（P<0.05）. Conclusion Sfa， afa， and iha are genes of adhesion factor family that may be related to drug resistance of Escherichia coli.

[Key words] Senile uremia; Urethral pathogenic Escherichia coli; Virulence gene; Drug resistance; Adhesion

在感染性疾病中，尿路感染（Urinary tract infections，UTIS）的發(fā)病率僅次于呼吸道感染，一直居高不下[1]。老年尿毒癥患者因長(zhǎng)期接受各種腎替代治療，自身免疫力低下，為感染發(fā)生的高危人群。尿路感染在老年尿毒癥患者較為常見(jiàn)。臨床研究發(fā)現(xiàn)[2]，尿道致病性大腸埃希菌（Uropathogenic ecoli，UPEC）為泌尿系感染分離的最主要病原菌，尿道致病性大腸埃希菌毒力因子的存在與毒力的強(qiáng)弱也決定了所致疾病的嚴(yán)重程度。其中尿道致病性大腸埃希菌毒力因子中的菌毛及粘附素在泌尿系感染細(xì)菌粘附定植中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用。目前，對(duì)UPEC毒力因子基因分布研究為泌尿系感染研究的熱點(diǎn)課題。本研究主要探討在老年尿毒癥患者分離的不同耐藥程度尿道致病性大腸埃希菌的毒力基因分布情況以及耐藥與細(xì)菌粘附功能關(guān)系，為老年尿毒癥患者尿道致病性大腸埃希菌尿路感染的治療提供臨床研究資料，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 菌株來(lái)源

菌株來(lái)源于2016年1月～2019年1月我院非植入導(dǎo)尿管老年尿毒癥患者所分離117株大腸埃希菌，門診患者分離26株，住院患者分離91株，同一患者同類標(biāo)本同一時(shí)期分離到的同種菌株不重復(fù)計(jì)入。同時(shí)患者尿常規(guī)滿足每高倍鏡白細(xì)胞>5個(gè)，尿培養(yǎng)菌落計(jì)數(shù)>105 CFU/mL。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng)鑒定藥敏? 取受試者中段尿接種于中國(guó)藍(lán)瓊脂平板及羊血瓊脂平板（上海祥和科學(xué)技術(shù)有限公司產(chǎn)品）行37℃細(xì)菌培養(yǎng)24 h，采用法國(guó)梅里埃生物VitekⅡ系統(tǒng)對(duì)菌株進(jìn)行鑒定，配套革蘭陰性桿菌藥敏卡進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果判讀參照2016年美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）標(biāo)準(zhǔn)[3]。質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌株：大腸埃希菌ATCC25922，并根據(jù)藥敏結(jié)果將117株大腸埃希菌分為對(duì)照組52株，多重耐藥組65株，分組依據(jù)：耐藥組對(duì)3類或3類以上抗生素耐藥，其他設(shè)為對(duì)照組。

1.2.2 PCR法檢測(cè)UPEC毒力基因? 采用煮沸法提取UPEC DNA，試驗(yàn)菌株接種于5 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯，37℃培養(yǎng)6 h，10 000 rpm離心棄上清，加1 mL生理鹽水震蕩10 000 rpm離心其上清，于沉淀加100 μL蒸餾水震蕩后置于100℃水浴10 min，10 000 rpm離心5 min，上清即為擴(kuò)增模板DNA。引物設(shè)計(jì)及合成由華大基因生物有限公司完成，反應(yīng)體系50 μL，包括10×PCR buffer 5.0 μL、Tap酶聚合酶0.5 μL、2.5 mmol/L dNTP mixture2.5 μL、上游引物、下游引物各1 μL、ddH2O 34.0 μL、DNA模板2.0 μL。見(jiàn)表1。

擴(kuò)增條件：預(yù)變性95℃ 12 min→變性94℃ 30 s→退火63℃ 30 s→延伸68℃ 3 min，共25循環(huán)，產(chǎn)物分析采用含0.5 μg/mL的溴乙錠的2%的瓊脂糖凝膠電泳法，采用凝膠成像系統(tǒng)紫外線下觀察結(jié)果，以與陽(yáng)性對(duì)照分子相等位置的目的條帶為陽(yáng)性，結(jié)果經(jīng)重復(fù)實(shí)驗(yàn)確證。

1.3 觀察指標(biāo)

納入監(jiān)測(cè)抗生素種類：氨芐西林、哌拉西林、頭孢他啶、頭孢呋辛、頭孢噻肟、頭孢曲松、氨曲南、美羅培南、亞胺培南、左氧氟沙星、阿米卡星、復(fù)方磺胺甲噁唑、四環(huán)素、呋喃妥因。

尿道致病性大腸埃希菌含多種毒力基因，納入研究毒力基因種類包括：A：粘附因子類基因：Ⅰ型菌毛（fim H）、P菌毛（papG）、S菌毛（sfa）、FIC菌毛（focG）Dr粘附素（afa）、其他粘附因子（iha）。B：鐵載體相關(guān)基因feoB、fyuA、irp-2、iro N、iutA、sitA。C：保護(hù)類物質(zhì)及毒素：cnf-1、hlyD. ksp MT。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS22.0對(duì)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，敏感組及耐藥組毒力基因檢出率比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)照組與多重耐藥組的藥敏情況

美羅培南、亞胺培南、阿米卡星、呋喃妥因?qū)Υ竽c埃希菌均較為敏感，對(duì)照組與多重耐藥組的耐藥情況詳見(jiàn)表1。經(jīng)χ2檢驗(yàn)分析對(duì)照組與多重耐藥組在氨芐西林、哌拉西林、頭孢他啶、頭孢呋辛、頭孢噻肟、頭孢曲松、氨曲南、美羅培南、左氧氟沙星、復(fù)方磺胺甲噁唑、四環(huán)素耐藥率均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。見(jiàn)表2。

2.2 對(duì)照組與多重耐藥組毒力基因分布比較

對(duì)照組及多重耐藥組中fim H、feoB檢出較高均在70%以上，經(jīng)χ2檢驗(yàn)分析，對(duì)照組與多重耐藥組毒力基因sfa、afa、iha有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。見(jiàn)表3。

3 討論

隨著我國(guó)進(jìn)入老年化社會(huì)，尿毒癥的發(fā)病率日益增多[4]，多種因素引起的免疫力下降導(dǎo)致尿毒癥患者成為感染易發(fā)的高危人群[5]。尿路感染可激增患者原發(fā)疾病的嚴(yán)重程度，造成患者預(yù)后不良。尿路感染的預(yù)防及控制對(duì)于老年尿毒癥的臨床療效以及生活質(zhì)量的提高具有重要的臨床意義。本研究樣本均來(lái)源于老年尿毒癥患者的中段尿培養(yǎng)，據(jù)研究報(bào)道[6]：臨床50%～95%的無(wú)癥狀尿路感染均由尿道致病性大腸埃希菌所引起，其中上行性感染及胞內(nèi)感染（細(xì)菌侵入尿道上皮增殖形成胞內(nèi)細(xì)菌群落并在特定條件下形成的感染）為大腸埃希菌發(fā)生泌尿系感染的主要途徑[7]，評(píng)價(jià)細(xì)菌的致病能力強(qiáng)弱的指標(biāo)為細(xì)菌毒力[8]。其主要包括細(xì)菌侵襲力與細(xì)菌毒素，諸如細(xì)菌的粘附結(jié)構(gòu)纖毛、外膜、水解酶、及毒性代謝產(chǎn)物脂多糖、蛋白等均與細(xì)菌毒力強(qiáng)弱相關(guān)。大腸埃希菌包含眾多的毒力因子，有臨床研究顯示[9]：部分毒力因子基因與細(xì)菌的耐藥性關(guān)系密切。大腸埃希菌毒力因子基因攜帶的檢測(cè)對(duì)于臨床診斷、抗生素的選擇以及預(yù)后評(píng)估均有重要的臨床意義。

本研究以細(xì)菌的耐藥性為分組依據(jù)，數(shù)據(jù)顯示：多重耐藥組大腸埃希菌僅對(duì)美羅培南、亞胺培南、阿米卡星以及呋喃妥因敏感，而對(duì)臨床大腸埃希菌所致尿路感染的傳統(tǒng)用藥頭孢類、喹諾酮類抗菌藥物耐藥情況均較為嚴(yán)重，多數(shù)耐藥率均超過(guò)70%。尿道致病性大腸埃希菌有一系列特異性的毒力因子，毒力基因攜帶的不同與細(xì)菌導(dǎo)致疾病的嚴(yán)重程度以及耐藥情況關(guān)系密切[10-11]。feoB、fim H、irp-2、iutA、sitA在本項(xiàng)研究中的檢出率較高，均超過(guò)60%。fim H為Ⅰ型菌毛的粘附蛋白，其特異性受體可定植于尿路上皮細(xì)胞，尤其膀胱上皮，研究人員推測(cè)其與膀胱炎的發(fā)病有關(guān)[12]。而papG為P型菌毛的粘附蛋白，分布于腎小管、集合管上皮細(xì)胞，研究證明與急性腎盂腎炎關(guān)系密切[13]。Sfa、afa、iha均為粘附因子家族基因，有研究人員認(rèn)為[14-16]：泌尿系感染的遷延難愈及反復(fù)感染與粘附因子家族關(guān)系密切，粘附因子作為大腸埃希菌最強(qiáng)的毒力因子近年引起了臨床研究者的廣泛關(guān)注，粘附因子介導(dǎo)大腸埃希菌在尿路定植，并幫助細(xì)菌形成細(xì)菌庫(kù)逃避機(jī)體的免疫攻擊及抗菌藥物的殺菌作用[17]。本研究數(shù)據(jù)顯示：Sfa、afa、iha的檢出率在對(duì)照組與多重耐藥組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，數(shù)據(jù)說(shuō)明，Sfa、afa、iha與大腸埃希菌的多重耐藥有關(guān)。攜帶Sfa、afa、iha基因的菌株，其編碼的粘附蛋白及侵襲蛋白可識(shí)別特異性受體對(duì)宿主進(jìn)行粘附、侵入，增強(qiáng)菌株對(duì)藥物的耐藥性以及對(duì)宿主免疫攻擊的抵抗力[18]。其具體的耐藥機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。國(guó)外有研究認(rèn)為[19]：afa基因與復(fù)發(fā)性尿路感染有關(guān)。feoB、fyuA、irp-2、iro N、iutA、sitA為鐵攝取系統(tǒng)獨(dú)立基因，其在對(duì)照組與多重耐藥組的檢出率并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，fyuA位于HPI核心功能區(qū)邊緣，在細(xì)菌水平轉(zhuǎn)移過(guò)程中易發(fā)生突變[20]。

綜上所述，尿毒癥患者為感染的高發(fā)人群，尤其多見(jiàn)于尿路感染，尿道致病性大腸埃希菌也是引起感染的主要菌株，其毒力基因與菌株的致病性相關(guān)，Sfa、afa、iha均為粘附因子家族基因可能大腸埃希菌的耐藥有關(guān)，研究毒力基因?qū)δ蚨景Y患者尿道致病性大腸埃希菌感染的防治有重要的臨床意義。

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（收稿日期：2019-10-29）