王曉穎，王夏英，邱梁楨，歐陽惠枝，徐 偉

（福建中醫(yī)藥大學藥學院，福州350122）

聚合物膠束是由兩親性高分子聚合物在水中自組裝而成的，具有殼-核結(jié)構(gòu)的納米遞藥載體。其疏水內(nèi)核能增溶難溶性藥物；其親水性外殼能提高其在水溶液中的穩(wěn)定性，保護藥物，減少其在體內(nèi)被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)識別從而降低被快速清除的機率；其納米級粒徑，利于其攜帶藥物利用腫瘤血管的高通透性通過增強滲透滯留效應（EPR）被動靶向腫瘤部位［1-2］。

載藥聚合物膠束的抗腫瘤活性研究對預測其臨床藥效具有重要意義，一直受到研究者關(guān)注。而體外細胞研究為其抗腫瘤活性及其機制研究奠定了研究基礎［3］。本課題組前期用水溶性、生物相容性良好、可降解的羧甲基殼聚糖（carboxymethyl chitosan，CMCS）與具有抗炎、抗腫瘤、抗腫瘤血管生成的中藥有效成分大黃酸（rhein，R）合成了兩親性的羧甲基殼聚糖-大黃酸偶聯(lián)物（CR偶聯(lián)物）［4］，作為難溶性藥物遞送載體材料，并制備了載抗腫瘤藥物紫杉醇（paclitaxel，PTX）的CR偶聯(lián)物膠束（PTX／CR偶聯(lián)物膠束），本研究對其MCF-7細胞毒性及其細胞攝取進行研究，為其進一步抗腫瘤研究提供依據(jù)。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

紫杉醇（上海中西三維藥業(yè)有限公司）；CR偶聯(lián)物（自制，大黃酸物質(zhì)的量取代度為7.2%），P4熒光探針由上海復旦大學自制提供。透析袋（MWCO14000，上海綠鳥科技發(fā)展有限公司）；磷酸鹽緩沖液（1×）、0.25%胰蛋白酶（1×）、青霉素鏈霉素溶液（美國HyCloneTM公司）；胎牛血清、人重組胰島素（美國Sigma公司）；四甲基偶氮唑藍（德國BioFroxx公司）；MEM、Glutamax、非必需氨基酸（100×）（美國 Invitrogen公司）；Hoechst 33342（中國美侖生物公司），其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀 器

Zetasizer Nano ZS90型激光粒度儀（英國Malvern公司）；ESCALAB 250型X射線光電子能譜儀（美國VG公司）；Infinite M200 PRO多功能酶標儀（瑞士Tecan公司）；LSM710型激光共聚焦顯微鏡（德國蔡司公司）；MS105DU十萬分之一電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；JY92-2D超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；ALPHA1-2 LD冷凍干燥機（德國Christ公司）。

1.3 細胞株

乳腺癌MCF-7細胞株（中國科學院細胞庫）。

2 方 法

2.1 PTX／CR偶聯(lián)物膠束的制備與表征

2.1.1 PTX／CR偶聯(lián)物膠束的制備［5］本課題組前期完成了透析法對PTX／CR偶聯(lián)物膠束載藥方法的考察，具體為:7 mg／mL CR偶聯(lián)物水溶液2.6 mL，加入含30 mg／mL PTX的乙醇溶液430μL，攪拌20 min，冰水浴探頭超聲30 min，蒸餾水透析12 h，冰水浴探頭超聲20 min，0.8μm濾膜過濾，冷凍干燥，得PTX／CR偶聯(lián)物膠束。并以HPLC法測得PTX／CR偶聯(lián)物膠束的載藥量為32%。動態(tài)激光散射法（DLS）測得PTX／CR偶聯(lián)物膠束的平均粒徑為（187.8±1.0）nm，PDI為（0.13±0.03）（n＝3），其 Zeta電位為（-31.5±4.2）mV（n＝3）。

2.1.2 X射線衍射（XRD） 將PTX、CR偶聯(lián)物、CR偶聯(lián)物＋PTX的物理混合物、PTX／CR偶聯(lián)物膠束分別置于樣品槽內(nèi)，以5°／min的速度掃描，掃描的角度范圍為3°～45°。測試電壓及電流分別為20 kV、20 mA，發(fā)射源為Cu-Kα。

2.2 細胞毒實驗

取對數(shù)生長期的MCF-7細胞，消化后調(diào)整細胞懸浮液至每毫升含5×104個細胞，向96孔板中每個孔各加入該細胞懸浮液100μL，培養(yǎng)箱中孵育24 h使其貼壁，吸去培養(yǎng)液。設置不同分組:Cremophor EL-無水乙醇混合溶劑（1∶1）組、CR偶聯(lián)物組、Taxol?組、PTX／CR偶聯(lián)物膠束組、空白組和正常對照組。向96孔板中加入上述各組受試液各150μL，Taxol?組和PTX／CR偶聯(lián)物膠束組分別含 PTX濃度為 1、5、10、50、100、500、1 000 nmol／L 6種不同濃度，Cremophor EL-無水乙醇混合溶劑（1∶1）組和CR偶聯(lián)物組按上述Taxol?組和PTX／CR偶聯(lián)物膠束組所含的溶劑或載體量計算，以上每個濃度平行6個孔，以不含細胞的培養(yǎng)基和MTT溶液作為空白組，含細胞不給藥物的細胞作為正常對照組，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。

分別于加藥后24和48 h，將培養(yǎng)板取出，每孔各加入0.5 mg／mL MTT溶液100μL，37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h后取出，小心吸取上清液。每孔各加入DMSO 150μL溶解藍紫色結(jié)晶物。用酶標儀在570 nm處測定吸收度（A）。并根據(jù)各孔的吸收度，按公式（1）計算細胞的存活率:

2.3 細胞攝取實驗

2.3.1 共載P4和PTX的CR偶聯(lián)物膠束的制備

稱取CR偶聯(lián)物18 mg，加蒸餾水2.6 mL室溫下冰水浴探頭超聲10 min使其充分溶解。稱取PTX 12.86 mg，精密稱定，溶于P4的甲醇溶液（200μg／mL）200μL中，超聲使其溶解并混勻，然后逐滴加至CR偶聯(lián)物膠束溶液中，劇烈攪拌20 min，冰水浴探頭超聲30 min，透析12 h后，結(jié)束透析定容至6 mL，冰水浴探頭超聲 20 min，3 500 r／min離心5 min，取上清液，得共載P4和PTX的CR偶聯(lián)物膠束，即（P4＋PTX）／CR偶聯(lián)物膠束。

2.3.2 細胞攝取實驗 將MCF-7細胞以每毫升含1×105個細胞的密度接種于激光共聚焦培養(yǎng)皿上，每孔加入該細胞懸浮液1 mL，培養(yǎng)至4 d。從培養(yǎng)箱中取出激光共聚焦皿，棄去培養(yǎng)液，加入37℃預熱的PBS溶液輕輕沖洗細胞3次。加入各含藥制劑0.5 mL，孵育2 h后，棄去藥液，加入4℃的冰冷PBS終止攝取，清洗細胞3次。棄去PBS溶液，用4%多聚甲醛固定20 min，冷PBS清洗5次，加入10μg／mL細胞核染色液 Hoechst 33342 1 mL繼續(xù)孵育15 min，用冷PBS清洗3次后加入 PBS 200μL，于激光共聚焦顯微鏡（CLSM）下觀察并拍照。

2.3.3 流式細胞半定量實驗 將MCF-7細胞以每毫升含2×105個細胞的密度接種于6孔板上，每孔加入該細胞懸浮液2 mL，培養(yǎng)至4 d。用PBS溶液輕輕沖洗細胞2次，加入各含藥制劑1 mL，于37℃孵育2 h后，移除藥液，加入4℃的冰冷PBS終止攝取，清洗細胞3次，0.25%胰蛋白酶消化細胞，加入含血清的培養(yǎng)液吹散細胞。收集細胞，離心，然后加入PBS洗滌、離心如此重復3次后加入PBS 0.5 mL將細胞制成細胞懸液。

3 結(jié) 果

3.1 XRD測定結(jié)果

PTX、CR偶聯(lián)物、CR偶聯(lián)物＋PTX物理混合物以及PTX／CR偶聯(lián)物膠束的XRD圖譜見圖1。PTX在5.1°和12.8°處有2個強吸收峰，在15°～30°之間又有若干個弱峰。CR偶聯(lián)物僅在20°有一較弱吸收峰。CR偶聯(lián)物＋PTX物理混合物圖譜具有明顯的PTX和CR偶聯(lián)物的特征吸收峰，而PTX／CR偶聯(lián)物膠束圖譜中僅5.1°處有較明顯的吸收峰，可能是凍干前PTX／CR偶聯(lián)物膠束釋放在水溶液中的少量游離PTX造成的，但與相同量CR偶聯(lián)物與PTX物理混合物的XRD圖相比，PTX其他各吸收峰極弱，推測大部分PTX可能以無定型狀態(tài)包載于膠束內(nèi)部。

Figure 1 X-Ray diffraction spectraa:Paclitaxel（PTX）；b:Carboxymethyl chitosan-rhein conjugate（CR conjugate）；c:CR conjugate and PTX mixture；d:Paclitaxel-loaded carboxymethyl chitosan-rhein polymeric micelles（PTX／CR PMs）

3.2 細胞毒實驗結(jié)果

MTT法檢測Taxol?的溶劑Cremophor EL-無水乙醇混合溶劑（1∶1）、CR偶聯(lián)物、Taxol?及 PTX／CR偶聯(lián)物膠束的細胞毒性的結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示，在實驗濃度范圍內(nèi)，CR偶聯(lián)物具有良好的安全性。Taxol?及PTX／CR偶聯(lián)物膠束均對MCF-7細胞有一定的抑制率。24和48 h時，Taxol?及PTX／CR偶聯(lián)物膠束對MCF-7細胞的抑制作用均隨著PTX濃度的增加而增強，表明Taxol?及PTX／CR偶聯(lián)物膠束對MCF-7細胞的殺傷作用均有時間和濃度依賴性。24 h時，在10～1 000 nmol／L范圍內(nèi)，PTX／CR偶聯(lián)物膠束表現(xiàn)出比Taxol?更好的細胞殺傷力。PTX／CR偶聯(lián)物膠束24 h的IC50為293.9 nmol／L。48 h時，PTX／CR偶聯(lián)物膠束與Taxol?對MCF-7細胞的殺傷力相近。

3.3 細胞攝取實驗結(jié)果

為了進一步考察CR偶聯(lián)物膠束以載藥膠束完整的形式被細胞攝取還是釋放藥后藥物以游離的形式被細胞攝取，環(huán)境響應型熒光探針P4被應用于細胞攝取實驗。利用CLSM定性觀察（圖3）和流式細胞儀定量測定（圖4）的方法對P4與PTX共載的（P4＋PTX）／CR偶聯(lián)物膠束在MCF-7細胞中的攝取情況進行了研究。CLSM拍攝的MCF-7細胞攝取照片（圖3）中，紅色熒光信號為P4熒光探針發(fā)出，藍色熒光信號為Hoechst 33342染色的細胞核。圖中顯示，游離的P4溶液處于水環(huán)境中，熒光淬滅，因此只能觀察到藍色的細胞核，而（P4＋PTX）／CR偶聯(lián)物膠束組的紅色熒光主要分布在細胞核（藍色熒光）周圍，說明（P4＋PTX）／CR偶聯(lián)物膠束主要分布于細胞質(zhì)。與此同時，給予MCF-7細胞相同濃度的制劑并通過流式細胞儀分析，其結(jié)果如圖4所示，游離P4溶液的熒光強度極弱，可認為是細胞自身所發(fā)出的熒光，而（P4＋PTX）／CR偶聯(lián)物膠束的熒光強度是游離P4的500倍以上，表明（P4＋PTX）／CR偶聯(lián)物膠束是以完整的膠束形式被MCF-7細胞內(nèi)吞攝入，這些結(jié)果與通過CLSM觀察的結(jié)果相吻合，這為之后體內(nèi)的進一步研究提供了理論依據(jù)。

CLSM觀察結(jié)果和流式細胞術(shù)檢測的（P4＋PTX）／CR偶聯(lián)物膠束加維拉帕米組的細胞攝取結(jié)果顯示，其與（P4＋PTX）／CR偶聯(lián)物膠束在MCF-7細胞中的攝取量無明顯差異，說明CR偶聯(lián)物膠束可以保護其所載的熒光探針和／或藥物不被P-糖蛋白（P-gp）外排到細胞外。

Figure 2 In vitro cytotoxicity of CR conjugate and PTX／CR PMs in MCF-7 cells after incubation for 24 hours（A）and 48 hours（B）（xˉ±s，n＝6）EtOH＋EL:Dehydrated ethanol-Cremophor EL（1∶1）**P＜0.01

Figure 3 Cellular uptake of P4 and PTX co-loaded carboxymethyl chitosan-rhein polymeric micelles［（P4＋PTX）／CR PMs］in MCF-7 cells by confocal laser sanning microscopeVer:Verapamil

Figure 4 Cellular uptake of（P4＋PTX）／CR PMs in MCF-7 cells by flow cytometry（xˉ±s，n＝3）

4 討 論

PTX主要是通過抑制微管解聚，阻止腫瘤細胞的有絲分裂，因而對腫瘤細胞產(chǎn)生較強的細胞毒作用［6-7］。因此，聚合物膠束是否能夠遞送PTX到達細胞內(nèi)其作用靶點上，對能否對腫瘤細胞產(chǎn)生殺傷作用具有重要意義。本實驗結(jié)果表明，PTX／CR偶聯(lián)物膠束主要分布于細胞質(zhì)中，與紫杉醇作用部位相一致，有利于紫杉醇抗腫瘤作用的發(fā)揮。

PTX／CR偶聯(lián)物膠束在24 h時表現(xiàn)出優(yōu)于Taxol?對MCF-7細胞的殺傷效果，本課題組前期實驗已證明CR偶聯(lián)物與PTX具有一定的協(xié)同抗腫瘤作用［4］，因此推測，其對MCF-7細胞良好的細胞殺傷作用可能與載體材料CR偶聯(lián)物與PTX的協(xié)同作用相關(guān)。

本實驗中所使用的熒光探針P4為上海復旦大學藥學院吳偉教授課題組開發(fā)的具有4，4′-二氟-4-硼-3α，4α-二氮雜-s-并二苯（BODIPY）結(jié)構(gòu)的熒光探針。這種熒光探針在水環(huán)境中熒光分子因疏水作用會發(fā)生分子間π-π堆積，使熒光發(fā)生 淬 滅 （aggregation-caused quenching，ACQ效應）［8-10］。該ACQ探針具有高度親脂性，可以緊密嵌入脂質(zhì)或包裹在聚合物膠束內(nèi)部中從而發(fā)出熒光信號。一旦聚合物膠束解聚或探針從膠束中泄漏，熒光探針即因被釋放進入水環(huán)境中而快速聚集發(fā)生熒光淬滅，從而與保留在聚合物膠束中的熒光探針發(fā)射出的強烈熒光信號形成鮮明對比，由此可以判斷納米膠束在細胞內(nèi)外的完整性。以P4為熒光探針的實驗結(jié)果表明，CR偶聯(lián)物膠束是以完整形態(tài)進入MCF-7腫瘤細胞內(nèi)，并且可以保護其所載熒光探針和／或藥物避免被P-gp外排到細胞外，此研究將為CR偶聯(lián)物的進一步研究奠定基礎。

致謝：感謝復旦大學吳偉教授和趙偉利教授提供P4探針。感謝閩臺中藥分子生物技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，福建省中藥學重點實驗室，福建省中藥資源研究與開發(fā)利用重點實驗室對本研究的支持。