秦玉圣，白佳樺，田見暉，馮 濤，宋玉清，肖霖力，黃 正，翁士喬，劉 彥*

(1.北京市農(nóng)林科學院畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100097；2.中國農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，北京 100193；3.北京菲繁生物技術有限公司，北京 100142；4.寧波三生生物科技有限公司，浙江 寧波，315105）

生豬產(chǎn)業(yè)是我國畜牧業(yè)的重要支柱，我國不僅是世界上最大的豬肉生產(chǎn)國，同時也是最大的豬肉消費國。自2018年8月國內首次出現(xiàn)非洲豬瘟疫情后，其大面積迅速暴發(fā)，導致我國能繁母豬存欄急劇下降，對生豬產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟造成巨大損失。但通過此次疫情，國內的生豬生產(chǎn)理念正在得到根本轉變，生物安全防控意識得到空前提高，基于母豬定時輸精技術的批次化全進全出生產(chǎn)管理模式得到行業(yè)人員的更多關注。母豬定時輸精技術的實現(xiàn)前提是豬群發(fā)情周期同步化、卵泡發(fā)育同步化、排卵同步化和配種同步化，也就是既要發(fā)情周期的同步又要卵泡發(fā)育及排卵的同步。文章就母豬卵泡發(fā)育的同步化技術及其在定時輸精中的應用進行簡要介紹。

1 發(fā)情周期同步化

欲母豬卵泡發(fā)育同步化，首先需要確保其發(fā)情周期同步。經(jīng)產(chǎn)母豬哺乳期間，由于仔豬吮吸乳頭刺激促乳素的分泌，負反饋抑制促性腺激素釋放激素（GnRH）的釋放，使母豬卵泡靜止不發(fā)育，統(tǒng)一斷奶后，由于同時解除了對GnRH的抑制，經(jīng)產(chǎn)母豬發(fā)情周期也達到同步化。同樣，通過激素制劑調控也可實現(xiàn)母豬發(fā)情周期的同步化，例如對處在不同發(fā)情周期的后備母豬，通過連續(xù)14～18 d飼喂15～20 mg/d烯丙孕素的措施，能有效阻止卵泡發(fā)育，當停喂烯丙孕素后，后備母豬群可實現(xiàn)發(fā)情周期的同步化。

2 卵泡發(fā)育同步化

經(jīng)上述發(fā)情周期同步處理，依然存在母豬發(fā)情的個體差異較大，以及靜立發(fā)情、排卵較分散的問題，無法實現(xiàn)定時輸精，原因在于母豬卵泡發(fā)育尚未達到同步。

2.1 母豬卵泡發(fā)育尚未達到同步的原因

1）母豬斷奶后卵泡會呈現(xiàn)多種發(fā)育狀態(tài)。由于母豬個體差異比較明顯，卵泡發(fā)育速度千差萬別（圖1）。有的母豬斷奶時卵泡直徑較大，但在隨后的發(fā)育過程中生長速率卻相對較慢，從而在正常時間區(qū)間內發(fā)情。另有部分母豬斷奶時的卵泡直徑較大，但正在發(fā)生閉鎖，斷奶發(fā)情需要啟動新的卵泡波，因此，斷奶發(fā)情間隔變長，其發(fā)情時間晚于斷奶時卵泡較小的母豬。此外，還有一些母豬斷奶時直徑為5～6 mm的卵泡受到促黃體素（LH）的刺激，從卵泡閉鎖波中逃脫，這部分母豬斷奶發(fā)情間隔僅為3～4 d，并且快速進入排卵前階段[1]。由此可見，即使發(fā)情周期實現(xiàn)同步化，但卵泡發(fā)育仍然不同步。

2）母豬卵泡發(fā)育是受生殖激素的調控。母豬斷奶后往往受多種因素影響，會干擾LH等激素的分泌進而影響到卵泡的發(fā)育進程。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)產(chǎn)母豬斷奶前后釋放LH的模式不同，斷奶前表現(xiàn)為低頻高振幅，斷奶后則以高頻低振幅為特點（圖2）。

圖1 母豬斷奶-排卵期間卵泡直徑的變化（取自3～5個最大卵泡的平均直徑）；（A）初產(chǎn)母豬斷奶-排卵間隔（◇：小于 6 d；■：6-7 d；△：8-9 d；※：大于 10 d）；（B）經(jīng)產(chǎn)母豬斷奶-排卵間隔（▲：4 d；■：5 d；◆：6 d）

圖2 母豬斷奶前LH分泌模式（A）和斷奶后分泌模式（B）

圖3 B超實時超聲斷奶母豬巢卵泡生長圖像 A：母豬斷奶時卵泡直徑約3 mm； B：母豬斷奶后86～96 h卵泡直徑約6～8 mm（引自Sean O’Leary and Mark Nottle）

哺乳期間母豬能量負平衡會干擾LH的釋放模式，而卵泡發(fā)育、成熟與LH脈沖密切相關。尤其是初產(chǎn)母豬，斷奶時卵泡發(fā)育受LH影響較大，其斷奶時卵泡直徑平均約為2.5 mm，排卵時直徑達到7.0 mm。經(jīng)產(chǎn)母豬斷奶時卵泡發(fā)育受LH脈沖影響相對較小，斷奶、排卵時卵泡平均直徑分別為3.3 mm 和 8.0 mm[2]（圖 3）。

2.2 促卵泡發(fā)育的激素制劑研發(fā)應用

卵泡發(fā)育是復雜的生物學事件，定時輸精需使卵泡發(fā)育同步化，但是不同生殖激素發(fā)揮著不同的作用。研究表明用純化后的促卵泡素（FSH）、LH每8 h處理一次母豬，連續(xù)處理64 h后發(fā)現(xiàn)，經(jīng)FSH處理的母豬卵巢上3～6 mm的竇狀卵泡數(shù)量很多，但直徑均沒有突破6 mm。經(jīng)LH處理的母豬卵巢卵泡數(shù)量雖然少，但已達到排卵卵泡直徑標準7～9 mm，這說明FSH可以增加中等卵泡的數(shù)量（卵泡募集），但卵泡進一步生長、發(fā)育則需要LH的刺激（卵泡優(yōu)勢化）。

為使母豬卵泡發(fā)育達到同步此，可采用外源性促性腺激素對卵泡發(fā)育進行調控。目前，刺激卵泡發(fā)育的常見激素有孕馬血清（PMSG/eCG）、PG600、以及GnRH的激動劑等。

PMSG屬于糖蛋白，其兼有FSH和LH的活性，但以FSH活性為主，在刺激卵泡同步發(fā)育方面具有很好的效果。研究表明經(jīng)產(chǎn)母豬斷奶后24 h注射500～750 IU的PMSG能促使母豬卵泡同步發(fā)育，后備母豬和初產(chǎn)母豬由于內源性LH濃度較低，在應用PMSG促進母豬卵泡發(fā)育時劑量需增加到900～1 000 IU，停喂烯丙孕素后40 h肌肉注射1 000 IU的PMSG可促進卵泡同步發(fā)育。雖然PMSG促進卵泡發(fā)育取得較好的效果，但國內外研究認為PMSG產(chǎn)品批次之間生物活性差異很大，導致應用效果不穩(wěn)定，因此，除了在生產(chǎn)提取工藝上對PMSG進行純化外，PMSG與人絨毛膜促性腺激素（hCG）等激素組合也被用于研究母豬卵泡同步發(fā)育。

PG600是由400 IU的PMSG和200 IU的hCG組成，研究顯示PG600處理母豬不僅可縮短斷奶發(fā)情間隔，卵泡發(fā)育速度也更快、斷奶后同一時間點卵泡直徑更大。PG600處理泌乳母豬時，雖然能刺激卵泡發(fā)育至排卵前階段，但斷奶發(fā)情間隔顯著延長。并且，可能是由于hCG具有LH效應，兩者組合使用引起一定比例的卵泡囊腫或黃體化。研究表明，當PMSG、hCG劑量分別從400 IU增加到700 IU、200 IU增加到350 IU時，母豬卵巢囊腫病變率由36%升至88%，同時妊娠率顯著下降。德國經(jīng)過大量試驗表明，經(jīng)純化凍干后的PMSG粉劑用于刺激卵泡發(fā)育時，母豬受胎效果要顯著優(yōu)于PMSG和hCG的聯(lián)合制劑。

GnRH的激動劑如Maprelin也可以用于刺激卵泡同步發(fā)育，并被認為是PMSG的替代品。Maprelin注射閹豬時表現(xiàn)出FSH活性，研究表明其用于刺激初產(chǎn)、經(jīng)產(chǎn)母豬時卵泡發(fā)育、配種受胎率等指標與PMSG相當。hCG也能夠促進卵泡的發(fā)育，但配種后母豬受胎率受到一定的影響。目前，誘導母豬卵泡同步發(fā)育研究及應用方面，依然以PMSG為主。

3 卵泡排卵同步化

自然條件下，母豬排卵持續(xù)時間長達6 h，這使部分卵子在與精子相遇前，已經(jīng)失去受精能力或死亡，輸精時間不當將直接影響配種受胎率，所以，排卵同步化對于定時輸精的成敗至關重要。PMSG等促性腺激素雖然可實現(xiàn)母豬卵泡發(fā)育同步化，但母豬個體之間受品種、胎次、管理等因素影響，發(fā)情差異較大、排卵前LH峰出現(xiàn)時間不一致、排卵時間分散。為使母豬排卵時間更集中，通常需要在注射PMSG基礎上再注射促排卵激素進行處理，最終實現(xiàn)卵泡發(fā)育及排卵的同步化，為精準定時輸精建立基礎（圖4）。

在排卵的啟動中，GnRH起到了關鍵的調控作用。生理條件下，卵泡分泌的雌激素正反饋作用于下丘腦釋放GnRH刺激垂體，促進LH的分泌并達到排卵前LH峰值，引發(fā)卵泡破裂排卵。GnRH是由10個氨基酸組成的十肽，第1-4位氨基酸和第9-10位氨基酸高度保守，但第6和第7位、第9和第10位氨基酸之間的肽鍵極易被裂解酶分解斷裂，因此，GnRH在體內極易失活。為提高GnRH的穩(wěn)定性，人工合成了一系列GnRH類似物，如曲普瑞林、布舍瑞林、戈舍瑞林、亮丙瑞林、那法瑞林等等（如圖5）。

目前某些GnRH類似物已在國外進行試驗研究[3]，并且部分結果表明，GnRH或其類似物可誘導內源性排卵前LH峰的出現(xiàn)，降低發(fā)情排卵間隔變異，用于母豬排卵同步化處理（圖6）。

3.1 曲普瑞林誘導母豬同步排卵

2000年，kraeling研究發(fā)現(xiàn)曲普瑞林能夠誘導雌激素處理的后備母豬出現(xiàn)LH峰，隨后Baer進一步確認曲普瑞林能夠誘導母豬排卵。目前，針對曲普瑞林研究較多的是將其制成凝膠狀，并通過特殊注射器定量將藥物置于母豬陰道，經(jīng)黏膜吸收刺激母豬排卵（如圖7）。

圖4 性周期同步化母豬在PMSG、GnRH處理后達到排卵同步化

圖5 GnRH類似物及其分子結構模式圖

Knox將曲普瑞林凝膠注入母豬陰道篩選給藥時間和劑量[4]。發(fā)現(xiàn)200 μg曲普瑞林處理后48 h可使81%的母豬排卵。進一步研究發(fā)現(xiàn)，在斷奶后72 h、84 h、96 h的不同時間點給予200 μg曲普瑞林陰道凝膠，結果顯示處理后40 h，3組母豬排卵比例分別達到56.5%、62.2%和13%；處理后48 h，3組母豬排卵比例均達到64%，同時，自然發(fā)情對照組僅有34%母豬出現(xiàn)排卵，此試驗說明母豬斷奶后96 h給予200 μg曲普瑞林凝膠能使母豬排卵更集中。進一步分析發(fā)現(xiàn)，斷奶96 h陰道凝膠處理組母豬斷奶排卵間隔顯著縮短，妊娠率、分娩率達到自然狀態(tài)下母豬發(fā)情鑒定、適時輸精生產(chǎn)的水平。試驗中，雖然72 h、84 h處理后母豬排卵提前至少10 h，但采用人工輸精后，兩組配種妊娠率顯著降低20%～50%，分娩率降低30%～50%，其可能原因是激素處理時間較早，此時卵子尚未徹底成熟，曲普瑞林誘發(fā)LH峰后卵泡提前排卵，導致輸精后精子未能與卵子在合適的時間完成受精，也可能是未成熟的卵子受精后胚胎質量較低，在早期發(fā)育階段死亡。

后備母豬經(jīng)烯丙孕素處理達到發(fā)情周期同步化[5]，間隔120 h，分別用 100 μg、200 μg、400 μg 曲普瑞林凝膠誘導其排卵，發(fā)現(xiàn)在處理后48 h母豬集中排卵，其中以200 μg劑量組誘導排卵集中度最高（圖8）。進一步研究發(fā)現(xiàn)，停喂烯丙孕素后96 h、120 h、144 h給予200 μg曲普瑞林處理，結果發(fā)現(xiàn)120 h處理組母豬24～48 h內排卵比例達到80%，有效促進后備母豬的同步排卵。

3.2 布舍瑞林誘導母豬同步排卵

布舍瑞林作為GnRH的類似物，在誘導母豬同步排卵方面也獲得較多的關注。研究表明，母豬斷奶時肌肉注射600 IU的PMSG，間隔90 h后注射布舍瑞林，并在30 h后進行第一次配種，結果發(fā)現(xiàn)能夠顯著縮短母豬斷奶到排卵的間隔，并且在布舍瑞林處理后32 h，排卵母豬比例達到95%以上。當僅用布舍瑞林處理斷奶母豬時，斷奶排卵間隔雖然也能顯著縮短，但效果不如與PMSG聯(lián)合使用。在另一項研究中發(fā)現(xiàn)，大白母豬斷奶后94 h、104 h肌肉注射布舍瑞林，結果顯示，斷奶94 h布舍瑞林處理后32～56 h內排卵母豬比例達到100%，而104 h、以及自然發(fā)情組排卵母豬比例分別僅有66.7%、68.7%，說明布舍瑞林注射時間點的選擇對母豬排卵同步化至關重要。目前，國內獸藥企業(yè)正在積極開發(fā)布舍瑞林相關藥物，但其應用于定時輸精程序仍需要結合大量生產(chǎn)數(shù)據(jù)進行分析優(yōu)化研究。

圖6 GnRH類似物單獨或與PMSG連用對母豬排卵前LH峰的影響（引自Sean O’Leary and Mark Nottle）

圖7 曲普瑞林凝膠陰道給藥模式圖

圖8 后備母豬曲普瑞林凝膠陰道給藥劑量篩選

3.3 其他促性腺激素誘導母豬同步排卵

hCG作為LH的類似物，可直接作用于卵巢。20世紀70年代初，東歐部分國家已經(jīng)在用PMSG預處理母豬后，注射hCG誘導排卵，并且85%～90%的母豬在處理后42 h發(fā)生排卵。pLH是豬促黃體生成素，與hCG作用原理一致，研究表明母豬斷奶時注射600 IU PMSG，間隔80 h后注射5 mg pLH，通過B超監(jiān)測排卵時間結果發(fā)現(xiàn)母豬在34.25～42.5 h后發(fā)生排卵，平均排卵時間為38.2 h。但由于這些激素存在一定的副作用，或提取困難、成本高等缺點，逐漸被市場上其他促排藥物代替。

就目前各種促排激素制劑而言，與其他蛋白類誘導排卵激素制劑如hCG、LH相比，GnRH及其類似物能夠刺激內源性LH的分泌，并且具有低毒、代謝快、價格低等優(yōu)點，同時GnRH屬于小分子，重復使用不會引起機體產(chǎn)生抗體，安全性高，因此，獲得越來越多的關注。

4 卵泡發(fā)育同步化在定時輸精中的應用

事實上，母豬發(fā)情周期、卵泡發(fā)育及排卵同步化調控效果與豬場管理、母豬品種、激素制劑效價及穩(wěn)定性等密切相關。近幾年，豬場批次化生產(chǎn)在國內引起了高度關注，不少豬場開始建立三周批次、四周批次等批次化模式生產(chǎn)，先期嘗試引入國外的簡式或精準定時輸精程序，但是出現(xiàn)了諸多效果不一的問題，有人甚至對定時輸精技術產(chǎn)生了疑問。為此，國內一些高校、科研單位、動物制藥企業(yè)與養(yǎng)豬企業(yè)相繼開展了定時輸精技術的研發(fā)與生產(chǎn)試驗。其中，全國豬定時輸精協(xié)作組在國家重點研發(fā)計劃等項目支持下，結合我國實際生產(chǎn)及豬場管理情況，開展了較為系統(tǒng)的定時輸精程序的優(yōu)化研究。通過許多次探索研究，項目組成功將B超技術應用于母豬卵泡的動態(tài)檢查，以直觀呈現(xiàn)卵巢對激素制劑處理的應答效應，直接應用生產(chǎn)中開展定時輸精程序優(yōu)化的研究。借助B超技術對定時輸精的激素制劑處理后的卵泡發(fā)育實時檢查分析[6]，不斷進行激素制劑使用與輸精時機的調整，通過生產(chǎn)試驗建立了母豬發(fā)情促排模式的定時輸精程序（圖9上）；另外，在前期精準式程序基礎上優(yōu)化出了兩點式查情定時輸精程序（圖9下）。

圖9 發(fā)情促排定時輸精程序（上）、兩點式查情定時輸精（下）

經(jīng)過多個規(guī)?；i場連續(xù)多批次的生產(chǎn)應用，優(yōu)化的定時輸精程序在生產(chǎn)中取得了較穩(wěn)定的生產(chǎn)效果，顯著提高了批次母豬的受胎率、分娩率與利用率，母豬利用率的提高也為批次化生產(chǎn)中母豬群周轉安排提供了方便，促進了豬場批次化生產(chǎn)的整體效率提高，有效推動我國規(guī)?；i場連續(xù)式生產(chǎn)向批次化生產(chǎn)的轉變。