何乾超 林潔潔 高玉廣 張志偉 黃德慶 張元侃 劉永輝 陳 煒

廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023

癲癇是腦部組織神經元異常放電導致中神經系統(tǒng)功能短暫失常的疾病，臨床癥狀以反復發(fā)生抽搐及短暫意識變化為主，是一種常見的神經系統(tǒng)疾病。目前全世界約有五千萬癲癇患者，其中90%的患者在發(fā)展中國家。中國癲癇患病率為4‰～7‰，其中活動性癲癇患病率為4.6‰[1]。許多癲癇患者主要是采取藥物治療控制，但還有高達30%患者反復發(fā)作、病情難控制，嚴重干擾著患者的生活及工作[2]。癲癇神經元高興奮性與癲癇形成過程中的炎性反應和炎癥介質密切相關，尤其是核因子kB(NF-kB)途徑，NF-kB進入細胞核，然后再與相應靶序列接合，控制靶基因的轉錄活性，NF-kB參加炎癥反應、免疫調節(jié)、細胞凋亡等過程，與癲癇密切相關[3]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA能使癲癇患者神經元突觸周圍蛋白質異常表達進而誘導癲癇發(fā)作[4]。miRNA132表達與癲癇的發(fā)生、發(fā)展密切相關，miRNA132上調可提高神經元興奮性，且調節(jié)過表達的miRNA132可減輕癲癇的癇性發(fā)作，但是目前尚缺乏中醫(yī)藥對關鍵因子調控miRNA132的研究[5]。

《黃帝內經》中對“癲癇”的記載，認為癲癇發(fā)作與肝失疏泄，氣機逆亂關系密切，其發(fā)病原因也不離風、火、痰、食，基本的發(fā)病病機為痰涎雍滯、迷閉孔竅，痰在癲癇的發(fā)病中起非常重要的作用。因此，治療上常以化痰解郁，疏肝理氣為治法。柴胡疏肝湯出自《景岳全書》，是疏肝理氣的經典方。柴胡疏肝湯組成由柴胡、香附、白芍、川芎、枳殼、陳皮、甘草組成，功效是疏肝行氣，活血止痛。方中柴胡功善疏肝解郁，使肝木條達，現(xiàn)代藥理研究證實柴胡具有疏肝解郁、鎮(zhèn)痛、消炎、鎮(zhèn)靜等抑制中樞的作用；香附理氣疏肝而止痛，川芎活血行氣以止痛，二藥相合，助柴胡以解肝經之郁滯，并增行氣活血止痛之效，共為臣藥；陳皮、枳殼理氣行滯，芍藥斂陰柔肝，甘草養(yǎng)血柔肝，緩急止痛，調和諸藥，為使藥；諸藥相合，共奏疏肝行氣、活血止痛之功。李華霞[6]等對柴胡疏肝湯治療癲癇進行了系統(tǒng)評價，發(fā)現(xiàn)柴胡疏肝湯加味具有明顯的抗癲癇作用。我們認為癇病的病機與肝的疏泄功能異常關系密切，其風、痰、癖產生均為肝氣失于疏泄、條達的病理變化，提出了“從肝論治”，運用加味柴胡疏肝湯(柴胡 12 g、陳皮 12 g、川芎 9 g、炒枳殼 9 g、芍藥 9 g、香附 9 g、炙甘草 6 g、浙貝母 12 g)治療癲癇。前期的臨床研究發(fā)現(xiàn)，使用柴胡疏肝湯治療能夠明顯減少患者癇性發(fā)作的頻次，改善了患者腦電圖變化，增強治療的效果[7-9]。實驗研究發(fā)現(xiàn)，加味柴胡疏肝湯能夠升高miRNA-204的表達，減少神經元細胞過度自噬，保護神經功能從而達到治療癲癇的作用[10]。柴胡疏肝湯還可以通過調節(jié)外周色氨代謝產物及癲癇小鼠色氨酸代謝通路治療癲癇[11]。柴胡疏肝湯干預不同靶點及信號通路能減少癲癇的發(fā)作次數(shù)，隨著miRNA作為癲癇的生物標志物開始被重視，對miRNA的作用靶點及涉及的信號通路進一步深入探討研究，將研究出更多作用在這些靶點的藥物從而根本上減少及抑制癲癇發(fā)作，減輕癲癇發(fā)作對人體生理病理引起的損傷。本實驗結合前期基礎，運用柴胡疏肝湯對癲癇大鼠模型進行干預治療，觀察柴胡疏肝湯對癲癇大鼠miRNA132的影響，從而探討柴胡疏肝湯治療癲癇與調控miRNA132表達的關系。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 清潔級雄性SD大鼠120只，年齡3～4個月，體重170～210 g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司供應，動物許可證號：SCXK(滬)2012-0002，動物合格證號：2015000536122。所有大鼠在室溫(23～25 ℃)，濕度為45%～55%，光照12 h/d，自由進水進食，經過7d時間的適應后進行試驗。

1.2 藥物、試劑 柴胡疏肝湯由柴胡12 g、陳皮12 g、川芎9 g、炒枳殼9 g、芍藥9 g、香附9 g、炙甘草6 g、浙貝母12 g按比例調配，中藥由廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院提供，中藥制劑室煎煮濃煎至1g/mL，放于4℃冷藏備用?？R西平片(上海福達制藥有限公司)，氯化鋰(批號：310468，國藥集團化學試劑有限公司)，匹羅卡品 (天津金耀氨基酸有限公司)，硫酸阿托品注射液(北京雙鶴藥業(yè)股份有限公司)，地西泮注射液(天津藥業(yè)焦作有限公司)，RNAwait非凍型組織RNA保存液(批號：SR0020，Solarbio)， Trlzol Reagent (批號：184608，Ambion)，SYBR Green qPCR Mix (批號：140321，Monad)，MonScript RTIII all-in-one Mix(批號：RN05004S，Monad)。

1.3 儀器 AR2140電子分析天平(OHAUS)，5417R高速冷離心機(Thermo Multiskan公司)，ABI7600定量PCR儀器(美國LIFE公司)。

1.4 模型制備 造模方法參考Cell Reports雜志報道的以腹腔注射氯化鋰溶液聯(lián)合鹽酸匹羅卡品這種化學點燃方法[12]為主，先對實驗大鼠向腹腔注射氯化鋰溶液127 mg/kg，20 h后再注射匹羅卡品50 mg/kg(處理前30 min先給予硫酸阿托品注射液1 mg/kg以對抗匹羅卡品所致的外周性的膽堿能反應)，匹羅卡品注射后參照Racine分級標準[13]觀察大鼠行為學變化，0級：沒有抽搐發(fā)作；1級：存在有面部痙攣；2級：存在有面部痙攣和規(guī)律性的點頭；3級：存在有面部痙攣和規(guī)律性的點頭、一側前肢陣攣；4級：存在有面部痙攣、規(guī)律性的點頭、雙前肢發(fā)生陣攣、后肢站立；5級：存在有面部痙攣、規(guī)律性的點頭、雙前肢發(fā)生陣攣、后肢站立、跌倒。達到4～5級并進入癲癇持續(xù)狀態(tài)(SE)的大鼠為癲癇誘導成功；沒有發(fā)作或沒有達到 4級的大鼠不納入本研究。如果癲癇狀態(tài)持續(xù)達1 h，則采取注射地西泮10 mg/kg 終止發(fā)作。癲癇持續(xù)狀態(tài)后的大鼠度過急性期24 h后，進入潛伏期(10 d)，在潛伏期，每天采用5%的葡萄糖氯化鈉注射液5 mL注射，2次/d，潛伏期后進入慢性期。癲癇持續(xù)狀態(tài)后，用監(jiān)控視頻系統(tǒng)連續(xù)記錄。每個鼠籠放置八只大鼠，用苦味酸進行記號，檢測時間24 h，觀察時期為慢性期的四周。

1.5 動物分組及給藥 實驗大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分為①癲癇組(n=72)，②假手術組(n=24)，③空白組(n=24)，癲癇組采用上述方法進行造模，空白組無需任何處理，假手術組僅用腹腔注射生理鹽水造模。造模成功后，將72只模型大鼠隨機分為 3 組，分別是模型組、中藥組、西藥組。中藥組給予柴胡疏肝湯水煎劑灌胃給藥，西藥組給予卡馬西平片，其余各組給予同等量的生理鹽水灌胃，以2 mL/100 g 體重灌胃給藥，每日 1 次，灌胃的時間為4 周。

1.6 取材及組織處理 用10%水合氯醛(劑量10mg/kg)，腹腔注射麻醉各組大鼠，然后以仰臥位，將其四肢固定于解剖硬板上，打開胸部，暴露心臟后，將灌注有生理鹽水針頭插入左心室，把右心耳剪掉，與此同時，快速灌注生理鹽水，隨即，進行斷頭取腦，繼續(xù)用生理鹽水沖去殘余血液，在大腦中下三分之一交界處，剝離出雙側海馬組織，與此同時，剝開顳葉皮層，放置于RNA保護液中，再放入-80℃冰箱中保存。

1.7 觀測指標與方法

1.7.1 癇性發(fā)作行為記錄 24 h監(jiān)測大鼠癇性發(fā)作行為改變，參照Racine分級標準(0級：沒有抽搐發(fā)作；1級：存在有面部痙攣；2級：存在有面部痙攣和規(guī)律性的點頭；3級：存在有面部痙攣和規(guī)律性的點頭、一側前肢陣攣；4級：存在有面部痙攣、規(guī)律性的點頭、雙前肢發(fā)生陣攣、后肢站立；5級：存在有面部痙攣、規(guī)律性的點頭、雙前肢發(fā)生陣攣、后肢站立、跌倒)觀察大鼠行為學變化進行評分。

1.7.2 miRNA-132 、NF-kB的 mRNA 的PCR 檢測 提取總 RNA，擴增 mRNA，再逆轉錄為 cDNA，應用 PCR 方法對NF-kB、miRNA-132的 mNRA 水平進行檢測。記錄每個反應管中標本的Ct值，實驗結果采用2-△△CT法進行分析?！鰿T=目的基因CT值-內參基因CT值。

2 結果

2.1 各組癇性發(fā)作情況 由表1可知，空白組和假手術組無癇性發(fā)作，模型組1～4周的癇性發(fā)作級別數(shù)值無變化，西藥組和中藥組的癇性發(fā)作從1～4周逐次減少。第1周，模型組與中藥組的癇性發(fā)作級別數(shù)值無變化(P>0.05)，西藥組的癇性發(fā)作級別數(shù)值低于模型組 (P<0.05)。第2～4周，中藥組的癇性發(fā)作級別數(shù)值均低于模型組(P<0.05)，西藥組的癇性發(fā)作級別數(shù)值均低于中藥組(P<0.05)。

表1 各組大鼠癇性發(fā)作級別數(shù)值比較

注：與同期模型組比較，ΔP<0.05；◆P<0.05，◇P<0.05，●P<0.05；與同期中藥組比較，▽P<0.05，▲P<0.05，▼P<0.05。

2.2 miRNA132、NF-kB的mRNA表達 由表2可知，空白組和假手術組的miRNA132表達無差別(P>0.05)，模型組的miRNA132表達低于假手術組(P<0.05)，中藥組的miRNA132表達高于模型組(P<0.05)，西藥組的miRNA132表達高于中藥組(P<0.05)?？瞻捉M和假手術組的NF-kB表達無差別(P>0.05)，模型組的NF-kB表達高于假手術組(P<0.05)，中藥組的NF-kB表達低于模型組(P<0.05)，西藥組的NF-kB表達低于中藥組(P<0.05)。

表2 各組實驗大鼠miRNA132、NF-kB的mRNA△CT數(shù)值比較

注：與假手術組比，ΔP<0.05、◆P<0.05；與模型組相比，◇P<0.05、▽P<0.05；與中藥組相比，▼P<0.05、●P<0.05。

3 討論

癲癇最早在《黃帝內經》中記載，稱“羊角風”、“羊癇風”等，中醫(yī)歸屬于“癇病”的范疇。癇病的病因病機與肝失疏泄密切聯(lián)系，其風、火、痰的產生均為肝氣失于疏泄、條達的病理變化，“從肝論治”癇病尤為重要。柴胡疏肝湯是疏肝理氣的常用方，在“從肝論治”的理論下運用柴胡疏肝湯治療癲癇，取得了明顯的療效，但是對于柴胡疏肝湯治療癲癇的分子機制上不清楚，故值得我們進一步探究，為臨床上治療癲癇提供理論依據(jù)。

癲癇是神經內科常見的疾病之一，其發(fā)病機制目前尚未清楚，大多數(shù)癲癇患者經過規(guī)范藥物治療后，病情可以得到較好的控制，但仍有少部分患者反復發(fā)作、難以控制。因此，尋找新的治療方式或藥物來更好地改善癲癇患者癥狀，提高治療有效率尤為迫切。miRNA在中樞神經系統(tǒng)中表達較豐富，參與調控基因表達，與癲癇發(fā)生的大腦的神經病理改變有著密切，并且miRNA可以作用于多個靶點來調控多條蛋白通路的基因表達。研究表明，生物體內的細胞中有超過60%的蛋白表達是通過miRNA調控的[14]。以miRNA132作為癲癇基因表達調控的靶點時，在癲癇發(fā)作后，miRNA132可以減少癲癇發(fā)作誘導的神經元壞死[15]。神經元電活性調節(jié)后的miRNA132，在神經元發(fā)育及神經突觸重塑方面中發(fā)揮著重要作用，且癲癇發(fā)作的關鍵原因是神經元電活性興奮異常增高[16]。NF-kB是細胞中較為重要的一種轉錄調節(jié)因子，可調節(jié)免疫及炎癥反應，并且在細胞的生長過程和凋亡反應起著重要的作用，是免疫反應的主要調節(jié)因子[17]。研究證實NF-kB在神經元變性中起著重要的作用，是通過直接作用于神經元本身的基因表達和間接調節(jié)膠質細胞的基因表達來實現(xiàn)[18]。本實驗通過對miRNA132和NF-kB表達進行干預后，探討柴胡疏肝湯是否通過調控miRNA132、NF-kB轉錄因子對神經元電興奮性產生影響，發(fā)現(xiàn)柴胡疏肝湯可以減少癲癇患者癲癇發(fā)作頻率和持續(xù)時間，減輕腦組織的損傷及還可以改善癲癇模型的異常[6-11,19-23]。

實驗結果顯示，癲癇模型建立后，模型組miRNA132表達開始降低，NF-kB表達升高，癇性發(fā)作的次數(shù)增多，miRNA132、NF-kB與癲癇的發(fā)生發(fā)展密切相關，中藥組經過柴胡疏肝湯干預后，癇性發(fā)作的次數(shù)減少，海馬中神經元中檢測出的miRNA132與模型組相比明顯升高，同時NF-kB表達降低，說明柴胡疏肝湯可以通過調控miRNA132來降低神經元興奮性，同時下調NF-kB表達，來減少癲癇的發(fā)作頻率。

綜上所述，柴胡疏肝湯可以上調癲癇大鼠海馬miRNA132表達，減少NF-kB表達，減少癲癇大鼠的癇性發(fā)作，miRNA132、NF-kB是治療癲癇的作用靶點之一，為今后研究治療癲癇的新藥開發(fā)提供實驗依據(jù)。