唐兆華 霍鋼 孫曉川 劉自力 廖正步 陳飛蘭 王文濤 鄭履平 楊剛○☆

創(chuàng)傷性腦水腫是顱腦損傷最重要的繼發(fā)性腦損害，嚴(yán)重的創(chuàng)傷性腦水腫可導(dǎo)致患者出現(xiàn)不可逆性或致死性腦損害，其分子機(jī)制的研究和臨床防治一直都是神經(jīng)外科領(lǐng)域的難題。國(guó)內(nèi)外及本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO）在神經(jīng)系統(tǒng)中具有減輕腦水腫的神經(jīng)保護(hù)功能[1],但其分子機(jī)制尚不明確。細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶 （extracellular regulated protein kinases，ERK）作為EPO的下游信號(hào)通路之一，在顱腦損傷病情發(fā)展過(guò)程中具有重要作用[2]。水通道蛋白4（aquaporin 4，AQP4）是腦組織中分布最重要的跨膜水分子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其異常的過(guò)度表達(dá)可致腦內(nèi)水電解質(zhì)失衡，導(dǎo)致腦水腫加重[3]。本研究擬通過(guò)相關(guān)實(shí)驗(yàn)探討參與EPO抑制創(chuàng)傷性腦水腫的潛在分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的90只健康成年雄性SD大鼠，體質(zhì)量200～260 g，符合國(guó)家二級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)。SD大鼠隨機(jī)分為：假手術(shù)組、創(chuàng)傷組和EPO組，每組30只。假手術(shù)組：只在顱骨上做一個(gè)直徑約為4 mm的骨窗，不作腦創(chuàng)傷。創(chuàng)傷組：制作改進(jìn)式Feeney's創(chuàng)傷性腦損傷模型。EPO組：成功制作Feeney's腦損傷后1 h及每隔24 h時(shí)，給大鼠腹腔注射rhEPO（5000 UI/kg）。所有動(dòng)物的處理符合重慶醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)有關(guān)規(guī)定。p-ERK1/2多克隆抗體及ERK1/2多克隆抗體購(gòu)置于Cell Signaling公司，AQP4及 β-actin多克隆抗體購(gòu)置于 Santa Cruz公司。

1.2 制作大鼠腦創(chuàng)傷模型 采用改良Feeney's硬膜外撞擊法制作大鼠腦創(chuàng)傷模型[4]。于傷后1 d、3 d和5 d，檢測(cè)各組大鼠行為學(xué)評(píng)分。創(chuàng)傷后72 h，檢測(cè)各組大鼠腦組織含水量情況，腦組織磷酸化ERK（phosph orylated ERK，p-ERK）、AQP4 mRNA 與AQP4蛋白的表達(dá)。因不可控因素導(dǎo)致造模失敗或大鼠死亡共6只，通過(guò)隨機(jī)抽樣的原則重新取大鼠造模，以補(bǔ)齊各組動(dòng)物數(shù)目。

1.3 干濕比重法測(cè)定腦組織含水量 將各組大鼠創(chuàng)傷后腦組織放在鋪有生理鹽水浸濕濾紙的培養(yǎng)皿中，用電子天平（精確度：0.0001 g）稱取腦組織的濕質(zhì)量，然后置于85℃的恒溫干燥箱24 h，質(zhì)量恒定后，稱得腦組織的干質(zhì)量。計(jì)算腦含水量：腦組織含水量=（濕質(zhì)量-干質(zhì)量）×100%/濕質(zhì)量。

1.4 行為學(xué)評(píng)分 采用平衡木行為學(xué)評(píng)分法[5]，評(píng)估其神經(jīng)功能缺損情況，得分越高表示神經(jīng)功能受損越嚴(yán)重。具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 腦出血大鼠行為學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.5 RT-PCR法檢測(cè)AQP4 mRNA表達(dá)情況 按Trizol試劑盒說(shuō)明書步驟，提取樣本AQP4的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。AQP4引物：上游 5'-CCTACAGAACCAAGGCGTAA-3'，下游 5'-TCCCTGGAAATGACTGAGAA-3'，擴(kuò)增片段261bp；β-actin：上游 5'-ACCTCCAACACCCCAGCCATG-3'，下游 5c-CTGATCCACATCTGCTGGAAGGTGG-3c,擴(kuò)增片段為 691 bp，反應(yīng)體系 25 μL（引物合成由上海生工公司提供）。PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火45 s，72℃延伸1 min，循環(huán)30次，72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物電泳，照相，以Quantity One對(duì)電泳條帶吸光度（A）進(jìn)行分析。AQP4/β-actin的積分A值作為AQP4 mRNA表達(dá)水平。

1.6 Western blot法檢測(cè)p-ERK、ERK和AQP4蛋白表達(dá)情況 在樣本中加入蛋白裂解液和PMSF，冰上裂解20 min，測(cè)定裂解液蛋白濃度，加入上樣緩沖液，裂解液在沸水中變性5 min。每孔加入含40 μg蛋白樣品電泳，使用PDVF膜轉(zhuǎn)膜，封閉，加入一抗 （p-ERK 1/2 1∶1000，ERK 1/2 1∶1000，AQP4 1∶300）4 ℃孵育過(guò)夜，加二抗，在 37 ℃孵育 1 h，ECL顯影，β-actin作為內(nèi)對(duì)照參數(shù)。使用Quantity One分析熒光條帶的平均光密度值（A），以p-ERK/ERK和AQP4/β-actin的積分A值分別作為p-ERK和AQP4表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，p-ERK、AQP4 mRNA和蛋白表達(dá)和腦含水量檢測(cè)的組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Turkey法；大鼠行為學(xué)評(píng)分評(píng)分以M（QL，QU）表示，采用Mann-Whitney U秩和檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 干濕重法檢測(cè)大鼠腦組織含水量 假手術(shù)組大鼠腦組織含水量相對(duì)較少；與假手術(shù)組比較，創(chuàng)傷組腦含水量出現(xiàn)明顯增加 （F=25.78，P＜0.01）；與創(chuàng)傷組相比，EPO組大鼠腦含水量則顯著降低（P＜0.01）。 見表 2。

2.2 平衡木法檢測(cè)大鼠傷后神經(jīng)功能障礙行為學(xué)評(píng)分 在腦損傷后24 h、72 h和120 h時(shí)，創(chuàng)傷組及EPO組大鼠都出現(xiàn)行為學(xué)評(píng)分增高。與創(chuàng)傷組相比，EPO組大鼠在傷后各時(shí)間點(diǎn)行為學(xué)評(píng)分均顯著降低 （Z值分別為 -2.318、-4.326和-2.459，P均＜0.05），見表 3。

2.3 Western blot法檢測(cè)各組大鼠腦創(chuàng)傷后ERK磷酸化水平 傷后72 h時(shí)，假手術(shù)組大鼠腦組織中有少量的p-ERK蛋白表達(dá)，ERK磷酸化水平較低；與假手術(shù)組相比，創(chuàng)傷組大鼠腦組織中的p-ERK 水平在傷后顯著上升 （F=35.88，P＜0.01）；與創(chuàng)傷組相比，EPO組大鼠腦組織中p-ERK明顯降低（P＜0.01）。 見圖 1，表 2。

2.4 RT-PCR法檢測(cè)各組大鼠腦創(chuàng)傷后AQP4 mRNA的表達(dá) 傷后72 h時(shí)，假手術(shù)組大鼠腦組織存在少量AQP4 mRNA表達(dá)；與假手術(shù)組相比，創(chuàng)傷組大鼠腦組織中AQP4 mRNA表達(dá)在創(chuàng)傷后顯著增高（F=35.88，P＜0.01）；與創(chuàng)傷組相比，EPO組大鼠腦組織中AQP4 mRNA表達(dá)水平出現(xiàn)明顯降低（P＜0.01）,見圖 2 和表 2。

2.5 Western blot法檢測(cè)各組大鼠腦創(chuàng)傷后AQP4蛋白表達(dá) 傷后72 h時(shí)，假手術(shù)組大鼠腦組織有少量AQP4蛋白表達(dá)；與假手術(shù)組相比，創(chuàng)傷組大鼠腦組織中AQP4蛋白表達(dá)在創(chuàng)傷后出現(xiàn)了顯著增高 （F=23.48，P＜0.01）；EPO 組大鼠腦組織中AQP4蛋白表達(dá)水平較創(chuàng)傷組明顯降低 （P＜0.01）。 見圖 3和表2。

表2 各組大鼠傷后72 h p-ERK、AQP4 mRNA和蛋白表達(dá)量及腦含水量情況

表3 平衡木法檢測(cè)各組大鼠神經(jīng)功能障礙的行為學(xué)評(píng)分[M（QL，QU）]

3 討論

顱腦損傷后創(chuàng)傷性腦水腫是最常見的并發(fā)癥，也是腦損傷治療關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制與臨床的有效防治一直未得到解決。近年研究發(fā)現(xiàn) EPO及其受體不僅存在于血液系統(tǒng)，還廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在各種病理及生理情況下發(fā)揮了非常重要的保護(hù)功能[6]。但EPO抑制創(chuàng)傷性腦水腫的分子機(jī)制仍尚不明確。

圖1 Western blot檢測(cè)p-ERK在各組大鼠在腦創(chuàng)傷后72 h時(shí)的表達(dá)變化（Sham：假手術(shù)組，TBI：創(chuàng)傷組，EPO：EPO 組）

圖2 RT-PCR法檢測(cè)AQP4 mRNA在各組大鼠腦創(chuàng)傷后72 h時(shí)的表達(dá)水平（Sham：假手術(shù)組，TBI：創(chuàng)傷組，EPO：EPO 組）

圖3 Western blot法檢測(cè)AQP4蛋白在各組大鼠腦創(chuàng)傷后72 h時(shí)的表達(dá)水平（Sham：假手術(shù)組，TBI：創(chuàng)傷組，EPO：EPO 組）

MAPKs超家族是細(xì)胞各種生物學(xué)反應(yīng)的重要信號(hào)傳導(dǎo)通路，廣泛分布于各類細(xì)胞胞漿內(nèi)，主要包括3種亞家族：分別是ERK、p38和JNK[7]。ERK作為EPO下游信號(hào)通路之一，在顱腦損傷、蛛網(wǎng)膜下腔出血、腦卒中等疾病信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[8]。AQP4是水通道蛋白家族 （已發(fā)現(xiàn)10種 ）中的一種，也是存在于腦內(nèi)最主要水通道蛋白，具有特異的水轉(zhuǎn)運(yùn)功能,是膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)外及其與血管之間水調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)運(yùn)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[3]。在腦外傷及腦卒中等損傷情況下ERK通路過(guò)度激活和AQP4過(guò)度表達(dá)與腦內(nèi)水電解質(zhì)失衡、腦含水量上升，腦水腫加重的病理變化密切相關(guān)[9]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)大鼠腦創(chuàng)傷后腦含水量增加，出現(xiàn)了嚴(yán)重的創(chuàng)傷性腦水腫，大鼠神經(jīng)功能明顯障礙，腦組織中ERK磷酸化水平明顯增加，AQP4的mRNA和蛋白表達(dá)明顯上升。以上結(jié)果證實(shí)ERK通路在腦創(chuàng)傷后過(guò)度激活及AQP4過(guò)度高表達(dá)可能促進(jìn)了創(chuàng)傷后腦水腫的發(fā)生發(fā)展。

在本研究后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，為了研究EPO是否可通過(guò)調(diào)節(jié)腦傷后ERK信號(hào)通路活化及AQP4蛋白表達(dá)影響創(chuàng)傷性腦水腫，我們?cè)诖笫竽X創(chuàng)傷后腹腔注射rhEPO處理，結(jié)果顯示ERK磷酸化水平明顯降低，ERK信號(hào)通路活性被抑制，ERK信號(hào)通路活性下降可下調(diào)其下游AQP4的表達(dá)水平[10]。本研究中發(fā)現(xiàn)rhEPO處理后大鼠腦組織AQP4的mRNA和蛋白表達(dá)均明顯降低。AQP4過(guò)度表達(dá)被抑制可控制水分子大量進(jìn)入腦組織間質(zhì)和膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)，使腦膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)外及其與血管之間水轉(zhuǎn)運(yùn)失衡得到明顯改善，減少傷后腦含水量[3]。本研究發(fā)現(xiàn)rhEPO處理后大鼠腦組織含水量較普通外傷組大鼠確有顯著降低，創(chuàng)傷性腦水腫緩解，大鼠神經(jīng)功能障礙也得到明顯改善。這表明rhEPO可阻斷大鼠腦創(chuàng)傷后ERK信號(hào)通路過(guò)度激活，下調(diào)其下游AQP4蛋白高表達(dá)，恢復(fù)腦膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)外及其血管之間水轉(zhuǎn)運(yùn)平衡，保持腦組織正常含水量，緩解創(chuàng)傷性腦水腫，減輕大鼠繼發(fā)性腦損傷。

EPO調(diào)控傷后ERK通路活化程度及AQP4的表達(dá)水平，抑制創(chuàng)傷性腦水腫的作用及其分子機(jī)制，為創(chuàng)傷性腦水腫的治療提供了新的思路。參與EPO調(diào)節(jié)創(chuàng)傷性腦水腫的作用機(jī)制復(fù)雜，需要后續(xù)深入研究。