滋養(yǎng)細(xì)胞不僅是妊娠建立和維持的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是母-胎界面特殊的固有免疫細(xì)胞，多種妊娠疾病均與滋養(yǎng)細(xì)胞功能障礙密切相關(guān)。滋養(yǎng)細(xì)胞的免疫識(shí)別功能使胎盤(pán)形成一個(gè)高效的免疫學(xué)屏障，以抵抗病原微生物子宮內(nèi)感染和垂直傳播[1]。人胎盤(pán)絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)多種固有免疫識(shí)別受體[2～4]，滋養(yǎng)細(xì)胞通過(guò)模式識(shí)別受體（pattern recognition receptor，PRR），識(shí)別病原微生物的脂多糖、磷壁酸、RNA 或DNA等病原體相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular pattern，PAMP），進(jìn)而激活固有免疫應(yīng)答，限制或清除病原感染，同時(shí)誘導(dǎo)高效、特異的適應(yīng)性免疫反應(yīng)，發(fā)揮重要的免疫屏障功能[5，6]。已有研究指出，滋養(yǎng)細(xì)胞可通過(guò)TLR3、TLR7/8、RIG-I 識(shí)別病原微生物釋放的RNA 成分[7，8]，但滋養(yǎng)細(xì)胞能否識(shí)別病原體來(lái)源的雙鏈DNA 尚不明確，其識(shí)別后活化的下游信號(hào)通路與胎盤(pán)免疫學(xué)屏障功能的關(guān)系仍有待闡明。為深入探討胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞在識(shí)別胞內(nèi)雙鏈DNA 和妊娠免疫保護(hù)中的作用，本研究以人滋養(yǎng)細(xì)胞系為研究對(duì)象，探討滋養(yǎng)細(xì)胞中胞內(nèi)雙鏈DNA識(shí)別受體的表達(dá)模式，分析滋養(yǎng)細(xì)胞感受雙鏈DNA 刺激后的免疫應(yīng)答反應(yīng)，為進(jìn)一步探索病原體DNA-滋養(yǎng)細(xì)胞DNA 受體識(shí)別信號(hào)在妊娠免疫保護(hù)中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞系HTR-8/SVneo、人絨毛膜癌細(xì)胞株JEG3、JAR、BeWo（中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院張鍵教授、范秀軍教授饋贈(zèng)）；poly（dA：dT）、轉(zhuǎn)染試劑LyoVec以及Nec-1（Necrostatin-1）、z-VAD-fmk[Z-Val-Ala-Asp（OMe）-fluoromethyl ketone] 和Belnacasan（VX-765）（InvivoGen公司）；Trizol試劑（Sigma公司）；RT-PCR試劑（TakaRa 公司）；RT-PCR 引物（上海生工）。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR 檢測(cè)DNA識(shí)別受體表達(dá) 為明確人胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞胞內(nèi)雙鏈DNA識(shí)別受體的表達(dá)模式，經(jīng)半定量PCR 檢測(cè)分析胞內(nèi)IFI16、AIM2、DHX9、DHX36、KU70、LRRFIP1 和ZBP1/DAI 基因的表達(dá)情況。參照Trizol 試劑說(shuō)明書(shū)提取人滋養(yǎng)細(xì)胞系HTR-8/SVneo、JEG3、JAR、BeWo的總RNA，各取2μg 總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，使用FastStart Universal SYBR Green Master 試劑進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)以GAPDH 作為內(nèi)參，相關(guān)基因和引物序列見(jiàn)表1。

表1 基因和引物序列

1.2.2 雙鏈DNA 刺激介導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞死亡 利用人工合成的不同濃度雙鏈DNA 模擬物poly（dA：dT）刺激人絨毛膜癌細(xì)胞系JEG3，以相同劑量的LyoVec作為對(duì)照，分為6組：空白對(duì)照組、LyoVec 對(duì)照組、1μg/ml poly（dA：dT）處理組、2μg/ml poly（dA：dT）處理組、5μg/ml poly（dA：dT）處理組和10μg/ml poly（dA：dT）處理組；刺激24h 后，結(jié)晶紫染色實(shí)驗(yàn)和MTT 法檢測(cè)JEG3 細(xì)胞活性。為明確雙鏈DNA 誘導(dǎo)的滋養(yǎng)細(xì)胞死亡方式，首先分別利用細(xì)胞凋亡抑制劑z-VAD-fmk（25μM）、細(xì)胞焦亡抑制劑VX-765（10μM）或程序性壞死抑制劑Nec-1（25μM）預(yù)先處理JEG3 細(xì)胞1h，隨后轉(zhuǎn)染5μg/ml的poly（dA：dT）誘導(dǎo)24h 后MTT 法檢測(cè)細(xì)胞存活情況。

1.2.3 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞活性 待檢測(cè)細(xì)胞經(jīng)過(guò)分組后，每孔分別加入20μl MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h 后終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150μl DMSO，充分振蕩10min，以空白對(duì)照孔調(diào)零，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490nm 波長(zhǎng)處測(cè)量各孔的吸光值（OD值）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組內(nèi)比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 滋養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)多種胞內(nèi)雙鏈DNA識(shí)別受體RT-PCR 結(jié)果表明，4 株滋養(yǎng)細(xì)胞系HTR-8/SVneo、JEG3、JAR、BeWo 均可檢測(cè)到IFI16、AIM2、DHX9、DHX36、KU70 和LRRFIP1 mRNA的表達(dá)，但未檢測(cè)到ZBP1/DAI的基因表達(dá)，見(jiàn)圖1。

圖1 滋養(yǎng)細(xì)胞胞內(nèi)雙鏈DNA識(shí)別受體的表達(dá)模式

2.2 胞內(nèi)雙鏈DNA刺激可誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞死亡利用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞存活情況，結(jié)果顯示1μg/ml poly（dA：dT）不影響滋養(yǎng)細(xì)胞的存活；2μg/ml、5μg/ml 和10μg/ml的poly（dA：dT）可顯著促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞死亡，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖2。結(jié)果表明人胎盤(pán)絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞能夠感受胞內(nèi)雙鏈DNA 刺激并介導(dǎo)免疫應(yīng)答反應(yīng)，同時(shí)胞內(nèi)雙鏈DNA 能夠以劑量依賴的方式誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞死亡。

圖2 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞存活情況

2.3 滋養(yǎng)細(xì)胞感受胞內(nèi)雙鏈DNA刺激后介導(dǎo)多種程序性細(xì)胞死亡 結(jié)果顯示，Nec-1 對(duì)poly（dA：dT）誘導(dǎo)的滋養(yǎng)細(xì)胞死亡無(wú)明顯影響（P＞0.05）；z-VADfmk 和VX-765 處理能夠顯著抑制poly（dA：dT）誘導(dǎo)的滋養(yǎng)細(xì)胞死亡，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖3。結(jié)果表明雙鏈DNA 誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡和細(xì)胞焦亡，但不介導(dǎo)程序性壞死。

圖3 poly（dA：dT）聯(lián)合程序性細(xì)胞死亡特異性抑制劑對(duì)JEG3 細(xì)胞的影響

3 討論

在母-胎界面，胎盤(pán)對(duì)病原體感染的固有免疫反應(yīng)是通過(guò)PRRs 識(shí)別病原體源性成分而啟動(dòng)的。不同的病原相關(guān)分子模式被識(shí)別后產(chǎn)生的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，因參與的模式識(shí)別、組織分布和細(xì)胞類(lèi)型不同而產(chǎn)生不同的宿主免疫應(yīng)答[9]。已知胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)TLR1-10 受體[10]、NLRP3[11]、NOD1 和NOD2[12]等多種固有免疫識(shí)別受體，本研究進(jìn)一步明確了滋養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)包括IFI16、AIM2、DHX9、DHX36、KU70 和LRRFIP1 在內(nèi)的多種胞內(nèi)雙鏈DNA識(shí)別受體。機(jī)體被病原體感染后可激活固有免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，從而活化NF-κB 或I型干擾素信號(hào)[13]，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)或促進(jìn)被感染細(xì)胞死亡，以限制或清除病原體感染[14]。本研究證實(shí)了滋養(yǎng)細(xì)胞感受胞內(nèi)雙鏈DNA 刺激后能夠誘導(dǎo)免疫應(yīng)答反應(yīng)，并以劑量依賴的方式誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。

固有免疫系統(tǒng)作為機(jī)體抵御病原微生物入侵的第一道防線，通過(guò)模式識(shí)別受體識(shí)別病原相關(guān)分子模式后，可誘導(dǎo)被感染細(xì)胞發(fā)生程序性死亡，這種主動(dòng)的細(xì)胞死亡被認(rèn)為對(duì)病原體是有害的，是機(jī)體對(duì)病原體感染的一種免疫防御機(jī)制[15]。細(xì)胞凋亡是伴隨Caspase 活化的程序性細(xì)胞死亡，細(xì)胞凋亡時(shí)維持膜的完整性，不會(huì)迅速釋放胞內(nèi)物質(zhì)，細(xì)胞解體前被吞噬細(xì)胞吞噬，通常不引起炎癥反應(yīng)；此外，細(xì)胞凋亡介導(dǎo)的吞噬作用刺激機(jī)體產(chǎn)生白介素10（IL-10）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）以抑制炎癥反應(yīng)，因此一般認(rèn)為細(xì)胞凋亡是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)所需的免疫沉默過(guò)程，對(duì)機(jī)體是有益的。細(xì)胞焦亡通常由炎性小體所介導(dǎo)，模式識(shí)別受體（如NLRP3、AIM2 等）識(shí)別病原相關(guān)分子模式或損傷相關(guān)分子模式后，通過(guò)接頭蛋白ASC（apoptosis-associated speck-like protein contain a CARD）招募半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶酶原（pro-Caspase-1），當(dāng)pro-Caspase-1的局部濃度升高時(shí)，發(fā)生自體剪切，生成具有生物活性的Caspase-1[16，17]。 Caspase-1 可剪切細(xì)胞因子pro-IL-1β和pro-IL-18，使其成熟并釋放到胞外介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為細(xì)胞膜崩解，胞質(zhì)內(nèi)毒素釋放，趨化炎癥細(xì)胞促進(jìn)其釋放細(xì)胞因子，啟動(dòng)宿主免疫反應(yīng)，也是機(jī)體重要的固有免疫反應(yīng)，在抵抗病原感染和內(nèi)源危險(xiǎn)信號(hào)中發(fā)揮重要作用。

程序性壞死是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞死亡方式，受體相互作用蛋白激酶1（RIP1）去除泛素化修飾后，以FADD 作為橋梁與Caspase-8 和RIP3 形成胞內(nèi)多蛋白復(fù)合體，當(dāng)Caspase-8 活化時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡；而當(dāng)Caspase-8 活化障礙時(shí)，RIPK1 和RIPK3 清除障礙并磷酸化，導(dǎo)致壞死體形成增加，從而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生程序性壞死。與細(xì)胞凋亡和焦亡相比，程序性壞死沒(méi)有Caspase 活化，不形成凋亡小體并且呈現(xiàn)壞死樣結(jié)構(gòu)[18]。細(xì)胞程序性壞死導(dǎo)致細(xì)胞膜完整性喪失，釋放的胞內(nèi)物質(zhì)使PRRs對(duì)PAMPs 敏感性升高，促進(jìn)炎癥反應(yīng)和感染性疾病的惡化，顯示出細(xì)胞死亡有害的一面[19]。本研究證實(shí)人工合成的雙鏈DNA 模擬物刺激滋養(yǎng)細(xì)胞系JEG3 后所介導(dǎo)的細(xì)胞死亡，可被Caspase 抑制劑z-VAD-fmk 和Caspase-1 特異性抑制劑部分逆轉(zhuǎn)，但此細(xì)胞死亡方式不受程序性壞死特異性抑制劑Nec-1 影響。Nec-1 作用于RIP1 激酶活性，能特異性地阻斷非Caspase 依賴的細(xì)胞死亡，對(duì)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞焦亡沒(méi)有抑制作用。

綜上所述，滋養(yǎng)細(xì)胞胞內(nèi)表達(dá)多種雙鏈DNA感受器，外界的DNA 刺激滋養(yǎng)細(xì)胞后主要介導(dǎo)的細(xì)胞死亡方式是Caspase 依賴的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞焦亡，并不誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生程序性壞死。子宮內(nèi)感染過(guò)程中病原來(lái)源的雙鏈DNA 可作為病原相關(guān)分子模式被胞內(nèi)雙鏈DNA識(shí)別受體識(shí)別，進(jìn)而激活固有免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，限制或清除病原感染，以抵御病原微生物入侵。因此，深入探討胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞雙鏈DNA識(shí)別的活化機(jī)制，將有助于揭示病原體DNA-滋養(yǎng)細(xì)胞DNA 受體識(shí)別信號(hào)在妊娠免疫保護(hù)中抵抗病原微生物子宮內(nèi)感染和垂直傳播的作用。