李文娟 黃 林# 孫善全

（1 成都市第五人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，成都 611130；2 重慶醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)科學(xué)中心，重慶 400016）

星形細(xì)胞瘤是膠質(zhì)瘤的一種，在顱腔內(nèi)呈彌漫性生長，惡性程度高，復(fù)發(fā)率和死亡率居高不下。盡管目前采取最大限度的手術(shù)切除腫瘤組織以及術(shù)后放療和化療技術(shù)的不斷提高，但是惡性星形細(xì)胞瘤患者的預(yù)后仍不容樂觀，其中膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的中位生存期為14～15 個月[1-2]。鈉氫交換體1（Na+/H+exchanger 1，NHE1）存在于真核細(xì)胞中，是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)pH 的重要跨膜轉(zhuǎn)運蛋白[3]。NHE1 以細(xì)胞內(nèi)1 個H+，細(xì)胞外1 個Na+進行等分子比例的跨膜交換，從而排出胞內(nèi)H+[4]。研究表明，實體腫瘤細(xì)胞有堿性的細(xì)胞內(nèi)pH 值和酸性的細(xì)胞外pH 值，細(xì)胞內(nèi)的pH 值明顯高于細(xì)胞間隙，這種細(xì)胞外液的酸性微環(huán)境對腫瘤細(xì)胞的增殖、生長以及浸潤轉(zhuǎn)移有重要的意義，而NHE1 在形成和維持這種酸性微環(huán)境過程中具有重要意義[5]。然而，有關(guān)NHE1 在人星形細(xì)胞瘤中的表達(dá)鮮有報道。為此，本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)和免疫印跡對NHE1 在人星形細(xì)胞瘤中的表達(dá)變化做了初步分析，探討NHE1 在星形細(xì)胞瘤增殖、生長中的作用。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本的采集

所有星形細(xì)胞瘤標(biāo)本及正常腦組織均取自重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科及第三軍醫(yī)大學(xué)附屬大坪醫(yī)院神經(jīng)外科星形細(xì)胞瘤的患者，星形細(xì)胞瘤共計51 例，正常腦組織27 例。所有標(biāo)本自術(shù)中取出后，一部分用于病理檢查，另一部分則置于液氮中迅速冷凍，-80℃保存。經(jīng)病史詢問，證實所有患者術(shù)前均未接受過免疫治療、放療和化療等治療手段。

1.2 主要試劑

小鼠抗人NHE1 單克隆抗體購自Abcam 公司，小鼠抗人GAPDH 單克隆抗體購自Santa Cruz 公司；免疫組織化學(xué)二抗試劑盒及DAB 顯色試劑盒均購自中杉金橋公司。

1.3 免疫組織化學(xué)顯色

將所取瘤周腦組織與各級別星形細(xì)胞瘤的組織經(jīng)4%多聚甲醛固定后，石蠟包埋，連續(xù)切片，厚度為5 μm。常規(guī)脫蠟后行H-E 染色，進行診斷和病理分級；選片進行兩步法免疫組織化學(xué)顯色，NHE1 一抗?jié)舛?∶200，DAB 顯色后用0.01 mol/L PBS終止顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，梯度乙醇脫水、二甲苯透明后封片，顯微鏡觀察并照相。陰性對照用0.01 mol/L的PBS代替一抗，其余步驟不變。采用北航（CM-2000B）生物醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進行圖像分析，測定免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞的積分光密度值（IOD）。

1.4 免疫印跡檢測NHE1 表達(dá)量

細(xì)胞裂解液（碧云天）提取瘤周組織和各級星形細(xì)胞瘤組織樣品總蛋白，SDS-PAGE 凝膠分離蛋白，通過濕轉(zhuǎn)方式將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上，用免疫印跡封閉液于37℃恒溫水浴箱封閉1.5 h，加入NHE1（1∶200）一抗、GAPDH（1∶500）一抗，4℃冰箱過夜孵育，PBST 洗膜后分別加入相應(yīng)二抗，37℃恒溫水浴箱孵育2 h，PBST 洗膜后DAB 試劑盒顯色。用Quantity One 軟件轉(zhuǎn)換后測定灰度值，以GAPDH 為內(nèi)參對照，將NHE1 條帶灰度值分別與其內(nèi)參GAPDH 灰度值的比值作為觀察指標(biāo)，進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS17.0 統(tǒng)計軟件進行處理，計量資料以±s表示，多組均數(shù)比較采用方差分析，其兩兩比較采用LSD 法，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病理診斷及免疫組織化學(xué)顯色

根據(jù)世界衛(wèi)生組織WHO2007 對星形細(xì)胞瘤的病理分級標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果顯示：低級別（WHO Ⅰ-Ⅱ）星形細(xì)胞瘤組織22 例，高級別（WHO Ⅲ-Ⅳ）星形細(xì)胞瘤組織29 例（圖1）。

圖1 星形細(xì)胞瘤病理分級（A1～C1）和NHE1 在對照組及各腫瘤組織中的表達(dá)（A2～C2），×400Fig1 Pathological grading of the astrocytomas（A1-C1）and expression of NHE1 in different tumor tissuesand control groups（A2-C2），×400

2.2 NHE1 陽性表達(dá)細(xì)胞的積分光密度值

對照組中NHE1 主要分布在神經(jīng)元和少量星形細(xì)胞胞膜上。在低級別星形細(xì)胞瘤組織中，NHE1分布在瘤細(xì)胞的胞膜上。在高級別星形細(xì)胞瘤組織中NHE1 強烈表達(dá)在胞質(zhì)和胞膜上（圖1）。圖像分析結(jié)果顯示，對照組積分光密度值為3.19±0.42，低級別腫瘤星形細(xì)胞瘤組為5.04±0.67，高級別星形細(xì)胞瘤組為8.61±0.38。與對照組相比較，腫瘤組織中NHE1 表達(dá)增強（P＜0.05），與低級別星形細(xì)胞瘤比較，高級別星形細(xì)胞瘤組織中NHE1 表達(dá)更強烈，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 NHE1 表達(dá)

免疫印跡結(jié)果顯示，對照組及腫瘤組織中均可見NHE1 條帶，腫瘤組織中MHE1 表達(dá)增高，與對照組相比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），與低級別星形細(xì)胞瘤組織相比，高級別星形細(xì)胞瘤組織中NHE1 表達(dá)明顯增強，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖2）。

圖2 不同級別人星形細(xì)胞瘤組織及對照組中NHE1 的表達(dá)Fig2 Expression of NHE1 in human astrocytoma tissues of various pathological grades and control group

3 討論

NHE 是細(xì)胞膜上一類重要的跨膜轉(zhuǎn)運載體，可將細(xì)胞內(nèi)的H+與Na+以1∶1 的比例進行跨膜轉(zhuǎn)運，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的pH 值，對維持細(xì)胞內(nèi)外的酸堿平衡具有重要的作用[4]。NHE1 是NHE 基因家族中最具特征性結(jié)構(gòu)的亞型，被認(rèn)為是管家基因。NHE1 蛋白質(zhì)在分子結(jié)構(gòu)上具有2 個功能域，即疏水性的N 端和親水性的C 端，N 端位于胞膜上，是介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)外H+和Na+交換的必要條件；C 端位于胞質(zhì)內(nèi)，決定NHE1 進行Na+/H+交換的pH 調(diào)定點，從而決定了胞內(nèi)的pH 水平[6]。

體內(nèi)外研究證實，腫瘤細(xì)胞內(nèi)的pH 值高于細(xì)胞外，即相對于細(xì)胞外，細(xì)胞內(nèi)更趨向于堿化，腫瘤細(xì)胞內(nèi)的堿化能夠有效防止腫瘤細(xì)胞的酸化死亡；同時腫瘤細(xì)胞外的酸性微環(huán)境對腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移具有重要的作用[7-9]。本課題組前期研究結(jié)果顯示，腫瘤細(xì)胞內(nèi)乳酸的轉(zhuǎn)運主要依靠細(xì)胞膜上單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白（MCTs）[10]。盡管MCTs 在轉(zhuǎn)運乳酸的同時能夠以1：1 的比例轉(zhuǎn)運H+，但NHE1 對于細(xì)胞內(nèi)H+的轉(zhuǎn)運具有主導(dǎo)作用，被認(rèn)為是維持腫瘤細(xì)胞內(nèi)堿化和腫瘤微環(huán)境酸化的重要機制之一。一方面，細(xì)胞內(nèi)有關(guān)的代謝酶和與細(xì)胞增殖的有關(guān)機制都需要在細(xì)胞內(nèi)堿性環(huán)境下進行。如糖酵解過程中的限速酶-磷酸果糖激酶的最適pH 值為7.2，在酸性環(huán)境中，其活性明顯減弱。此外，細(xì)胞增殖過程中所合成的蛋白質(zhì)等物質(zhì)在堿性環(huán)境中合成速度加快，而在酸性環(huán)境中合成受到抑制。另一方面，酸性的細(xì)胞外環(huán)境能夠增強腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。腫瘤細(xì)胞分泌的多種蛋白酶都需要在酸性環(huán)境中溶解其附著的基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)，而且排出的酸也能夠直接溶解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)，從而提高腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力[11]。最近研究還表明，NHE1的活性與腫瘤細(xì)胞偽足的形成密切相關(guān)[12]。偽足對于腫瘤細(xì)胞的運動、黏附具有重要作用，偽足的形成需要細(xì)胞骨架中不同成分之間的相互作用，而NHE1可能是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的pH值，為其提供最適的堿性微環(huán)境[13]。此外，NHE1也能夠被細(xì)胞黏附所激活[14]。以上表明NHE1可能直接參與了腫瘤細(xì)胞偽足的形成、運動和黏附過程。

NHE1 在乳腺癌[15]、肺癌[16]、肝細(xì)胞癌[17]和黑色素瘤[18]等多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，且與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)。本實驗研究結(jié)果顯示，NHE1 主要分布在對照組神經(jīng)元和少量星形膠質(zhì)細(xì)胞胞膜上；在腫瘤組織中，NHE1 分布在低級別星形細(xì)胞瘤胞膜上，并強烈表達(dá)于高級別星形細(xì)胞瘤的胞質(zhì)和胞膜上。與對照組比較，在低級別和高級別星形細(xì)胞瘤組織中NHE1 表達(dá)上調(diào)，其中，惡性程度較高的高級別腫瘤相對于惡性程度低的低級別腫瘤，NHE1 表達(dá)更為強烈。提示NHE1 在星形細(xì)胞瘤的增殖和生長過程中具有重要的作用，與其惡性程度呈正相關(guān)。用NHE1反義基因轉(zhuǎn)染胃癌SGC-7901細(xì)胞，能夠下調(diào)NHE1基因的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)酸化，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[19]；用siRNA干擾NHE1基因的表達(dá)能夠抑制食管癌KYSE-70細(xì)胞的體外增殖和侵襲能力[20-21]。Yang等[22]用NHE1-siRNA和NHE1特異性抑制劑EIPA抑制了肝細(xì)胞癌的生長，同時誘導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，NHE1 通過向胞外轉(zhuǎn)運腫瘤細(xì)胞因高糖酵解產(chǎn)生的H+，維持腫瘤細(xì)胞內(nèi)的pH 值，形成腫瘤細(xì)胞外酸內(nèi)堿的微環(huán)境，對腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移起到重要作用。提示NHE1 有望成為星形細(xì)胞瘤治療的靶點。除此之外，腫瘤細(xì)胞外酸內(nèi)堿的微環(huán)境的形成還可能存在其他分子機制。本課題組前期研究表明，Kir4.1 在人星形細(xì)胞瘤中高表達(dá)，其表達(dá)強度與其病理等級相關(guān)，Kir4.1 的高表達(dá)，導(dǎo)致K+大量內(nèi)流，后者可激活Na+-K+-ATP酶，促進Na+/H+，堿化細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，促進惡性膠質(zhì)細(xì)胞瘤的增殖[23]；MCTs 在星形細(xì)胞瘤中的表達(dá)上調(diào)，提示MCTs 協(xié)同腫瘤細(xì)胞內(nèi)乳酸等酸性物質(zhì)的轉(zhuǎn)運，可能在星形細(xì)胞瘤的增殖和遷移過程中發(fā)揮重要作用，并且對腫瘤細(xì)胞的增殖、生長和細(xì)胞內(nèi)外pH 的維持具有重要的細(xì)胞生物學(xué)意義[11]。然而，NHE1 與Kir4.1 和MCTs 三者的表達(dá)調(diào)控是否存在某種聯(lián)系，還有待進一步研究。