趙戴軍，陳碧華，2，郭衛(wèi)麗，2，潘飛飛，2，孟凡茹，王廣印，2

(1．河南科技學院 園藝園林學院，河南新鄉(xiāng) 453003；2．河南省園藝植物資源利用與種質創(chuàng)新工程研究中心，河南新鄉(xiāng) 453003)

近年來，隨著工業(yè)廢棄物的排放、化肥農藥的過量使用，導致土壤的鎘(Cd)污染[1-2]。Cd是一種重金屬元素，具有很強的毒性，不僅會危害農作物的生長，而且會危害人體的健康[3]，因此土壤Cd污染的治理迫在眉睫。常見的土壤修復方式有農業(yè)修復、物理修復、化學修復和生物修復[4]，海藻酸鈉(NaAlg)是從褐藻類的海帶或馬尾藻中提取碘和甘露醇之后的副產物[5]，具有性質穩(wěn)定、無毒、無刺激性以及符合要求的粘度、滲透性、親水性、溶解性等特性[6]，所以NaAlg被廣泛應用于食品、醫(yī)藥、紡織、農業(yè)等領域[7-10]。NaAlg中的Na+可以與二價陽離子發(fā)生交換，使得NaAlg溶液向凝膠轉變[11]。Lee等[12]研究表明，與其他二價陽離子相比Ca2+為最常用的交聯(lián)劑。鄧靖等[13]研究表明，與其他鈣劑相比CaCl2是一種理想的交聯(lián)劑。NaAlg被應用于治理重金屬水污染的報道較多，且效果顯著[14]，但NaAlg被用于土壤Cd污染治理的研究鮮有報道。本試驗以蔬菜種植面積較大的黃瓜(CucumissativusL.)為試驗材料，研究基質中NaAlg與CaCl2混合添加對鎘脅迫下黃瓜幼苗鎘吸收的影響。旨在通過NaAlg與CaCl2協(xié)同作用減少黃瓜幼苗對重金屬Cd的吸收利用，從而減少Cd2+通過食物鏈對人體的危害，為Cd污染的治理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試黃瓜種子為‘新津春4號’，由寧陽縣魯明種子有限公司提供。

試劑：海藻酸鈉(NaAlg)(山東西亞化學股份有限公司)；無水氯化鈣(CaCl2)(天津市凱通化學試劑有限公司)；氯化鎘(CdCl2·2.5H2O)(國藥集團化學試劑有限公司)。

1.2 試驗設計

試驗于2018年11月在河南科技學院園藝園林學院進行，盆栽試驗采用基質栽培，基質按草 炭∶蛭石∶珍珠巖=3∶1∶1的體積比配制，基質中采用CdCl2·2.5H2O進行鎘脅迫，脅迫含量為20 mg·kg-1，按NaAlg和CaCl2添加量共設置對照(CK)、T50、T100、T200、T400、T8006個處理，每個處理6盆，重復3次，共108盆。如表1所示，將基質攪拌均勻使含水量達到70%，將基質裝入規(guī)格為6 cm×6 cm×7.5 cm的營養(yǎng)缽中。將黃瓜種子進行溫湯浸種，55 ℃水溫下攪拌15 min，放置在常溫水中浸種4 h，然后將種子播種到營養(yǎng)缽中進行培養(yǎng)(每個營養(yǎng)缽中種1株黃瓜)。

表1 各處理CdCl2·2.5H2O、NaAlg和CaCl2添加量Table 1 Addition amount of CdCl2·2.5H2O, NaAlg and CaCl2

注： Wt為溶液的質量百分數(shù)(溶質質量/溶液質量)。

Note:Wt in the table is mass percentage of solution (solute mass/solution mass).

1.3 測定項目及方法

1.3.1 生長指標的測定 待黃瓜幼苗長至2片真葉時，用卷尺、游標卡尺、手持葉綠素儀(SPAD-502)分別測定每棵黃瓜幼苗的株高、莖粗、葉片數(shù)以及葉綠素含量。

每個處理的每個重復中分別取1株黃瓜幼苗，將黃瓜幼苗的地上部和根分別放入烘箱中，先105 ℃殺青30 min，然后于70 ℃烘至恒量，用電子分析天平分別稱取烘干前后的鮮質量及干 質量。

每個處理的每個重復中分別取1株黃瓜幼苗，將完整的黃瓜幼苗根從基質中取出、洗凈，用根系掃描儀(Epson Perfection V800)進行掃描，然后用WinRHIZO根系形態(tài)分析系統(tǒng)進行分析，獲取總根長、根表面積、根系平均直徑、根體積和根尖數(shù)等根系形態(tài)參數(shù)。

1.3.2 黃瓜幼苗鎘含量的測定 每個處理的每個重復中分別取1株黃瓜幼苗，將其根、莖、葉分別烘干、磨碎，各稱取0.2 g(精確至0.001 g)，在消解罐中加8 mL濃硝酸、2 mL高氯酸和2 mL雙氧水，置于消解儀中[165 ℃ 5 W(機器運行功率)]，消解至澄清、無雜質，后將消解完成的溶液轉移至50 mL的聚四氯乙烯燒杯中，在電熱板上(170 ℃)趕酸至近干，然后用含量為 0.5%的硝酸定容至25 mL，定容結束后將溶液裝入50 mL離心管中待測，Optima 2100 DV電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀測定樣品中的鎘含量[15]。

1.3.3 黃瓜幼苗中亞細胞組分分離與分析 參照宋阿琳等[16]方法，略有改進。從每個處理的每個重復中分別取1株黃瓜幼苗，分別取其地上部分與地下部分，各稱取0.5 g在研缽中，加入5 mL的勻漿液[成分：蔗糖250 mmol·L-1，Tris-HCl(pH 7.5)50 mmol·L-1和DTT 1 mmol·L-1]，4 ℃下研磨，轉移至離心管中，3 000 r·min-1離心1 min，沉淀為細胞壁成分。取上清液繼續(xù)進行離心，14 500 r·min-1離心45 min，沉淀為細胞器，上清液為細胞質。將離心后的細胞壁和細胞器組分再進行消解，并用質量比為0.5%的稀硝酸定容至25 mL，細胞質組分直接定容到容量瓶中待測。

1.3.4 膜保護酶活性測定 從每個處理的每個重復中取黃瓜幼苗的全部真葉，剪碎(去葉脈)，取0.5 g放入研缽中加入5 mL 62.5 mmol·L-1pH 7.8 PBS(含量為0.3%的PVP)和少量的石英沙，于冰浴研磨成勻漿，15 000 g，4 ℃低溫離心10 min，上清液于4 ℃低溫保存，備用。超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氯化硝基四氮唑藍(NBT))方法測定[17]，過氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚方法測定[18]，過氧化氫酶(CAT)活性采用H2O2方法測定[19]。

1.3.5 丙二醛(MDA)含量測定 酶液的提取見“1.3.4”。MDA含量采用硫代巴比妥酸的方法測定[20]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Office Excel 2010和SPSS 21.0對數(shù)據(jù)進行分析。

2 結果與分析

2.1 鎘脅迫下NaAlg與CaCl2混合添加黃瓜幼苗生長變化

2.1.1 黃瓜幼苗莖粗、株高、葉片數(shù)及葉綠素含量的變化 由表2可知，T50處理下黃瓜幼苗的莖粗達到最大值，T50、T100、T200、T400、T800處理下黃瓜幼苗的莖粗較CK分別增加25.30%、 23.69%、17.67%、18.09%和12.45%，均達到顯著水平(P<0.05)；T100處理下黃瓜幼苗的株高達到最大值，T50、T100、T200處理下黃瓜幼苗的株高較CK分別增加10.95%、13.26%和10.66%，均達到顯著水平(P<0.05)；隨著NaAlg與CaCl2添加量的增加黃瓜幼苗的葉片數(shù)呈下降趨勢，T50和T100處理下黃瓜幼苗的葉片數(shù)較CK差異不顯著(P>0.05)，T200、T400、T800處理下黃瓜幼苗的葉片數(shù)較CK分別降低21.60%、 30.52%和38.97%，均達到顯著水平(P<0.05)；T800處理下黃瓜幼苗的葉綠素含量達到最大值，T800處理下黃瓜幼苗的葉綠素含量較CK增加 12.14%，達到顯著水平(P<0.05)，T50、T200和T400處理下黃瓜幼苗的葉綠素含量較CK差異不顯著(P>0.05)。

表2 鎘脅迫下NaAlg與CaCl2混合添加黃瓜幼苗莖粗、株高、葉片數(shù)及葉綠素含量Table 2 Stem thickness, plant height, number of blades and chlorophyll content of cucumber seedlings with use of mixed addition of NaAlg and CaCl2 under Cd stress

注：表中數(shù)據(jù)為“平均值±標準差”；同一列不同小寫字母分別表示不同處理之間在0.05水平存在顯著性差異。下同。

Note:The data in the table is the “average ± standard error”；and different lowercase letters in the same column indicate significant differences at 0.05 levels among different treatments.The same below.

2.1.2 黃瓜幼苗干質量和鮮質量的變化 由表3可知，T200處理下黃瓜幼苗的地上部鮮質量達到最大值，T50、T100、T200、T400、T800處理下黃瓜幼苗的地上部鮮質量較CK分別增加32.05%、 43.25%、50.04%、27.64%和29.35%，均達到顯著水平(P<0.05)；T200處理下黃瓜幼苗的地下部鮮質量達到最大值，T200處理下黃瓜幼苗地下部鮮質量較CK增加24.40%，達到顯著水平 (P<0.05)，而T800處理下黃瓜幼苗的地下部鮮質量較CK則減少37.80%，達到顯著水平(P< 0.05)；T200處理下黃瓜幼苗的地上部干質量達到最大值，T50、T100、T200、T400處理下黃瓜幼苗的地上部干質量較CK分別增加27.69%、23.85%、 29.23%和15.38%，達到顯著水平(P<0.05)；T100、T200處理下黃瓜幼苗的地下部干質量均達到最大值，T100、T200處理下黃瓜幼苗的地下部干質量較CK分別增加9.52%，T800處理下黃瓜幼苗的地下部干質量較CK減少33.3%，達到顯著水平(P<0.05)。

表3 鎘脅迫下NaAlg與CaCl2混合添加黃瓜幼苗單株干質量和鮮質量Table 3 Dry mass and fresh mass of cucumber seedlings with use of mixed addition of NaAlg and CaCl2 under Cd stress

2.1.3 黃瓜幼苗根系形態(tài)的變化 由表4可知，T50處理下黃瓜幼苗的根總長達到最大值，較CK增加32.97%，達到顯著水平(P<0.05)，T400、T800處理下黃瓜幼苗的根總長較CK分別降低33.26%、 78.31%，均達到顯著水平(P<0.05)；T50處理下黃瓜幼苗的根表面積達到最大值，較CK增加32.97%，達到顯著水平(P<0.05)，T400、T800處理下黃瓜幼苗的根表面積較CK分別降低20.92%、72.42%，均達到顯著水平(P<0.05)；T800處理下黃瓜幼苗的根平均直徑達到最大值，T200、T400、T800處理下黃瓜幼苗的根平均直徑較CK分別增加11.54%、 15.38%、23.08%，均達到顯著水平(P<0.05)；T50處理下黃瓜幼苗的根體積達到最大值，T50、T200處理下黃瓜幼苗的根體積較CK分別增加 39.39%、33.33%，均達到顯著水平(P<0.05)，T800處理下黃瓜幼苗的根體積較CK降低 63.64%，達到顯著水平(P<0.05)；CK處理下黃瓜幼苗的根尖數(shù)達到最大值，T200、T400、T800處理下黃瓜幼苗的根尖數(shù)較CK降低43.61%、 65.26%、69.51%，均達到顯著水平(P<0.05)。

表4 鎘脅迫下NaAlg與CaCl2混合添加對黃瓜幼苗根系形態(tài)Table 4 Root morphology of cucumber seedlings with use of mixed addition of NaAlg and CaCl2 under Cd stress

2.2 鎘脅迫下NaAlg與CaCl2混合添加黃瓜幼苗Cd2+積累的變化

黃瓜幼苗中的Cd2+主要集中在根系中，而莖、葉中的鎘含量未檢出。由表5可知，T200處理下黃瓜幼苗根Cd2+含量達到最小值，較CK減少 9.375%，達到顯著水平(P<0.05)，T100、T400、T800處理下黃瓜幼苗根Cd2+含量較CK分別增加21.79%、27.49%、104.02%，達到顯著水平 (P<0.05)。

表5 鎘脅迫下NaAlg與CaCl2混合添加黃瓜幼苗Cd2+積累Table 5 Cd2+ accumulation of cucumber seedlings under with use of mixed addition of NaAlg and CaCl2 Cd stress

2.3 鎘脅迫下NaAlg與CaCl2混合添加黃瓜幼苗Cd2+亞細胞分布的變化

隨著NaAlg與CaCl2添加量的增加，Cd2+脅迫下黃瓜幼苗地上部細胞壁、細胞器、細胞質以及地下部細胞器中的Cd2+含量均無檢出；而地下部細胞壁、細胞質的Cd2+含量均呈現(xiàn)先增加后減少再增加的趨勢。由表6可知，CK、T50、T100、T200、T400處理下黃瓜幼苗地下部亞細胞組分Cd2+含量均呈現(xiàn)細胞壁>細胞質>細胞器，而T800處理下地下部亞細胞組分Cd2+含量呈現(xiàn)細胞液>細胞壁>細胞器。T200處理下地下部細胞壁的Cd2+含量較CK降低31.82%，差異性不顯著 (P>0.05)，T400和T800處理下地下部細胞壁的Cd2+含量較CK分別增加277.68%和428.57%，達到顯著水平(P< 0.05)。

表6 鎘脅迫下NaAlg與CaCl2混合添加黃瓜幼苗Cd2+亞細胞分布Table 6 Distribution of Cd2+ cells in cucumber seedlings with use of mixed addition of NaAlg and CaCl2 under Cd stress

注：“─”表示Cd2+含量未檢出。

Note:“─” indicates the Cd2+content has not been detected.

2.4 鎘脅迫下NaAlg與CaCl2混合添加黃瓜幼苗膜保護酶活性的變化

由圖1-A可知，T50、T100、T200、T400、T800處理下黃瓜幼苗SOD活性較CK差異不顯著(P>0.05)；由圖1-B可知，POD活性隨著NaAlg與CaCl2添加量的增加呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，T400處理下黃瓜幼苗POD活性達到最大值。T100、T200、T400處理下黃瓜幼苗POD活性較CK分別增加41.79%、32.31%、115.61%，達到顯著水平(P<0.05)；由圖1-C可知，CAT活性隨著NaAlg與CaCl2添加量的增加呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，T200處理下黃瓜幼苗CAT活性達到最大值。T50、T100、T200、T400、T800處理下黃瓜幼苗CAT活性較CK分別增加40%、106.67%、 113.33%、73.33%、86.67%，達到顯著水平 (P<0.05)。

圖中不同小寫字母表示不同處理之間在0.05水平存在顯著性差異。下同

Different lowercase letters in the figure indicate significant differences among the different treatments at the 0.05 level. The same below

圖1 鎘脅迫下NaAlg與CaCl2混合添加黃瓜幼苗抗氧化酶活性
Fig.1 Activities of antioxidant enzymes in cucumber seedlings with use of mixed NaAlg and CaCl2under Cd stress

2.5 鎘脅迫下NaAlg與CaCl2混合添加黃瓜幼苗MDA含量的變化

如圖2所示，MDA含量隨著NaAlg與CaCl2添加量的增加呈現(xiàn)先減少后增加的趨勢，T400處理下黃瓜幼苗MDA含量達到最小值。T100、T200、T400和 T800處理下黃瓜幼苗MDA含量較CK分別減少26.76%、29.82%、46.42%和 20.74%，達到顯著水平(P<0.05)。

圖2 鎘脅迫下NaAlg與CaCl2混合添加黃瓜幼苗MDA含量Fig.2 MDA content in cucumber seedlings with use of mixed addition of NaAlg and CaCl2 under Cd stress

3 討 論

3.1 鎘脅迫下NaAlg與CaCl2混合添加對黃瓜幼苗生長的影響

黃瓜是中國主栽蔬菜品種之一[21]，以黃瓜為試驗材料能更好地反應NaAlg對土壤Cd污染修復效應。張振華等[22]研究表明鹽脅迫條件下植株相關生理指標的高低可直接反應出植株耐鹽脅迫能力的強弱。本試驗表明，在T50、T100、T200處理下黃瓜幼苗的株高、莖粗顯著增加，表明在這3個處理水平下黃瓜幼苗的耐Cd脅迫能力增強。葉綠素含量能表示植物在脅迫條件下光合作用的強弱[23]，本試驗表明，隨著NaAlg和CaCl2混合添加量的增加，黃瓜幼苗葉片的葉綠素含量呈現(xiàn)先減少再增加的趨勢，表明黃瓜幼苗光合作用的能力先減弱再增強，在T800處理下葉綠素含量最高，可能是形成老化苗的原因[24]，表明單純的憑葉綠素含量的高低并不能反映植株生長的好壞。生物量降低是鎘脅迫下植物最敏感的生理響應[25]，本試驗表明，地上部鮮質量、根鮮質量、地上部干質量、根干質量在T200處理下均達到最大值，表明在T200處理下黃瓜幼苗受到Cd2+的毒害作用最小。根系對地上部生長有重要影響[26]。本試驗表明，少量NaAlg和CaCl2混合添加會促進黃瓜幼苗根系生長，隨著NaAlg和CaCl2混合添加量的增加，黃瓜幼苗根系生長受到抑制，這與張瑛等[27]、李繼光等[28]、任艷芳等[29]研究結果基本一致。

3.2 鎘脅迫下NaAlg與CaCl2混合添加對黃瓜幼苗Cd2+積累及亞細胞分布的影響

Cd2+在植物組織的亞細胞分布特點，有助于更好地了解植物耐Cd2+機制[30]，彭秋等[31]研究表明辣椒細胞壁在Cd2+的區(qū)隔和抗性中起重要作用，鄒圓等[32]研究表明隨著Cd2+含量的增加細胞壁的鎘含量顯著增加，本試驗表明，黃瓜幼苗地上部亞細胞Cd2+含量無檢出，黃瓜根系Cd2+的亞細胞分布總趨勢為細胞壁>細胞液>細胞器，T200處理水平下根系細胞壁的Cd2+含量達到最小值，T800處理時根系細胞壁的Cd2+含量達到最大值，而此時的根系細胞液的Cd2+含量大于細胞壁的Cd2+含量，Sharma等[33]研究表明高含量的重金屬脅迫會造成根系細胞壁透性增大，細胞壁對重金屬的截留能力喪失，使得重金屬離子向細胞內遷移，這與本試驗研究一致。植物體內的重金屬含量和積累量是評價植物修復效果好壞的最直接指標[34]，本試驗研究表明，黃瓜幼苗中的Cd2+主要集中在根系中，莖、葉中的Cd2+含量較少。T200處理水平下根系Cd2+含量達到最小值，隨著NaAlg和CaCl2添加量的增加，根系的Cd2+含量也逐漸增加，這與施辰陽等[35]研究結果一致。

3.3 鎘脅迫下NaAlg與CaCl2混合添加對黃瓜幼苗膜保護酶活性及MDA含量的影響

抗氧化酶活性可以反映植物膜系統(tǒng)受損傷程度，SOD、POD和CAT均是植物受逆境脅迫時起防御作用的重要保護酶[36]，MDA作為植物體細胞膜脂過氧化的主要產物，在植物體受到外界鹽堿等逆境時，其含量會升高[37]。本試驗研究表明，隨著NaAlg和CaCl2添加量的增加，POD和CAT活性顯著增加，SOD活性的變化不顯著，MDA含量顯著減小，表明隨著NaAlg和CaCl2添加量的增加，黃瓜幼苗受到Cd2+的傷害程度顯著降低，這與楊若鵬等[38]的研究一致。