曹正艷　唐寧　陳澤雄　婁娟

摘要：以灰氈毛忍冬（Lonicera macranthoides Hand.-Mazz）組培苗為試驗(yàn)材料，用雙抗體一步夾心酶聯(lián)免疫法測定灰氈毛忍冬生根誘導(dǎo)過程（0、6、12、18、24、30 d）中生長素（IAA）、脫落酸（ABA）、赤霉素（GA3）、玉米素核苷（ZR）含量的變化。結(jié)果表明，ABA含量呈先上升后下降的趨勢;IAA、GA3和ZR含量均呈先下降后上升的趨勢。IAA、GA3含量和IAA/ABA比值與生根率呈顯著或極顯著正相關(guān)，ABA含量與生根率呈負(fù)相關(guān)，ZR含量與生根率相關(guān)性不顯著。

關(guān)鍵詞：灰氈毛忍冬（Lonicera macranthoides Hand.-Mazz）;組織培養(yǎng);內(nèi)源生長調(diào)節(jié)劑;生根誘導(dǎo)

中圖分類號：S722.8;Q949.781.2? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2020）02-0110-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.02.023? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Changes of endogenous growth regulators during roots of tissue culture

seedlings of Lonicera macranthoides Hand.-Mazz

CAO Zheng-yan1，TANG Ning1，2，CHEN Ze-xiong1，2，LOU Juan1，2

（1.Institute of Special Plants，Chongqing University of Arts and Sciences，Chongqing 402160，China;

2.Collaborative Innovation Center of Special Plant Industry in Chongqing，Chongqing 402160，China）

Abstract： The tissue culture seedlings of Lonicera macranthoides Hand.-Mazz were used as experimental materials，the changes of the content of indole-3-acetic acid （IAA）， abscisic acid （ABA）， gibberellic acid （GA3）， and zeatin nucleoside （ZR） in the root-inducing process （0，6，12，18，24，30 d） were determined by the method of enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）. The results showed that the content of ABA was increased initially and then decreased. The concentrations of IAA， GA3 and ZR displayed the opposite trends， which were decreased firstly and subsequently increased. The contents of IAA and GA3 and the ratio of IAA to ABA were significant or extremely significant positively correlated with rooting rates， while ABA contents were negatively correlated with rooting rates， and there was no significant correlation between ZR content and rooting rate.

Key words： Lonicera macranthoides Hand.-Mazz; tissue culture; endogenous growth regulators; root induction

植物內(nèi)源生長調(diào)節(jié)劑（Plant pytohormones）是植物體內(nèi)自身合成并在低濃度（小于1 μmol/L）下就能調(diào)節(jié)植物自身生理過程的微量有機(jī)物質(zhì)[1]，其不僅影響植物細(xì)胞的分裂、生長和分化，還影響植物的發(fā)芽和生根等[2]。

灰氈毛忍冬（Lonicera macranthoides Hand.-Mazz）別名山銀花，屬于忍冬科忍冬屬常綠藤本植物，具有清熱解毒、抗菌消炎的功效，在中醫(yī)臨床及民間廣泛應(yīng)用于癰腫疔瘡、喉痹、丹毒、熱毒血痢、風(fēng)熱感冒、溫?zé)岚l(fā)病等疾病的治療，是中國藥典規(guī)定的名貴中藥材之一[3]?；覛置潭侵貞c武陵山區(qū)脫貧致富的重要載體，目前該藥材繁殖主要采用人工扦插方式，但生根率極低。近年來，組織培養(yǎng)已成為灰氈毛忍冬苗木繁殖的重要方式之一，但其組培苗生根率不高的問題制約了種苗的規(guī)模化生產(chǎn)。研究表明，忍冬屬的生根機(jī)制與其內(nèi)源生長調(diào)節(jié)劑相關(guān)[4]，但目前尚未見灰氈毛忍冬組培苗生根過程中內(nèi)源生長調(diào)節(jié)劑變化的研究報(bào)道。

本試驗(yàn)采用雙抗體一步夾心酶聯(lián)免疫法測定灰氈毛忍冬組培苗生根過程中內(nèi)源生長調(diào)節(jié)劑的變化，并分析了生長調(diào)節(jié)劑變化與生根率的相關(guān)性，明確了灰氈毛忍冬的生根率與生長素（IAA）、脫落酸（ABA）、赤霉素（GA3）、玉米素核苷（ZR）的關(guān)聯(lián)度，以期為外源生長調(diào)節(jié)劑在灰氈毛忍冬組培苗生根中的使用提供科學(xué)依據(jù)，為灰氈毛忍冬工廠化育苗提供技術(shù)指導(dǎo)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 材料? 以灰氈毛忍冬渝蕾1號組培苗為試驗(yàn)材料，選取生長健壯、高度基本一致（4～5 cm）的繼代苗（苗齡1個(gè)月）接種到生根培養(yǎng)基中（1/2MB+3.0 mg/L IBA+0.1 mg/L IAA+100.0 mg/L活性炭），每瓶接種8株組培苗。培養(yǎng)溫度為（25±1） ℃，光照時(shí)間為12 h/d，光照度為2 000～3 000 lx。分別于培養(yǎng)0、6、12、18、24、30 d后取樣，以0 d為對照，每個(gè)取樣處理重復(fù)3次，每次取樣40株。

取樣前統(tǒng)計(jì)組培苗的生根性狀指標(biāo)，包括生根率、莖段直徑和平均根長。同時(shí)取距離培養(yǎng)基表面2 cm處的莖段于液氮中速凍保存，用于測定IAA、ABA、GA3、ZR的含量。

1.1.2? 主要試劑及儀器

1）試劑：甲醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇均為色譜純;NaOH、HCl、PBS緩沖液等，均為國產(chǎn)分析純。

2）儀器：德國IKA RV10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、美國MD SpectraMax iD3多功能酶標(biāo)儀、湘儀H1650離心機(jī)、Eppendorf移液槍等。

1.2? 試驗(yàn)方法

1.2.1? 內(nèi)源生長調(diào)節(jié)劑的提取? 參照齊永平等[5]內(nèi)源生長調(diào)節(jié)劑的提取方法，略有改變。稱取1.00 g灰氈毛忍冬組培苗莖段，將每個(gè)莖段剪成小段，用液氮研磨成粉末，全部轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中。將4 ℃預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)為80%的甲醇溶液加入勻漿中，冷浸（4 ℃）避光提取12 h離心，離心后取上清液，重復(fù)2次，將上清液混合。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將濾液減壓蒸發(fā)（36～38 ℃）至原體積的1/2。加入2 mL石油醚提取部分色素，棄掉石油醚層，繼續(xù)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至原體積的1/3，IAA、ABA、GA3、ZR存在于該水溶液中。用HCl將水溶液pH調(diào)至2.5～2.8，用等體積的乙酸乙酯萃取，使水相和乙酸乙酯相分離，重復(fù)上述步驟2次后合并乙酸乙酯相。此時(shí)水溶液可用于測定ZR的含量，ABA、GA3、IAA存在于乙酸乙酯相中。用NaOH將其pH調(diào)至8.0，再加入等體積的正丁醇溶液萃取2次，并將所有的正丁醇合并。再將乙酸乙酯相和正丁醇相分別在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上36～38 ℃減壓蒸干。最后加入PBS緩沖液溶解定容至5 mL，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2? 內(nèi)源生長調(diào)節(jié)劑的測定? 用酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）試劑盒（博海生物工程開發(fā)有限公司），在酶標(biāo)板分別設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、空白孔和樣本孔，嚴(yán)格按照說明書操作，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并徹底洗滌。用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光度（OD），計(jì)算樣品濃度。

1.2.3? 數(shù)據(jù)分析? 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對灰氈毛忍冬組培苗生根過程中的生根性狀和各類生長調(diào)節(jié)劑含量進(jìn)行方差分析和相關(guān)性分析。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 灰氈毛忍冬組培苗不定根形成

試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，灰氈毛忍冬組培苗不定根的形成大致可劃分為3個(gè)階段（圖1）：第一階段為0～6 d，大部分灰氈毛忍冬組培苗產(chǎn)生愈傷組織;第二階段為6～12 d，愈傷組織繼續(xù)生長，不定根開始伸出;第三階段為12～30 d，不定根繼續(xù)伸長。

2.2? 灰氈毛忍冬組培苗不同時(shí)期的生根性狀

由表1可知，灰氈毛忍冬組培苗生根率隨時(shí)間的推移而增加。培養(yǎng)前6 d灰氈毛忍冬生根率為0，6～12 d逐漸開始生根，12～24 d生根率變化最大，培養(yǎng)30 d時(shí)生根率達(dá)100.0%;灰氈毛忍冬生根過程中莖段直徑變化無顯著差異。對根的長度而言，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，灰氈毛忍冬組培苗平均根長逐漸增加，30 d時(shí)平均值最長為28.188 mm，且與其他時(shí)期的平均根長存在顯著差異。

2.3? 灰氈毛忍冬組培苗生根過程中的內(nèi)源生長調(diào)節(jié)劑含量

2.3.1? 灰氈毛忍冬組培苗生根過程中內(nèi)源IAA含量的變化? 由圖2可知，灰氈毛忍冬組培苗生根過程中IAA含量呈先下降后上升的趨勢。6 d時(shí)，IAA含量最低，為14.928 ng/g;30 d時(shí)，IAA含量最高，為16.120 ng/g。在0～30 d的培養(yǎng)過程中，灰氈毛忍冬組培苗內(nèi)源IAA含量無顯著差異。

2.3.2? 灰氈毛忍冬組培苗生根過程中內(nèi)源ABA含量的變化? 由圖3可知，灰氈毛忍冬組培苗生根過程中內(nèi)源ABA的含量呈上升-降低-上升的趨勢。開始生根培養(yǎng)時(shí)，ABA含量達(dá)24.106 ng/g，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長含量逐漸增加，在6 d時(shí)含量達(dá)到最高，為27.876 ng/g，且與18、24、30 d的含量存在顯著差異。自6 d以后ABA含量一直隨著生根天數(shù)的增加而遞減，在24 d時(shí)，ABA含量最低，為18.646 ng/g。12、18、24、30 d的ABA含量無顯著差異。

2.3.3? 灰氈毛忍冬組培苗生根過程中內(nèi)源GA3含量的變化? 如圖4所示，0～6 d為灰氈毛忍冬組培苗愈傷組織的產(chǎn)生階段，此階段GA3含量在下降，但2個(gè)時(shí)間點(diǎn)含量間差異不顯著，隨后灰氈毛忍冬組培苗GA3含量隨時(shí)間延長呈上升趨勢，即GA3含量在愈傷組織的誘導(dǎo)時(shí)期和不定根的形成及伸長時(shí)期呈上升趨勢。12、18、24 d的GA3含量差異不顯著，但培養(yǎng)30 d后的GA3含量與0、6 d的GA3含量均存在顯著差異。

2.3.4? 灰氈毛忍冬組培苗生根過程中內(nèi)源ZR含量的變化? 由圖5可知，灰氈毛忍冬組培苗ZR含量變化呈不規(guī)則的形狀，開始培養(yǎng)時(shí)ZR含量最高，達(dá)1.794 ng/g，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長含量逐漸下降，12 d時(shí)ZR含量為最低，為1.712 ng/g;隨后ZR含量逐漸升高，30 d時(shí)的含量為1.762 ng/g。整個(gè)生根過程中各時(shí)期之間ZR含量差異不顯著。

2.3.5? 灰氈毛忍冬組培苗生根過程中IAA/ABA比值的變化? 灰氈毛忍冬組培苗生根過程中IAA/ABA比值的變化如圖6所示。IAA/ABA比值從開始培養(yǎng)一直下降，6 d時(shí)下降到最低，僅為0.536，然后逐漸上升，尤其是6～12 d期間上升速度很快，24 d時(shí)上升到最高，為0.851，繼續(xù)培養(yǎng)至30 d，其比值稍有下降。

2.4? 灰氈毛忍冬組培苗生根過程中內(nèi)源生長調(diào)節(jié)劑與生根率的相關(guān)性分析

由表2可知，灰氈毛忍冬的生根率與莖段的內(nèi)源生長調(diào)節(jié)劑變化密切相關(guān)?；覛置潭纳逝c莖段的IAA含量、IAA/ABA比值及GA3含量均呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.870、0.845、0.925，相關(guān)度較高;灰氈毛忍冬的生根率與莖段的ABA含量相關(guān)系數(shù)為-0.780，因此二者呈負(fù)相關(guān);莖段的ZR含量與灰氈毛忍冬組培苗的生根率相關(guān)性不高。

3? 討論與結(jié)論

3.1? 討論

3.1.1? IAA對生根率的影響? IAA的含量在植物不定根的伸長過程中起重要的促進(jìn)作用，即IAA能促進(jìn)植物細(xì)胞分裂，誘導(dǎo)植物愈傷組織的產(chǎn)生，對植物根的形成有促進(jìn)作用[6，7]?；覛置潭M培苗開始培養(yǎng)時(shí)IAA含量下降，這可能是組培苗在生根初期受到切傷所導(dǎo)致的。從6 d開始上升，直到生根18 d時(shí)不定根的發(fā)生伴隨著IAA含量達(dá)到峰值，這可能是在灰氈毛忍冬組培苗生根過程中積累的高濃度IAA對不定根的萌發(fā)產(chǎn)生了促進(jìn)作用。18 d以后IAA含量先降低后升高，可能是根的伸長消耗了部分內(nèi)源IAA，后又因?yàn)樾赂龊笾仓曜陨砗铣闪藘?nèi)源IAA，從而使總的IAA含量上升。

3.1.2? ABA對生根率的影響? ABA有利于植株體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的積累運(yùn)輸，是植物體內(nèi)天然的抑制性植物生長調(diào)節(jié)劑，對植物的生根非常重要[8]。在灰氈毛忍冬組培苗生根初期，可能是由于離體切割刺激ABA的形成使組培苗內(nèi)的ABA含量上升，6～24 d都呈降低趨勢，所以愈傷組織和不定根的形成都與低的ABA含量有關(guān)，但生根24 d后，ABA含量又呈上升趨勢，可能是由于組培苗到生根后期植株所在的培養(yǎng)基里的養(yǎng)分不足，不能為植株的生長提供營養(yǎng)，長勢開始變緩，促使ABA含量上升。

3.1.3? GA3對生根率的影響? 一般認(rèn)為GA3對細(xì)胞分裂和伸長具有促進(jìn)作用[9]，筆者認(rèn)為GA3的含量與生根苗的生根率呈正相關(guān)，這與張雪等[4]的研究結(jié)論一致，可能是GA3含量的增加，增強(qiáng)了植株蛋白質(zhì)和淀粉等有機(jī)物的水解，因而促進(jìn)了植株不定根的生成。但其他研究結(jié)果顯示，GA3是不定根形成的抑制劑[10]，這可能與物種相關(guān)，有待進(jìn)一步探討。

3.1.4? ZR對生根率的影響? 結(jié)果表明，灰氈毛忍冬組培苗生根誘導(dǎo)0～12 d，ZR的含量呈現(xiàn)下降趨勢。這是組培苗愈傷組織和不定根的形成時(shí)期，12 d時(shí)不定根已經(jīng)形成，由此推斷低濃度的ZR對生根起到了一定的促進(jìn)作用，這與姚銳[11]對北美香柏的研究結(jié)果相一致，但整個(gè)生根培養(yǎng)期間，ZR的含量差異不顯著。

3.1.5? IAA/ABA比值對生根率的影響? 生長調(diào)節(jié)劑IAA對植物生根的作用具有兩重性，在一定的濃度范圍內(nèi)能促進(jìn)根細(xì)胞核和器官的伸長，但I(xiàn)AA的抑制作用也會伴隨著濃度進(jìn)一步增加而產(chǎn)生;而生長調(diào)節(jié)劑ABA是通過抑制生長調(diào)節(jié)劑IAA向發(fā)生作用部位的運(yùn)輸和植株離體器官的生長進(jìn)而抑制不定根的形成[12]。ABA和IAA的含量變化呈相反的趨勢，即在根源基啟動（6 d）時(shí)IAA含量降到最低，而ABA上升到最高，這種趨勢與董寧光等[13]、何崇單等[14]的觀點(diǎn)基本一致。盡管兩者的相關(guān)性和趨勢不同，但I(xiàn)AA/ABA比值的大小在不同生根時(shí)期具有不同的促進(jìn)作用。由此可以認(rèn)為，只有當(dāng)其比例達(dá)到一定的平衡時(shí)才對植株的生根有利，這與前人的研究結(jié)論相同[15]。

3.2? 結(jié)論

灰氈毛忍冬組培苗生根過程中IAA含量呈先下降后上升的趨勢;ABA含量呈先上升后下降的趨勢;GA3和ZR含量都呈先下降后上升的趨勢;IAA/ABA比值變化為下降-上升的趨勢。IAA、GA3含量和IAA/ABA比值與生根率呈正相關(guān)，ABA含量與生根率呈負(fù)相關(guān)，ZR含量與生根率相關(guān)性較低。

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收稿日期：2019-03-20

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31770338）;重慶市科學(xué)技術(shù)局基礎(chǔ)科學(xué)與前沿研究重點(diǎn)項(xiàng)目（cstc2017jcyjBX0026）

作者簡介：曹正艷（1998-），女，重慶人，在讀本科生，研究方向?yàn)橹参锎紊x，（電話）15023401291（電子信箱）1583913991@qq.com;通信作者，

婁? 娟（1981-），女，河南新鄉(xiāng)人，教授，碩士，主要從事植物景觀及應(yīng)用研究，（電話）15922731580（電子信箱）165402500@qq.com。