陶政宇，付剛，聞建平，張大偉，3

（1天津大學(xué)化工學(xué)院，系統(tǒng)生物工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300072；2中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津300308；3中國科學(xué)院大學(xué)，北京100049）

肌酐是人體代謝的產(chǎn)物，可隨尿液排出到體外。當(dāng)腎臟代謝功能紊亂，肌酐會(huì)于體內(nèi)積聚，進(jìn)而造成慢性腎衰竭[1-2]。對(duì)于檢測和治療，目前研究多是從肌酐酶著手，利用肌酐酶聯(lián)體系進(jìn)行體內(nèi)肌酐含量的測定，又或是通過構(gòu)建低毒菌株來分解體內(nèi)代謝多余肌酐[3]。肌酐酶的市場需求量大，但由于野生菌株產(chǎn)量低、工業(yè)放大困難[4-5]，使肌酐酶的生產(chǎn)成本高，同時(shí)Tang等[6]雖然實(shí)現(xiàn)重組大腸桿菌肌酐酶菌株的構(gòu)建，但其比酶活力不高，并且純化蛋白的方法過于復(fù)雜而導(dǎo)致胞內(nèi)蛋白的回收率過低無法進(jìn)行市場應(yīng)用。因此構(gòu)建一株能夠胞外生產(chǎn)肌酐酶的重組基因工程菌株，既可方便工業(yè)生產(chǎn)和純化肌酐酶，又可以該菌為基礎(chǔ)，進(jìn)而構(gòu)建能夠幫助治療腎衰竭患者的無毒或低毒的重組菌株。

枯草芽孢桿菌是常見的蛋白表達(dá)宿主菌株，與大腸桿菌相比，其具有優(yōu)異的胞外分泌能力，可通過Sec、Tat 經(jīng)典分泌途徑、Holin 孔蛋白以及細(xì)胞泄漏等方式將細(xì)胞內(nèi)的蛋白分泌到胞外培養(yǎng)基中[7-8]。目前已有很多的研究報(bào)道使用枯草芽孢桿菌作為高效生產(chǎn)的工程菌株，Chen等[9]通過啟動(dòng)子篩選成功使α-淀粉酶的表達(dá)量提高2倍，Li等[10]通過啟動(dòng)子優(yōu)化和分子伴侶的應(yīng)用成功將生長因子FGF21在枯草芽孢桿菌中可溶表達(dá)，此外利用細(xì)胞泄漏的方式成功在枯草芽孢桿菌中生產(chǎn)尿苷[11]、核黃素[12]?？莶菅挎邨U菌是國際公認(rèn)的安全菌株，在培養(yǎng)過程中，未有內(nèi)毒素的產(chǎn)生，在很大程度上減輕了工業(yè)發(fā)酵應(yīng)用的額外負(fù)擔(dān)。同時(shí)，作為常用宿主菌株，枯草芽孢桿菌具有良好的發(fā)酵工藝技術(shù)，這為目的產(chǎn)物進(jìn)一步擴(kuò)大生產(chǎn)提供了基礎(chǔ)。本研究成功構(gòu)建了一株基于泄漏表達(dá)的產(chǎn)肌酐酶枯草芽孢桿菌菌株，該菌株即可作為潛在的工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)應(yīng)用菌株，又可根據(jù)工程菌株自身無毒的特性，進(jìn)一步構(gòu)建治療腎衰竭患者的無毒重組菌株，具有良好的應(yīng)用潛力和研究價(jià)值，同時(shí)據(jù)本文作者了解這是首次關(guān)于肌酐酶在枯草芽孢桿菌表達(dá)的研究，為構(gòu)建枯草芽孢桿菌細(xì)胞工廠提供進(jìn)一步的理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌種、質(zhì)粒和引物

菌種、質(zhì)粒及構(gòu)建引物分別列于表1、表2 和表3，引物用Primer5 軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，送蘇州金唯智生物科技有限公司合成，實(shí)驗(yàn)中所有菌株均在37℃，220r/min條件下培養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑

2×Primer STAR Mix DNA 聚合酶購自Takara 公司；一步克隆試劑盒（ClonExpress?Ⅱ）、2×Taq PCR Master Mix和Marker Ⅲ購自于南京諾唯贊生物科技有限公司；蛋白酶抑制劑Cocktail、麥芽糖、彩虹廣譜蛋白Maker、考馬斯亮藍(lán)R250 和肌酐均購自北京索萊寶生物科技有限公司；細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒（DP103-03）購自北京天根生化科技有限公司；柱式PCR 膠回收試劑盒（Gel Extraction Kit，D2500-02） 購自O(shè)MEGA公司；其余試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及驗(yàn)證

以NCBI 中惡臭假單胞桿菌來源的Creatininase（WP_120653449.1）的基因序列為模板，送往金唯智生物科技有限公司進(jìn)行全基因合成和密碼子優(yōu)化。以合成的Cre 基因序列為模板，利用引物Creatininase-F 和Creatininase-R 對(duì)目的基因Cre 進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，驗(yàn)證后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收。pMA5表達(dá)載體同樣使用該手段擴(kuò)增后利用膠回收試劑盒純化回收，將目的片段Cre 與載體pMA5 通過一步克隆試劑盒進(jìn)行拼接，拼接步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。連接后產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E.coli 商業(yè)化感受態(tài)DH5α 中，用含有100μg/mL氨芐西林（Amp）的LB平板進(jìn)行陽性克隆篩選，進(jìn)而完成重組質(zhì)粒pMA5-CR的構(gòu)建。同樣重組表達(dá)質(zhì)粒pMGC也依據(jù)此方法進(jìn)行構(gòu)建。

表1 實(shí)驗(yàn)菌種

表2 實(shí)驗(yàn)中所用質(zhì)粒

1.2.2 重組表達(dá)菌株的構(gòu)建

將測序結(jié)果正確的表達(dá)質(zhì)粒通過Spizizen 鹽化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主B.subtilis 1A751中，通過菌落PCR 驗(yàn)證篩選正確的重組菌株，重組菌株1A751H、1AHC和1AGC均按照文獻(xiàn)中所述方法進(jìn)行構(gòu)建[13]。

1.2.3 基因敲除菌株的構(gòu)建

通過單敲換手段，將Holin 途徑的編碼基因pbsx 和bhlAB 用氯霉素抗性基因（Cmrgene）進(jìn)行代替。以菌株ΔPbsX 為例，構(gòu)建敲除菌株的步驟如下。

①以實(shí)驗(yàn)室保存的Cmrgene為模板，通過引物PbsX-1-F 和PbsX-1-R 進(jìn)行擴(kuò)增，通過膠回收試劑盒進(jìn)行目的產(chǎn)物純化回收，獲得片段1。

②在pbsx 基因上游區(qū)段截取約為1500 bp，至pbsx 基因的5’端為止。通過引物PbsX-2-F 和PbsX-2-R 進(jìn)行擴(kuò)增，隨后利用膠回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物純化回收，獲得片段2。

③通過引物PbsX-3-F 和PbsX-3-R 對(duì)pbsx 基因的下游區(qū)段進(jìn)行擴(kuò)增，約為1500bp（從3’端開始），利用膠回收試劑盒進(jìn)行回收，獲得片段3。

④通過PCR 擴(kuò)增，利用引物PbsX-2-F 和引物PbsX-3-R 將片段1、2、3 融合，獲得PCR 產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)入B.subtilis1A751感受態(tài)中，涂布在氯霉素濃度為12.5μg/mL的固體LB平板上，37℃過夜培養(yǎng)。

⑤挑取單菌落，使用引物PbsX-CR-R和CR-F進(jìn)行菌落PCR 驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的菌株，此為基因敲除株ΔPbsX。

表3 本研究所用引物

另外，通過Spizizen 轉(zhuǎn)化，將表達(dá)質(zhì)粒pMGC轉(zhuǎn)入菌株ΔPbsX，涂布在12.5 μg/mL 氯霉素和50 μg/mL 卡那霉素的固體平板上，過夜培養(yǎng)后進(jìn)行PCR菌落驗(yàn)證，即可獲得過表達(dá)肌酐酶的基因敲除重組菌株ΔPbsX-GC。

按上述同樣的方法獲得ΔBhlAB-GC菌株。

1.2.4 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和SDS-PAGE分析

所有轉(zhuǎn)入表達(dá)質(zhì)粒pMGC的重組菌株均在零時(shí)誘導(dǎo)，誘導(dǎo)物麥芽糖在搖瓶中的終濃度為質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%。搖瓶培養(yǎng)及SDS-PAGE 蛋白樣品制作步驟，根據(jù)參考文獻(xiàn)進(jìn)行操作[13]。1.2.5 肌酐酶的酶活測定用聯(lián)乙酰與α-萘酚反應(yīng)測定肌酸，依據(jù)原理為底物肌酐在肌酐酶作用下水解生成肌酸，碳酸鈉溶液終止反應(yīng)[14]。在弱堿性條件下，α-萘酚被雙乙酰氧化為α-萘醌，α-萘醌與肌酸反應(yīng)生成熒光化合物，可在525nm波長下進(jìn)行吸光值測定。檢測中所用試劑如下：0.3mol/L磷酸鉀緩沖溶液，pH 6.5；0.1mol/L肌酐溶液；4%Na2CO3溶液；2%α-萘酚溶液；1.2g NaOH 和3.2g Na2CO3溶于100mL 雙蒸水；0.05%二乙酰溶液。用酶稀釋液替代酶液，其他步驟相同，所得溶液吸光度為空白吸光度（ΔAb），ΔA= ΔAε- ΔAb。在上述條件下，單位酶活力定義為：每分鐘催化生成1μmol肌酸所需的酶量，計(jì)算公式見式(1)和式(2)。

式中，1.0 為反應(yīng)液總體積，mL；0.1 為酶液體積，mL；10 為反應(yīng)時(shí)間，min；df 為稀釋倍數(shù)；C 為酶濃度，mg/mL；0.0704 為生色基團(tuán)在525nm處的摩爾吸光系數(shù)，cm2/μmol。

1.2.6 肌酐酶最適反應(yīng)pH和溫度的確定

最適溫度的確定：將酶活力測定體系置于不同的反應(yīng)溫度，溫度范圍30～70℃，其反應(yīng)體系pH為6.5，比較各溫度下的肌酐酶活力，得到最適作用溫度。觀測肌酐酶的熱穩(wěn)定性，將酶在溫度范圍從30～70℃的環(huán)境下處理15min，在最適溫度下進(jìn)行酶活力測定，殘留酶活用于評(píng)估溫度對(duì)肌酸酶穩(wěn)定性的影響。

最適pH 的確定：分別在pH=3.0～11.0 的范圍內(nèi)，在不同pH 單位的磷酸鉀緩沖鹽溶液中測定酶活力，以確定最適反應(yīng)pH。觀測酶的pH穩(wěn)定性是將酶液分別存放在不同pH 的緩沖溶液中，常溫保存24h，隨后在最適pH 下測定酶活力，確定酶的pH穩(wěn)定范圍。

1.2.7 胞外重組蛋白純化和Native-PAGE分析

取25mL培養(yǎng)菌液，在4℃、6750g下離心15min，收集離心后的胞外上清液。取1mL Ni-NTA 填料于柱子中，用10 倍柱體積的H2O 和清洗液先后清洗柱子，增強(qiáng)填料的蛋白結(jié)合力。隨后將胞外上清液裝于50mL離心管內(nèi)，加入填料，冰上結(jié)合2～3h。結(jié)合后用清洗液除去雜蛋白，最后加入洗脫液（elution buffer）洗脫目的蛋白，純化結(jié)果通過12%SDS-PAGE 鑒定，重組回收后的目的蛋白使用Bardford法[15]測定蛋白濃度。

Native-PAGE 分析可用于鑒定酶的活性功能結(jié)構(gòu)，其凝膠配制成分與SDS-PAGE類似。所用活性2×樣品液（sample buffer）組成為62.5mmol/L Tris緩沖液、25%甘油和1%溴酚藍(lán)，所用電泳液（running buffer）由25mmol/L Tris和192mmol/L甘氨酸組成。其電泳條件為冰上處理，電壓在100～200V之間。

1.2.8 Calcein-AM/PI染色方法

Calcein-AM 是一種只針對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記的細(xì)胞染色試劑，發(fā)綠色熒光（Ex=490nm，Em=515nm）。碘化丙啶PI 是死細(xì)胞熒光探針，無法穿過活細(xì)胞膜，僅可對(duì)死細(xì)胞著紅色熒光（Ex=535nm，Em=617nm）。二者同時(shí)對(duì)細(xì)胞著色可同時(shí)進(jìn)行活死細(xì)胞標(biāo)記，但當(dāng)細(xì)胞即呈現(xiàn)紅色熒光，又呈現(xiàn)綠色熒光就表明細(xì)胞的細(xì)胞膜出現(xiàn)破損[16]。染色步驟如下。

①使用0.01mol/L磷酸緩沖溶液（PBS）配制濃度為20μmol/L Calcein-AM 溶液和45μmol/L PI 染色液，之后各取10μL加入80μL0.01mol/L磷酸緩沖溶液配制為100μL工作液。

②隨后用0.01mol/L 磷酸緩沖溶液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行稀釋使其密度為1×105～1×106細(xì)胞/mL，取出200μL細(xì)胞懸液加入100μL 染色液，混勻，37℃孵育15min。

③在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，將觀察的圖像進(jìn)行重合得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 肌酐酶在枯草芽孢桿菌中的異源表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)分析

2.1.1 啟動(dòng)子優(yōu)化及重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果分析啟動(dòng)子強(qiáng)度的不同，可以影響目的基因的轉(zhuǎn)錄程度，進(jìn)而影響外源蛋白在宿主菌株中的表達(dá)水平。為得到肌酐酶在枯草芽孢桿菌中合適的轉(zhuǎn)錄水平，通過組內(nèi)已有的蛋白研究，選用麥芽糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Pglv來代替pMA5的組成型啟動(dòng)子PHpaⅡ

[17]，從而構(gòu)建了麥芽糖誘導(dǎo)型表達(dá)質(zhì)粒pMGC。同時(shí)依靠組成型啟動(dòng)子PhpaⅡ的重組肌酐酶表達(dá)質(zhì)粒pMA5-CR也進(jìn)行構(gòu)建。質(zhì)粒pMA5-CR和pMGC的驗(yàn)證結(jié)果見圖1，約在1200bp 和1500bp 處有明亮單一的條帶，與軟件預(yù)測的理論條帶大小一致。將驗(yàn)證正確的菌液接種于試管中培養(yǎng)12～14h，提取質(zhì)粒，送往金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果用SnapGene 軟件進(jìn)行分析比對(duì)，進(jìn)而獲得帶有肌酐酶目的基因的重組表達(dá)質(zhì)粒pMA5-CR和pMGC。

圖1 重組質(zhì)粒pMA5-CR和pMGC的菌落驗(yàn)證

將質(zhì)粒pMA5-CR、pMGC 和pMA5 轉(zhuǎn)入B.subtilis 1A751進(jìn)而構(gòu)建表達(dá)菌株1AHC、1AGC和對(duì)照菌株1A751H，搖瓶培養(yǎng)后的SDS-PAGE 分析結(jié)果見圖2。通過SnapGene軟件分析預(yù)測肌酐酶的理論蛋白分子量為30000，圖2 中，可明顯觀測到菌株1AGC 與1AHC 在30000 處存在條帶，與理論預(yù)測的蛋白分子量大小一致，同時(shí)可明顯觀察到麥芽糖誘導(dǎo)型菌株1AGC的表達(dá)量明顯高于組成型啟動(dòng)子表達(dá)菌株1AHC。此外，從圖2(a)的搖瓶培養(yǎng)結(jié)果可分析出在24h時(shí)肌酐酶主要以胞內(nèi)可溶的形式存在逐步積累在細(xì)胞內(nèi)部。而從圖2(b)的結(jié)果來看，隨培養(yǎng)時(shí)間增加到48h時(shí)，胞外肌酐酶的蛋白量逐漸增加，胞內(nèi)可溶組分減少，這表明肌酐酶在枯草芽孢桿菌中不依賴于信號(hào)肽即可分泌到胞外培養(yǎng)基中。在通過啟動(dòng)子優(yōu)化提高蛋白表達(dá)量的同時(shí)，出現(xiàn)少量錯(cuò)誤折疊的蛋白即包涵體，很大程度是由于部分蛋白折疊中間體錯(cuò)誤聚集形成的，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中可以考慮調(diào)節(jié)啟動(dòng)子強(qiáng)度、降低培養(yǎng)溫度等手段進(jìn)行調(diào)節(jié)。

2.1.2 胞外肌酐酶的酶學(xué)性質(zhì)分析

圖2 重組菌株SDS-PAGE分析

圖3 胞外肌酐酶的純化結(jié)果分析和Native-PAGE活性功能結(jié)構(gòu)分析

圖4 肌酐酶的最適反應(yīng)條件和穩(wěn)定性研究

將肌酐酶重組菌株1AGC的胞外肌酐酶進(jìn)行純化分析，所得純化結(jié)果見圖3(a)，圖中洗脫下的目的蛋白濃度為1.08mg/mL，并測得酶活力為257.04U/mL，比酶活為238U/mg。圖3(b)為Native-PAGE分析結(jié)果，表明胞外肌酐酶的活性功能結(jié)構(gòu)為多聚體，根據(jù)理論單體蛋白分子量為30000，進(jìn)一步推測其為同源四聚體。同時(shí)根據(jù)圖4(a)可得出肌酐酶的最適反應(yīng)pH和溫度分別為8.0和55℃，從圖4(b)的折線圖可分析出肌酐酶在50℃以下可較好維持活性結(jié)構(gòu)，在pH=6.0～8.0 間維持其功能結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。圖5 表明在最適反應(yīng)溫度和pH 下，通過雙倒數(shù)作圖法測得肌酐酶酶促動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km為99.38mmol/L，最大反應(yīng)速 率Vmax為5.9×10-2mmol/(L?s)。進(jìn)而求得每秒鐘每個(gè)酶分子催化的底物分子數(shù)Kcat為655.6s-1，同時(shí)求得特異性常數(shù)Kcat/Km為6.597L/(s?mmol)。使用Brenda獲取來源于惡臭假單胞桿菌的肌酐酶的酶促動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km范圍在26～350mmol/L，而酶的催化效率Kcat/Km的數(shù)值范圍在0.008～17.4L/(s?mmol)，通過比較分析得出，在枯草芽孢桿菌中表達(dá)的重組肌酐酶的底物親和性中等，催化效率較好。將所有數(shù)據(jù)酶參數(shù)綜合分析可得出，該重組肌酐酶具有一定的市場應(yīng)用潛力。

圖5 肌酐酶的雙倒數(shù)曲線

2.1.3 分子伴侶過表達(dá)菌株的SDS-PAGE分析

利用pDL整合型質(zhì)粒，將分子伴侶基因danK、groESL 和prsA 整合到枯草芽孢桿菌1A751 的基因組上，從而完成基因danK、groESL 和prsA 的過表達(dá)。分子伴侶的過表達(dá)可以進(jìn)一步的幫助胞內(nèi)蛋白的可溶性表達(dá)[18]，因此構(gòu)建分子伴侶與肌酐酶共表達(dá)菌株1DGC、1GGC 和1PGC，將菌株進(jìn)行培養(yǎng)與SDS-PAGE 分析，結(jié)果見圖6。以1AGC 菌株結(jié)果作為正對(duì)照，從胞外和可溶組分來看：枯草芽孢桿菌常用分子伴侶DnaK、GroESL和PrsA的過表達(dá)并未能有效提高肌酐酶的胞內(nèi)可溶產(chǎn)量，其蛋白表達(dá)量與對(duì)照菌株基本一致?？莶菅挎邨U菌中常用的分子伴侶應(yīng)用無效很有可能是單一過表達(dá)的局限性造成的，因此后續(xù)研究中可利用多分子伴侶共表達(dá)體系來幫助肌酐酶的折疊和表達(dá)量的提升。此外，分子伴侶強(qiáng)度的調(diào)控同樣可能是影響因素，適中的分子伴侶表達(dá)強(qiáng)度可以更好地來幫助肌酐酶的正確折疊，從而完成蛋白表達(dá)量的提高。

圖6 分子伴侶重組菌株的SDS-PAGE分析

2.2 肌酐酶在枯草芽孢桿菌中分泌機(jī)制的初步探究

2.2.1 經(jīng)典分泌途徑和Holin 蛋白通道的分析與排除

對(duì)于肌酐酶在枯草芽孢桿菌中可不依賴于信號(hào)肽即可完成胞外分泌的現(xiàn)象，本文作者課題組對(duì)其分泌機(jī)制進(jìn)行了初步探究。通常在枯草芽孢桿菌中，大部分的細(xì)胞質(zhì)蛋白主要通過Sec途徑從胞內(nèi)分泌到胞外培養(yǎng)基中，而小部分蛋白則從Tat 途徑分泌到細(xì)胞外。為分析肌酐酶的分泌是否與這兩個(gè)途徑相關(guān)，分別通過過表達(dá)Sec 途徑的關(guān)鍵元件SecY、SecE、SecYEG 和敲除Tat 途徑的編碼基因tatAyCy、tatAdCd 和tatAc 來進(jìn)行驗(yàn)證，使用實(shí)驗(yàn)室保存菌種轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pMGC完成菌株構(gòu)建，進(jìn)而培養(yǎng)評(píng)價(jià)分析，24h 和48h 的SDS-PAGE 結(jié)果見圖7。菌株1AGC作為對(duì)照菌株，從胞內(nèi)外的目的蛋白的表達(dá)量來看，SecY-GC、SecE-GC、SecYEG-GC 以及ΔTat-GC與對(duì)照菌株并無差別，這表明肌酐酶在枯草芽孢桿菌中的分泌可能不依賴于Sec 和Tat 分泌途徑。

圖7 經(jīng)典分泌途徑重組菌株的SDS-PAGE分析

Holin 蛋白途徑是一種不依賴于信號(hào)肽即可將蛋白釋放到胞外的方式，其主要作用的元件是PbsX 和BhlAB，因此通過單交換手段將氯霉素抗性基因替換這兩個(gè)關(guān)鍵元件，構(gòu)建突變菌株ΔPbsX和ΔBhlAB，隨后轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)型表達(dá)質(zhì)粒pMGC，進(jìn)行培養(yǎng)評(píng)價(jià)，SDS-PAGE 結(jié)果見圖8。從圖中觀察可知，與作為對(duì)照菌株的1AGC 相比，Holin 關(guān)鍵元件敲除后的突變菌株所產(chǎn)肌酐酶的胞外分泌量并未受到影響，基本與對(duì)照菌株的胞外分泌量一致，這表明肌酐酶的胞外分泌并不通過Holin蛋白途徑，對(duì)此，可初步猜測肌酐酶主要通過細(xì)胞泄漏的方式從細(xì)胞質(zhì)內(nèi)釋放到胞外培養(yǎng)基中。

2.2.2 表達(dá)菌株1AGC細(xì)胞膜完整性鑒定

若一株菌株出現(xiàn)細(xì)胞泄漏現(xiàn)象，其細(xì)胞膜必定出現(xiàn)破損。通過Calcein-AM/PI 雙染色試劑盒對(duì)表達(dá)菌株1AGC 和對(duì)照菌株1A751H 進(jìn)行著色來鑒定菌株細(xì)胞膜的完整性，染色結(jié)果見圖9。以菌株1A751H作為對(duì)照菌株，從圖中可觀察到，1A751H的雙染色結(jié)果經(jīng)過圖像重疊后，紅綠熒光分明，并未觀察到熒光重疊菌株。而在表達(dá)菌株1AGC 中，紅綠熒光圖像經(jīng)重疊后可明顯觀察到黃色菌株的存在，這表明表達(dá)菌株的細(xì)胞膜出現(xiàn)破損，為細(xì)胞泄漏猜想提供了充分的證據(jù)。

2.2.3 掃描和透射電子顯微鏡觀察

圖9 菌株1A751H和1AGC的染色結(jié)果

為進(jìn)一步地證實(shí)肌酐酶主要通過細(xì)胞泄漏的方式釋放到胞外，采用透射電子顯微鏡（TEM）和掃描電子顯微鏡（SEM）對(duì)肌酐酶表達(dá)菌株進(jìn)行觀察，觀察結(jié)果見圖10。圖10(a)為TEM 觀察結(jié)果，圖中可明顯看到細(xì)胞膜和細(xì)胞壁完整的菌株呈現(xiàn)一種凝視飽滿的狀態(tài)，表現(xiàn)為灰黑色。而當(dāng)細(xì)胞膜和細(xì)胞壁出現(xiàn)破損后，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)物質(zhì)流出，使細(xì)菌呈現(xiàn)一種空洞的狀態(tài)，表現(xiàn)為白色。從圖10(a)可清晰地看到對(duì)照菌株1A751H其大部分菌株的細(xì)胞膜和壁完整，基本不存在泄漏型的空白菌株；而表達(dá)菌株1AGC的群體細(xì)胞圖中，可明顯觀察到存在大量的泄漏型菌株，約占總體的50%。此外，圖10(b)的SEM 觀察結(jié)果也可觀測到潛在的泄漏位點(diǎn)的存在，菌株表面的凹陷處即為泄漏孔洞的形成處，已用白色箭頭指出。因此，綜合經(jīng)典分泌途徑與Holin蛋白通道的分析結(jié)果、細(xì)胞膜染色結(jié)果和電鏡觀察結(jié)果，可得出肌酐酶在枯草芽孢桿菌中的分泌主要是通過細(xì)胞泄漏的方式完成的。對(duì)于此種分泌方式，作者推測是由于高強(qiáng)度啟動(dòng)子的作用使得肌酐酶大量表達(dá)進(jìn)而形成一種表達(dá)壓力，加速細(xì)胞泄漏或裂解進(jìn)程，從而使胞內(nèi)蛋白泄漏出去。而根據(jù)圖2可知，在表達(dá)初期肌酐酶主要是以可溶狀態(tài)積聚在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長，胞內(nèi)蛋白積累量過大形成壓力進(jìn)而加速細(xì)胞裂解，使細(xì)胞膜出現(xiàn)泄漏孔洞，胞內(nèi)蛋白質(zhì)逐漸從泄漏位點(diǎn)逐漸流出。

圖10 肌酐酶表達(dá)菌株的電子顯微鏡觀察結(jié)果

3 結(jié)論

本文主要對(duì)枯草芽孢桿菌進(jìn)行了啟動(dòng)子優(yōu)化，核心蛋白元件的過表達(dá)及敲除，Calcein-AM/PI 雙染色以及電子顯微鏡觀察，構(gòu)建了肌酐酶高效表達(dá)分泌菌株并解析了肌酐酶在枯草芽孢桿菌中的分泌機(jī)制。具體結(jié)論如下。

（1）通過對(duì)肌酐酶基因的密碼子優(yōu)化，成功構(gòu)建肌酐酶表達(dá)菌株1AHC，實(shí)現(xiàn)肌酐酶在枯草芽孢桿菌中的異源表達(dá)。

（2）對(duì)啟動(dòng)子進(jìn)行優(yōu)化，將質(zhì)粒pMA5上的組成型啟動(dòng)子PHpaⅡ更換為麥芽糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Pglv，成功構(gòu)建肌酐酶高產(chǎn)菌株1AGC，使肌酐酶的蛋白表達(dá)量有了顯著提高，并且胞外肌酐酶的酶活可達(dá)257.04U/mL，比酶活為238U/mg，此外通過Native-PAGE 分析出胞外肌酐酶的活性功能結(jié)構(gòu)為多聚體，并用雙倒數(shù)作圖法求得肌酐酶的Km、Vmax、Kcat和Kcat/Km，綜合分析后確定該重組酶具有一定的市場應(yīng)用價(jià)值。

（3）研究了不依賴于信號(hào)肽的肌酐酶在枯草芽孢桿菌中的分泌機(jī)制。通過過表達(dá)Sec途徑的核心蛋白元件SecY、SecE 和SecYEG，敲除Tat 途徑的關(guān)鍵蛋白編碼基因tatAyCy、tatAdCd 和tatAc 以及Holin 蛋白通道的關(guān)鍵元件編碼基因pbsx 和bhlAB，結(jié)果表明肌酐酶在枯草芽孢桿菌中的分泌不依賴于以上途徑。并用熒光染料Calcein-AM/PI 驗(yàn)證表達(dá)菌株1AGC 的細(xì)胞膜存在不同程度的破損。最后，使用透射電鏡和掃描電鏡對(duì)細(xì)菌形態(tài)進(jìn)行觀察，確定肌酐酶在枯草芽孢桿菌中通過細(xì)胞泄漏完成胞外分泌。

（4）相比于傳統(tǒng)肌酐酶的宿主菌株E.coli，本文所構(gòu)建的肌酐酶表達(dá)菌株更有助于工業(yè)生產(chǎn)提純和醫(yī)療應(yīng)用，并且可嘗試通過擴(kuò)大培養(yǎng)來進(jìn)一步提高肌酐酶的表達(dá)產(chǎn)量；又或以菌株1AGC為基礎(chǔ)進(jìn)而加入肌酸水解酶，從而構(gòu)建對(duì)人體無毒害作用的尿毒癥醫(yī)療應(yīng)用菌株。