黃 婷 蘭 蕙 王琳琳 韓垠超 葉麗平，2△

（錦州醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，1 病理生理學教研室，2 生物人類學研究所，錦州 121001）

肺癌中非小型細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）多見，且易轉(zhuǎn)移，是患者死亡的主要原因[1]。研究表明，多種細胞因子參與調(diào)節(jié)腫瘤細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1/CCL2）是調(diào)節(jié)巨噬細胞遷移和浸潤的關(guān)鍵趨化因子之一[2]，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤，卵巢癌，前列腺癌等腫瘤組織中過表達，經(jīng)細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular-signal regulated kinase，ERK）、 蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）等多條信號通路參與調(diào)節(jié)腫瘤細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移[3-4]。N-鈣黏蛋白（N-cadherin）是上皮-間質(zhì)化（epithelialmesenchymal transition，EMT）重要標志物，可使腫瘤細胞獲得遷移能力[5]。基質(zhì)金屬蛋白酶-14（matrix metalloproteinase-14，MMP-14）、 基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2），主要參與細胞外基質(zhì)的降解和代謝[6]。MCP-1 在NSCLC 中表達上調(diào)，與侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)，但機制尚不清楚。本研究外源性加入MCP-1，探究MCP-1 是否經(jīng)ERK 通路調(diào)節(jié)肺癌A549 細胞N-cadherin、MMP-14 及MMP-2 的蛋白表達及對其增殖、侵襲轉(zhuǎn)移的影響，對臨床上早期診斷、靶點治療及預后評估等具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料及分組

人肺癌細胞株A549 細胞（本室保存）；1640培養(yǎng)基（美國Gibco）；MCP-1（美國Signalway Antibody）；ERK 通路抑制劑PD98059（APEXIO）、胎牛血清（美國CLARK Bioscience）；Matrigel 基底膠（BD）、Transwell 小室（康寧生物技術(shù)有限公司）；抗p-ERK 和抗t-ERK（Abbkine）；抗N-cadherin、抗 MMP-2、抗 MMP-14 和 抗β-actin抗體（博奧森生物技術(shù)有限公司）；二甲基亞砜（美國Sigma 公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)

將肺癌A549 細胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基中，置于5%CO2、37℃恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d 更換培養(yǎng)液，所有操作均在超凈工作臺中進行。實驗均選用對數(shù)期生長細胞。待細胞貼壁生長鋪滿瓶壁70%～80%時無血清饑餓過夜。

1.3 分組

對照組，MCP-1組（25、50、75、100 ng/mL），MCP-1組（75 ng/mL）+PD98059組，PD98059組。ERK抑制劑PD98059終濃度為100 μmol/L（提前 30 min孵育）。

1.4 MTT 法

取對數(shù)期細胞，細胞計數(shù)，調(diào)整細胞為5×105/mL，以每孔100 μL接種到96 孔板中，四周用PBS 填充。5%CO2，37℃孵育至細胞貼壁，去除培養(yǎng)基；按實驗分組加藥，設6 個復孔；孵育 48 h 后，每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。終止培養(yǎng)，去掉培養(yǎng)液。每孔加入150 μL 的DMSO，置37℃搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490 nm處測量各孔的吸光值。

細胞增殖率=（實驗組OD 值/對照組OD 值）×100%

1.5 劃痕實驗

取對數(shù)期細胞，各組細胞按5×105個/孔接種到6 孔板內(nèi)，待細胞鋪滿皿底后，用200 μL 槍頭垂直劃痕，PBS 洗3 遍。按照實驗分組加藥。每組設2 個復孔。在5%CO2，37℃孵育48 h 后監(jiān)測劃痕寬度變化并照相，Image J 軟件分析劃痕面積，計算愈合率。

劃痕愈合率=（原始劃痕面積-48 h 后劃痕面積）/原始劃痕面積×100%

1.6 Transwell 侵襲實驗

Matrigel 膠于與1640 培養(yǎng)液按1：9 稀釋，每上室各加入60 μL，置于 37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，孵育4 h。取對數(shù)生長期細胞消化處理，制成細胞懸液（密度為5×105/mL），每上室100 μL。下室按分組加藥，孵育48 h。去除上孔培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定10 min，用結(jié)晶紫染色，PBS 洗3 次。采用倒置顯微鏡觀察并拍照。

1.7 免疫印跡檢測

取對數(shù)期生長細胞，按實驗分組加藥后，于冰上收刮不同處理組細胞，裂解細胞，采用BCA法定量蛋白后制成樣品后，進行SDS-PAGE 電泳，半干轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h 后，分別加入一抗，4℃搖床孵育過夜。次日TBST 洗膜，室溫孵育二抗90 min。用TBST 洗3 次后，將ECL 顯影液均勻涂在PVDF 膜上，置于顯影儀上顯影，Image J 軟件計算分析蛋白灰度值。

1.8 統(tǒng)計學處理

以上實驗至少重復 3 次，運用SPSS 17.0 軟件分析數(shù)據(jù)，各組數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 細胞增殖能力

與對照組相比，MCP-1 組隨濃度增加明顯促進細胞增殖（P＜0.05），PD98059 組增殖能力降低（P＜0.05），濃度75 ng/mL 與100 ng/mL MCP-1 組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。MCP-1+PD98059 聯(lián)合處理組細胞增殖能力低于MCP-1 組（75 ng/mL）（P＜0.05）。

表1 不同濃度MCP-1 作用下細胞增殖率 與吸光度值（n=6，±s）Tab1 Effect of different concentrations of MCP-1 on cell proliferation rate and OD Value（n=6，±s）

表1 不同濃度MCP-1 作用下細胞增殖率 與吸光度值（n=6，±s）Tab1 Effect of different concentrations of MCP-1 on cell proliferation rate and OD Value（n=6，±s）

*P＜0.05 vs control；#P＜0.05 vs MCP-1（75 ng/mL）

Absorbance（OD value）Control 100 0.212 0±0.007 MCP-1（25 ng/mL）151.90* 0.308 0±0.008*MCP-1（50 ng/mL）204.40* 0.414 0±0.010*MCP-1（75 ng/mL）290.50* 0.589 0±0.008* MCP-1（100 ng/mL）276.15* 0.575 0±0.008*MCP-1+PD98059 214.18# 0.451 0±0.007#PD98059 84.83* 0.179 0±0.004*Group Cell proliferation rate（%）

2.2 細胞遷移能力

與對照組（11.34%±1.24%）相比，MCP-1（75 ng/mL）組，A549 細胞遷移率提高（51.33%± 4.21%，P＜0.05）；MCP-1 聯(lián) 合PD98059 處 理 組 遷移率（28.33%±5.60%）慢于MCP-1 組（P＜0.05）。與MCP-1+PD98059 組相比，PD98059 組（4.50%± 0.70%）遷移率明顯減慢（P＜0.05）（圖1）。

2.3 細胞侵襲能力

與對照組（115.00±4.05）相比，MCP-1組（545.00± 12.70）穿透細胞數(shù)明顯增多（P＜0.05）；MCP-1組與MCP-1聯(lián)合PD98059組（272.00±6.55）相比，細胞侵襲率有所降低（P＜0.05），單用PD9859組細胞侵襲數(shù)目（51.00±3.00）降低（P＜0.05）（圖2）。

圖1 0 h（A1～D1）和48 h（A2～D2）MCP-1 與PD98059 對A549 細胞遷移的影響，普通顯微鏡，×10Fig1 Effect of MCP-1 and PD98059 on the migration of A549 cells after 0 h（A1-D1）and 48 h（A2-D2）treatment，conventional microscopy，×10

2.4 相關(guān)蛋白表達情況

實驗結(jié)果顯示（圖3），與對照組相比，加入MCP-1處理后，MMP-14、N-cadherin、MMP-2 及p-ERK 蛋白表達水平增高（P＜0.05），總ERK 蛋白量不變（P＞0.05）；與MCP-1 組比較，PD98059聯(lián) 合MCP-1 組MMP-14、N-cadherin、MMP-2及p-ERK 蛋白表達水平下降，單用PD98059 組，MMP-14、N-cadherin、MMP-2 及p-ERK 蛋白表達明顯下降（P＜0.05）。

3 討論

圖2 MCP-1 和PD98059 對細胞侵襲能力的影響，倒置顯微鏡，×10Fig2 Effect of MCP-1 and PD98059 on cell invasion，inverted microscope，×10

圖3 MCP-1 和PD98059 對N-cadherin、MMP-14、MMP-2、t-ERK、p-ERK 蛋白表達影響Fig3 Effect of MCP-1 and PD98059 on expression of N-cadherin，MMP-14，MMP-2，t-ERK，and p-ERK protein

MCP-1 的異常表達在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中有著重要的影響，研究顯示，MCP-1 在乳腺癌中活化Smad3 和p42/44 MAPK 信號通路促進癌細胞的遷移[7]。在前列腺癌中，MCP-1 激活了包括PKCδ、c-Src 和AP-1 的信號轉(zhuǎn)導途徑，抑制該途徑特定成分均會降低MCP-1 對細胞侵襲的影響[8]。馬鐘玲等[9]報道，MCP-1 在NSCLC 組織中的表達高于其在正常組織表達，且與腫瘤的分化、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移及腫瘤分期有關(guān)，提示MCP-1 與NSCLC 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。ERK 信號通路可調(diào)控各種細胞活動過程（如增殖，存活，分化和運動）等，在人類腫瘤中常被異常激活進而促進腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[10]。PD98059 是一種通過作用于其上游激酶而間接抑制ERK1/2 的ERK 抑制劑之一，可阻斷外源性的刺激信號轉(zhuǎn)導至胞內(nèi)，進而影響細胞的生物學效應。

MMPs 是參與腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的主要蛋白酶家族，當ERK 異常活化，可上調(diào)MMP-2、MMP-14 等表達，使細胞外基質(zhì)降解加快[11]，MMP-14 高表達時可促進MMP-2 的活化分泌，誘導家族其他發(fā)揮級聯(lián)反應，進而加速對基底膜的溶解[12]。Fan 等[5]研究表明，通過抑制ERK 信號通路，能有效減弱EMT 的發(fā)生。在滑膜肉瘤細胞中，MMP-14 可誘導EMT增強，使N-cadherin的表達上調(diào)，提高侵襲能力[13]。

本研究先按照濃度分組，用MTT 實驗篩選出MCP-1 作用于A549 細胞的最佳濃度75 ng/mL，再結(jié)合ERK 信號通路抑制劑PD98059，通過MTT實驗、劃痕實驗、Transwell 侵襲實驗進一步探究MCP-1 對A549 細胞作用情況。結(jié)果顯示，與對照組相比，MCP-1 明顯促進細胞的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移，在應用PD98059 作用后，細胞上述作用減弱，免疫印跡結(jié)果顯示，在MCP-1 的作用下p-ERK、N-cadherin、MMP-14、MMP-2 蛋白表達水平增加，但總ERK 蛋白表達量不變。而在加入ERK 抑制劑PD98059 作用后，上述蛋白表達量下降，進一步推測N-cadherin、MMP-14、MMP-2 為ERK 下 游 靶蛋白。

綜上所述，MCP-1 作用于肺癌A549 細胞，可能通過磷酸化ERK 信號通路，增加了ERK 下游N-cadherin、MMP-14、MMP-2 蛋白的表達，最終促進了肺癌細胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移。本實驗是對肺癌侵襲轉(zhuǎn)移研究的初步探討，希望能為未來預防和治療肺癌等疾病提供新的作用靶點。