牛志剛,王 珊,常 璐,史洪才

(新疆畜牧科學(xué)院 生物技術(shù)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部 草食家畜繁育生物技術(shù)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室,新疆 烏魯木齊 830026)

多浪羊是新疆一個(gè)以肉用為主、肉脂兼用型地方綿羊品種,主要分布在新疆南部地區(qū)的葉爾羌河流域、塔里木盆地西南邊緣地區(qū)。多浪羊具有體型高大、生長(zhǎng)發(fā)育快、早熟、產(chǎn)肉和繁殖率高、適應(yīng)性強(qiáng)、遺傳性穩(wěn)定、飼料報(bào)酬高等特點(diǎn)。多浪羊母羊四季均可發(fā)情,以4～5月和9～11月發(fā)情較多,發(fā)情周期18 d,發(fā)情持續(xù)期24～48 h,妊娠期150 d,平均產(chǎn)羔率130%左右。多浪羊是新疆南疆地區(qū)非常優(yōu)良的肉羊品種,因此提高多浪羊的繁殖性能對(duì)新疆南疆畜牧業(yè)發(fā)展具有重大意義。陳曉軍等[1]、鐘發(fā)剛等[2]、史洪才等[3]對(duì)多浪羊的FecB基因進(jìn)行了多態(tài)性分析,發(fā)現(xiàn)新疆多浪羊存在兩種基因型(B+、++ ),其中B+型在多浪羊體內(nèi)為優(yōu)勢(shì)基因型,說(shuō)明多浪羊的多胎性能與FecB基因密切相關(guān)。本課題組近年來(lái)利用FecB基因分子標(biāo)記輔助育種培育多浪羊多羔新品系,已取得了顯著的效果,多羔育種核心群的平均產(chǎn)羔率達(dá)到149%。在此基礎(chǔ)上,本課題組利用全基因組重測(cè)序技術(shù),通過(guò)比較產(chǎn)單羔組與產(chǎn)雙羔組的差異,挖掘了影響多浪羊繁殖性狀的相關(guān)基因和分子標(biāo)記,最終富集分析篩選了NCOA1、INHBA、ACP1、ING5、ARNT、KLHL1等一些候選基因。

核受體輔激活因子1(Nuclear receptor coactivator 1, NCOA1),又被命名為類固醇受體輔活化因子-1(steroid receptor coactivator-1, SRC-1),屬于對(duì)配體有依賴性的轉(zhuǎn)錄因子,是p160類固醇受體輔助活化因子家族成員中的一員[4]。Razeto A等[5]提出了NCOA1是生殖激素“開(kāi)關(guān)”的觀點(diǎn),認(rèn)為生殖激素長(zhǎng)時(shí)間打開(kāi)是導(dǎo)致哺乳動(dòng)物繁殖性能增加的原因。NCOA1蛋白的作用是通過(guò)與結(jié)合到DNA上的核受體相互作用來(lái)增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性,NCOA1 蛋白可以調(diào)節(jié)與繁殖性狀有關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄,從而影響這些基因的表達(dá),進(jìn)而影響哺乳動(dòng)物的繁殖性能。NCOA1基因和NCOA3基因協(xié)同作用可以調(diào)節(jié)胎盤的形態(tài)以及胚胎的存活率[6]。NCOA1基因在不同組織(下丘腦、垂體、卵巢和子宮)中均有表達(dá),并且對(duì)妊娠期起到重要的調(diào)節(jié)作用[7]。我們以新疆多浪羊?yàn)檠芯繉?duì)象,對(duì)NCOA1基因的1個(gè)內(nèi)顯子和1個(gè)外顯子序列進(jìn)行克隆,分析了Ncoa1基因不同基因型SNP位點(diǎn)的多態(tài)性,以期探討NCOA1基因與多浪羊產(chǎn)羔性狀的相關(guān)性,為多浪羊多胎新品系的選育奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

在新疆喀什麥蓋提縣的多浪羊養(yǎng)殖場(chǎng)采集產(chǎn)單羔母羊(112只),以及產(chǎn)雙羔和三羔母羊(56只)；從頸靜脈采血,所采血樣量均為5 mL/只,用肝素鈉抗凝,于-20 ℃凍存。

1.2 主要試劑

TaqDNA聚合酶、dNTP購(gòu)于北京天根生物技術(shù)有限公司,限制性內(nèi)切酶AluⅠ、DNA Marker等購(gòu)自BBI公司。

1.3 DNA的提取

用北京全式金生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的Easy Pure Blood Genomic DNA Kit試劑盒提取DNA。

1.4 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank上公布的綿羊NCOA1基因序列(登陸號(hào)為NC-019460.2),利用引物設(shè)計(jì)軟件Pimer 6.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì),對(duì)NCOA1基因的1個(gè)外顯子、1個(gè)內(nèi)含子設(shè)計(jì)2對(duì)引物,引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成,引物信息見(jiàn)表1。

表1 設(shè)計(jì)的引物信息

1.5 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測(cè)

利用設(shè)計(jì)的引物對(duì)多浪羊的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為50 μL:2 ×Buffer(含Mg2+2.5 U/μL)25 μL、上下游引物各1.0 μL、50 ng/μL的DNA 2 μL、2.5 mmol/L dNTPs 4 μL、TaqDNA聚合酶1 μL，用滅菌雙蒸水補(bǔ)至50 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,62～55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸7 min;4 ℃保存。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。將上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收后,送至上海生工生物有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.6 數(shù)據(jù)分析

用DNAStar軟件對(duì)NCOA1基因外顯子的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列比對(duì)和分析,計(jì)算NCOA1基因的SNP位點(diǎn)在新疆多浪羊群體中的等位基因頻率、雜合度(heterozygosity, He)、有效等位基因數(shù)(number of effective allele, Ne)、群體遺傳純合度(homozygosity, Ho)、多態(tài)信息含量(polymorphism information content, PIC)和基因型頻率;用SPSS 19.0軟件中的最小二乘法分析個(gè)體不同基因型與多浪羊產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)效應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 NCOA1基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

對(duì)Ncoa12和Ncoa17引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,對(duì)PCR產(chǎn)物分別用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn),擴(kuò)增片段大小與預(yù)期一致,片段長(zhǎng)度分別為461和416 bp,特異性好，且電泳條帶清晰明亮(圖1和圖2),可進(jìn)行下一步檢測(cè)。

2.2 NCOA1基因測(cè)序結(jié)果

對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序,結(jié)果在NCOA1基因序列中內(nèi)含子12發(fā)現(xiàn)了g.166 397 A>C突變位點(diǎn),檢測(cè)到兩種基因型，分別為AA和AB基因型(圖3)。在外顯子17的g.187 501 G>A突變位點(diǎn),檢測(cè)到3種基因型，分別為BB、AB和AA基因型。序列分析結(jié)果(圖4)表明,在外顯子17的g.187 501 G>A突變位點(diǎn)發(fā)生了錯(cuò)義突變,由原編碼的絲氨酸(Ser)改變?yōu)楣弱０匪?Gln)。

圖1 NCOA1基因內(nèi)含子12的PCR擴(kuò)增電泳圖

2.3 基因頻率和基因型頻率

對(duì)NCOA1基因多態(tài)位點(diǎn)的基因頻率、基因型頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果(表2)顯示：在多浪羊群體中,g.166 397 A>C位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)基因型為AA基因型,基因型頻率為0.936；優(yōu)勢(shì)基因?yàn)锳等位基因,基因頻率為0.968。在多浪羊群體中, g.187 501 G>A位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)基因型為BB基因型,基因型頻率為0.500；優(yōu)勢(shì)基因?yàn)锽等位基因,基因頻率為0.643。

圖3 g.166 397 A>C的測(cè)序結(jié)果

圖4 g.187 501 G>A的測(cè)序結(jié)果

2.4 NCOA1基因SNP位點(diǎn)基因座的遺傳多態(tài)性分析

采用軟件進(jìn)行卡方適合性檢驗(yàn)，結(jié)果表明:新疆多浪羊g.166 397 A>C和g.187 501 G>A位點(diǎn)均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài),說(shuō)明多浪羊NCOA1基因突變位點(diǎn)的基因型頻率沒(méi)有受到選擇、突變或遷移等因素的影響。對(duì)多浪羊群體在NCOA1基因的2個(gè)SNP位點(diǎn)的純合度、雜合度、有效等位基因數(shù)以及多態(tài)信息含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)算結(jié)果(表3)表明,多浪羊群體中NCOA1基因的g.166 397 A>C和g.187 501 G>A位點(diǎn)的多態(tài)信息含量分別屬于低度多態(tài)(PIC<0.25)和中度多態(tài)(0.25

2.5 多浪羊群體NCOA1基因的SNP位點(diǎn)與產(chǎn)羔數(shù)的相關(guān)性分析

由表4可知：多浪羊NCOA1基因的g.166 397 A>C突變位點(diǎn)的AA基因型個(gè)體產(chǎn)羔數(shù)顯著高于BB基因型個(gè)體的(P<0.05);多浪羊NCOA1基因的g.187 501 G>A突變位點(diǎn)的BB基因型個(gè)體的產(chǎn)羔數(shù)顯著高于AA和AB基因型個(gè)體的(P<0.05),AA、AB基因型個(gè)體之間差異不顯著。

表2 基因頻率和基因型頻率

表3 多浪羊群體多態(tài)位點(diǎn)的多態(tài)信息含量、純合度、雜合度和等位基因數(shù)

注:PIC>0.50為高度多態(tài)；0.25

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)核受體輔激活蛋白1(NCOA1)基因是影響豬繁殖性狀的一個(gè)候選基因并定位于豬3號(hào)染色體上。人的NCOA1基因總共有183.4 kb,含有22個(gè)外顯子,其cDNA長(zhǎng)度為4721 bp。豬的NCOA1基因總共有97681 bp,含有19個(gè)外顯子,其cDNA長(zhǎng)度為4451 bp。綿羊的NCOA1基因的編碼區(qū)全長(zhǎng)為218477 bp,共有9種可變剪切體,含有21或22個(gè)外顯子。NCOA1蛋白通過(guò)與結(jié)合到DNA上的雌激素受體和雄激素受體相互作用來(lái)增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性,刺激特定的雌激素和雄激素反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄并調(diào)節(jié)隨后的生理反應(yīng),作用于動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育、體內(nèi)微生態(tài)平衡以及繁殖等生理過(guò)程[8-10]?；糇噪p等[11]對(duì)紅眼白水貂的NCOA1基因多態(tài)性及其與繁殖性狀的相關(guān)性進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)在NCOA1基因上存在1個(gè)多態(tài)位點(diǎn),為第6外顯子處g.151 536T>C突變,且AB基因型個(gè)體的總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)均極顯著高于AA基因型個(gè)體的(P<0.01)。胡慧艷等[12]在英系和美系大白豬NCOA1基因多態(tài)位點(diǎn)均檢測(cè)到AA、AB兩種基因型。武子寅等[13]在邵伯雞母系NCOA1多態(tài)性與產(chǎn)蛋性能的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn),該基因在第10外顯子多態(tài)位點(diǎn),AA型的產(chǎn)蛋數(shù)極顯著高于BB型的,且顯著高于AB型的。李濤等[14]對(duì)大白母豬的NCOA1基因進(jìn)行了多態(tài)性與繁殖性能的關(guān)聯(lián)分析,發(fā)現(xiàn)經(jīng)產(chǎn)母豬NCOA1基因中AB型個(gè)體的總產(chǎn)仔數(shù)顯著高于AA型個(gè)體的。李永輝研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)白豬與大白豬均存在3種基因型,且在不同基因型之間總產(chǎn)仔數(shù)與產(chǎn)活仔數(shù)均差異極顯著[15],說(shuō)明NCOA1可能是影響豬產(chǎn)仔數(shù)的一個(gè)候選基因。NCOA1基因是否調(diào)控綿羊的繁殖性能,尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究將NCOA1基因作為影響多浪羊產(chǎn)羔性狀的候選基因,利用PCR直接測(cè)序技術(shù)分析了NCOA1基因的多態(tài)性及其與多浪羊繁殖性狀的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)在NCOA1內(nèi)含子12處的g.166 397 A>C突變位點(diǎn)產(chǎn)生了AA、AB兩種基因型,AA基因型為優(yōu)勢(shì)基因型，且在AA與AB基因型個(gè)體間產(chǎn)羔數(shù)存在顯著差異；在NCOA1外顯子17處的g.187 501 G>A突變位點(diǎn)產(chǎn)生了AA、AB、BB三種基因型,BB基因型為優(yōu)勢(shì)基因型,在該突變點(diǎn)發(fā)生了錯(cuò)義突變,使原編碼的絲氨酸(Ser)改變?yōu)楣弱０匪?Gln)，且在AA與BB基因型、AB與BB基因型個(gè)體間產(chǎn)羔數(shù)均存在顯著差異，說(shuō)明NCOA1基因?qū)Χ嗬搜虍a(chǎn)羔性狀的效應(yīng)是顯著的,表明NCOA1基因可以作為多浪羊產(chǎn)羔性狀的主要候選基因。關(guān)于新疆多浪羊的繁殖性能仍需進(jìn)行深入研究,比如可以將NCOA1基因作為分子遺傳標(biāo)記,對(duì)新疆多浪羊進(jìn)行標(biāo)記輔助選種選配,從而提高多浪羊的繁殖性能，這將對(duì)新疆南疆畜牧業(yè)的發(fā)展具有重大意義。

表4 NCOA1基因SNP位點(diǎn)與多浪羊產(chǎn)羔數(shù)的相關(guān)性

注:在不同基因型之間進(jìn)行比較,數(shù)據(jù)后有任一字母不同者為差異顯著(P<0.05)。