李瑩杰

同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院營養(yǎng)科，上海 200065

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome，IBS)是一種以腹痛或腹部不適伴有排便習(xí)慣和糞便性狀改變?yōu)橹饕憩F(xiàn)的功能性胃腸道疾病，其發(fā)病率為10%～20%[1]。IBS是多因素相互作用的結(jié)果，其中，內(nèi)臟高敏感是其核心發(fā)病機(jī)制[2]。同時，IBS的形成也與精神心理因素如抑郁、焦慮、感染等有關(guān)[3]。雖然IBS不危及患者生命，但嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，增加患者精神壓力和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，因此，IBS的發(fā)病機(jī)制和有效治療方案是當(dāng)前亟需解決的問題。有研究[4]發(fā)現(xiàn)，IBS患者的頭發(fā)檢測顯示鋅含量與健康者對比明顯缺乏，且部分患者未經(jīng)任何治療，單純服用富含微量元素鋅的礦泉水后，腹脹、腹痛、排便習(xí)慣的改變等一系列癥狀均明顯改善。

微量元素鋅在體內(nèi)參與多種酶的組成及生理功能，在神經(jīng)系統(tǒng)中分布尤其豐富，其中海馬中鋅離子分布較多。鋅含量的變化對免疫、內(nèi)分泌及某些神經(jīng)遞質(zhì)有較大的影響。而慢性精神應(yīng)激對機(jī)體鋅含量的變化也有重要影響。在我們的既往研究中發(fā)現(xiàn)，慢性精神應(yīng)激導(dǎo)致皮質(zhì)醇(cortisol, CORT)升高的同時，大鼠的血清鋅水平顯著下降，同時鋅表觀吸收率和海馬鋅含量下降[5]。在慢性精神應(yīng)激過程中由于HPA軸被激活，血清CORT含量升高，引起鋅能神經(jīng)元突觸末梢內(nèi)鋅離子釋放，而鋅濃度的升高或降低均可影響氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞，包括5-羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺素、多巴胺等。其中5-HT受體及其轉(zhuǎn)運(yùn)體在腸道動力紊亂、內(nèi)臟感覺異常等機(jī)制中發(fā)揮重要作用[6-7]。另外,鋅還能影響膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性及其功能，抑制肥大細(xì)胞脫顆粒及血小板釋放5-HT。過去有關(guān)特定腦區(qū)內(nèi)突觸后鋅離子的研究主要集中于海馬及前額葉對學(xué)習(xí)、記憶功能的影響，而對海馬內(nèi)鋅離子與內(nèi)臟感覺調(diào)節(jié)關(guān)系的研究尚缺乏。

因此,本研究一方面旨在探討慢性精神應(yīng)激致內(nèi)臟高敏過程中海馬內(nèi)及血清內(nèi)鋅離子的變化,另一方面探討鋅離子的變化是否可能會通過影響與內(nèi)臟高敏感形成相關(guān)的某些神經(jīng)遞質(zhì)，如5-HT、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)、環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein, CREB)、蛋白激酶 A(protein kinase A，PKA)等影響IBS的發(fā)生發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物清潔級雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量180～200 g，經(jīng)同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心購買。大鼠運(yùn)達(dá)實(shí)驗(yàn)中心并經(jīng)1周適應(yīng)性飼養(yǎng)后，開始進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。大鼠飼養(yǎng)籠使用前均經(jīng)過紫外線照射及消毒。大鼠飼養(yǎng)房間內(nèi)保持恒溫(25±2)℃，濕度50%～60%，使用標(biāo)準(zhǔn)飼料與自來水常規(guī)飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)過程中符合實(shí)驗(yàn)動物福利倫理原則。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑Trizol 裂解液、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和qRTPCR擴(kuò)增試劑盒購自日本Takara 公司。PCR引物購自上海生工生物有限公司。ELISA試劑盒購自R&D Systems公司。其余試劑均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 動物分組將60只雄性SD大鼠分為兩組：慢性避水應(yīng)激組和正常對照組，每組30只。

實(shí)驗(yàn)動物模型建立：應(yīng)用慢性避水應(yīng)激方法給予慢性避水應(yīng)激組大鼠慢性精神刺激，在25 cm×25 cm×45 cm的水箱中豎置8 cm×8 cm×10 cm的平臺，向水箱內(nèi)加水(常溫)，水面距平臺最高點(diǎn)1 cm，每日上午9:00開始將大鼠置于水箱中的平臺上站立1 h，實(shí)驗(yàn)連續(xù)進(jìn)行10 d。10 d后記錄大鼠內(nèi)臟敏感性[8]。正常對照組大鼠給予正常飲食，每2 d稱重1次。

慢性避水應(yīng)激實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對兩組大鼠進(jìn)行內(nèi)臟敏感性評估。評估方法采用以球囊直腸擴(kuò)張引起大鼠腹部收縮反射(abdominal withdrawal reflex，AWR)的最小容量閾值來進(jìn)行半定量評分。評估前大鼠禁食24 h，飲水不限制。評估過程中，將大鼠置于特殊改裝的透明塑料容器中，使得大鼠只能前后運(yùn)動，無法轉(zhuǎn)身。實(shí)驗(yàn)過程中使用的球囊和導(dǎo)管在進(jìn)入大鼠肛門前先用石蠟油潤滑，插入肛門后球囊的末端距離肛門口約1 cm，同時使用膠布將導(dǎo)管與大鼠尾巴固定在一起。AWR評分標(biāo)準(zhǔn)為：大鼠無明顯行為變化為0分；身體不動，僅有輕微的頭部運(yùn)動為1分；腹部肌肉開始收縮，但下腹壁未抬離桌面為2分；下腹壁抬離桌面為3分；大鼠身體呈弓狀，伴骨盆抬起為4分。由非實(shí)驗(yàn)者觀察并記錄給予不同球囊注水量時大鼠的AWR評分，重復(fù)3次，每次給予擴(kuò)張之間間歇3 min，取3次實(shí)驗(yàn)的平均分[9]。

1.4 指標(biāo)測定

1.4.1 大鼠血清鋅離子及海馬鋅離子含量的測定：大鼠用戊巴比妥鈉麻醉后，心臟取血，所采血液樣本靜置15～20 min后置于高速離心機(jī)，3 000 r/min,離心15 min，離心后使用移液器吸取管內(nèi)上層血清，并轉(zhuǎn)入新的離心管內(nèi)備用。大鼠采血后使用4 ℃質(zhì)量濃度為9 g/L的生理鹽水進(jìn)行心臟灌流，灌流后再注射過量麻藥處死，處死后將大鼠頭取下置于冰上并迅速將海馬取出稱重后加入硝酸及高氯酸4∶1混合液高溫消化，消化后導(dǎo)出至5 ml容量瓶中并用去離子水定容，采用原子吸收分光光度計火焰法測定其中血清鋅離子和海馬鋅離子含量。

1.4.2 實(shí)時定量熒光PCR(RT-PCR)測定大鼠海馬內(nèi)相關(guān)因子mRNA表達(dá)量：通過RT-PCR測定大鼠海馬內(nèi)5-HT、BDNF、CREB、PKA mRNA的表達(dá)水平。取出大鼠海馬組織，根據(jù)RNA提取試劑盒的說明步驟提取總RNA后，再進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，而后進(jìn)行PCR反應(yīng)。RT-PCR過程中所使用的引物序列如下：5-HT 上游：5′-AGGACCACGGCTACACCATCTAC-3′，下游：5′-CTGACAGTCTTGCGGATTCGGAAG-3′； CREB 上游：5′-TGTTGTTCAAGCTGCCTCTGGTG-3′，下游：5′-GCTTCTTCAGCAGGCTGTGTAGG-3′；BDNF上游：5′-TGGAACTCGCAATGCCGAACTAC-3′，下游：5′-TCCTTATGAACCGCCAGCCAATTC-3′；PKA上游：5′-GGACAAGCAGAAGGTGGTGAAGC-3′，下游：5′-ACCAGGCACGTACTCCATGACC-3′；β-actin上游：5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′，下游：5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′。

1.4.3 ELISA測定大鼠海馬內(nèi)相關(guān)因子蛋白含量：按照ELISA試劑盒說明書測定大鼠海馬內(nèi)5-HT、BDNF、CREB、PKA蛋白含量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。對計量資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，統(tǒng)計方法采用配對樣本t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)臟敏感性評估慢性避水應(yīng)激組大鼠與正常對照組大鼠相比，AWR評分明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖1)。

又一只白鷲閃電般落下，爪下的土狼向旁一跳，卻仍被利爪勾破了肚皮。爪尖穿透肚腸，拽著這根腸子的一端飛上了天，另一端卻仍留在土狼的肚子里，就像從高空垂到地面的一條血淋淋的繩索。土狼的叫聲像厲鬼一般歇斯底里，在腸子的拉扯下，它的身體在地面上滑出一條帶血的長痕，在撞到一塊巨石后，腸子終于被扯斷。它的四肢抽搐了幾下，便再也不動彈。

2.2 鋅離子含量慢性避水應(yīng)激組大鼠與正常對照組大鼠相比，海馬鋅離子含量顯著下降，血清鋅離子含量也下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖2)。

注：與正常對照組比較，*P<0.05。

注：與正常對照組比較，*P<0.05。

2.3 海馬內(nèi)各相關(guān)因子mRNA及蛋白含量的變化通過RT-PCR及ELISA檢測發(fā)現(xiàn)，慢性避水應(yīng)激組大鼠與正常對照組大鼠海馬內(nèi)5-HT、CREB、BDNF、PKA mRNA含量及蛋白表達(dá)量相比均明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖3)。

注：A: 5-HT mRNA表達(dá)；B: PKA mRNA表達(dá)；C： CREB mRNA表達(dá)；D: BDNF mRNA表達(dá)；E: 5-HT蛋白表達(dá)；F: CREB蛋白表達(dá)；G: BDNF蛋白表達(dá)；H: PKA蛋白表達(dá)。與正常對照組比較，*P<0.05。

3 討論

大量流行病學(xué)研究觀察了精神應(yīng)激與功能性胃腸病癥狀發(fā)生和加重的關(guān)系。而在精神心理因素中抑郁及焦慮常被IBS患者作為第一主訴，給予抗焦慮、抑郁等藥物治療后患者消化道癥狀可得到明顯改善[10]。這提示精神狀態(tài)的改變可能參與IBS內(nèi)臟高敏感發(fā)病機(jī)制。

微量元素鋅在體內(nèi)參與多種酶的組成及生理功能，在神經(jīng)系統(tǒng)中分布尤其豐富，是維持神經(jīng)系統(tǒng)功能必需的元素之一。鋅含量的變化對免疫、內(nèi)分泌變化及某些神經(jīng)遞質(zhì)有較大的影響，進(jìn)而還會影響人的精神狀態(tài)、思維及認(rèn)知等。腦中的自由鋅絕大部分位于谷氨酸能神經(jīng)末梢，鋅離子在谷氨酸的貯存、釋放和再攝取方面可能發(fā)揮著重要作用或參與了谷氨酸受體的調(diào)節(jié)。

機(jī)體鋅穩(wěn)態(tài)易受到胞外各種病理生理環(huán)境因素的影響，如炎癥、氧化應(yīng)激等，實(shí)驗(yàn)證明，在應(yīng)激條件下，胞內(nèi)游離鋅離子濃度可顯著上升，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞損傷。我們既往研究也發(fā)現(xiàn)，精神應(yīng)激可導(dǎo)致血清鋅水平顯著下降和胞內(nèi)游離鋅濃度顯著升高。說明鋅在精神應(yīng)激過程中可能具有重要作用，一方面，各種應(yīng)激導(dǎo)致胞內(nèi)游離鋅濃度上升，使鋅在胞內(nèi)產(chǎn)生毒性作用，造成細(xì)胞損傷；另一方面，應(yīng)激導(dǎo)致機(jī)體血清鋅下降，并可能導(dǎo)致體內(nèi)鋅的重新分布，從而影響機(jī)體的抗應(yīng)激能力[11-12]。

Barbara等[13]通過檢測IBS患者直腸黏膜中肥大細(xì)胞發(fā)現(xiàn), 其中活化脫顆粒肥大細(xì)胞數(shù)目明顯增加, 且與直腸高敏感和癥狀嚴(yán)重程度相關(guān)。而鋅能影響腸道黏膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性及其功能，抑制腸道肥大細(xì)胞脫顆粒。提示鋅的缺乏可能影響IBS的內(nèi)臟高敏感程度。

鋅缺乏可使大鼠海馬和皮層中cAMP水平顯著增加，使PKA 活性顯著降低。有關(guān)研究[14]也通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)NMDA受體在IBS患者腸黏膜表達(dá)升高，并通過成熟BDNF促進(jìn)IBS內(nèi)臟高敏感的發(fā)生。另，慢性溫和應(yīng)激可明顯抑制大鼠海馬齒狀回BDNF蛋白的表達(dá)和CREB的磷酸化[15]，表明海馬部位的BDNF表達(dá)水平升高在應(yīng)激適應(yīng)或抵抗過程中可能起關(guān)鍵作用。同時BDNF在中樞有致痛和致敏感性作用[16]，對人腸上皮屏障功能和腸道動力也有影響[17]，其異常表達(dá)可導(dǎo)致慢性疼痛、炎癥性疼痛和內(nèi)臟疼痛及高敏感異常感覺的產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)，慢性束縛應(yīng)激可導(dǎo)致大腦內(nèi)部分區(qū)域BDNF的mRNA和蛋白表達(dá)增加[18]。CREB是廣泛存在于神經(jīng)細(xì)胞核內(nèi)的一種轉(zhuǎn)錄因子, 有研究表明，細(xì)胞內(nèi)鋅的缺乏會減少CREB的表達(dá)和活力，而外源性的鋅的補(bǔ)充能夠恢復(fù)神經(jīng)細(xì)胞和其他細(xì)胞系統(tǒng)中CREB的表達(dá)和活力[19]。

本研究檢測了慢性避水應(yīng)激組大鼠與正常對照組大鼠海馬內(nèi)5-HT、CREB、BDNF及PKA mRNA含量及蛋白表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)與正常對照組大鼠相比，慢性避水應(yīng)激組大鼠均有明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 我們猜測可能是海馬內(nèi)鋅離子的變化影響了許多含鋅酶的活性，這些酶的活性又與CREB、BDNF等轉(zhuǎn)錄因子的活性相關(guān)，以上因子的活性下降導(dǎo)致了內(nèi)臟高敏的形成。

綜上所述，我們推測在慢性精神應(yīng)激后，海馬內(nèi)突觸末梢釋放的鋅離子信號有可能作用于突觸后膜的5-HT受體，再通過cAMP-PKA通路激活CREB的磷酸化，調(diào)節(jié)下游的BDNF表達(dá)，最終造成內(nèi)臟高敏感，引起IBS。

本研究初步探索了在精神應(yīng)激誘發(fā)的IBS發(fā)生、發(fā)展過程中機(jī)體鋅離子的變化，以及鋅離子變化的同時機(jī)體內(nèi)與內(nèi)臟高敏形成相關(guān)因子的變化情況，為精神應(yīng)激相關(guān)IBS發(fā)病的機(jī)制研究提供了一個新思路，但海馬內(nèi)鋅離子與內(nèi)臟感覺調(diào)節(jié)的具體機(jī)制有待進(jìn)一步做深入的干預(yù)研究。