鄒坤 路麗麗 Collins Asiamah Amponsah 薛緣 張少偉 蘇瑛 趙志輝

（廣東海洋大學農(nóng)學院，湛江 524088）

卵泡閉鎖是一種多因素調控的選擇性的細胞凋亡的生理現(xiàn)象。自從1976 年Gilbert［1］第一次用機械分離法將雞卵泡顆粒細胞和膜細胞分離培養(yǎng)后，研究者開始在其基礎上對卵泡內(nèi)細胞培養(yǎng)體系進行改良和優(yōu)化，為卵泡發(fā)育和閉鎖的研究奠定了基礎。目前，大量研究表明卵泡閉鎖的根本原因是由顆粒細胞的凋亡引起的［2-4］。然而，在哺乳動物的研究中發(fā)現(xiàn)卵泡閉鎖不僅是顆粒細胞的凋亡，而且是顆粒細胞自噬到凋亡的一個過程，自噬的發(fā)生先于凋亡，二者存在動態(tài)平衡的關系，并證明了顆粒細胞的自噬和凋亡呈促性腺激素依賴性［5-6］。由此可見，針對卵泡閉鎖的機制仍有待進一步探討，尤其在家禽方面，將對挖掘家禽的產(chǎn)蛋性能有重大意義。因此，本文對近幾年關于卵泡內(nèi)細胞自噬和凋亡引起卵泡閉鎖的研究進行綜述，旨為家禽卵泡閉鎖機制的研究提供理論依據(jù)。

1 閉鎖卵泡內(nèi)細胞形態(tài)學變化

家禽卵泡閉鎖在卵泡發(fā)育的各個時期都有發(fā)生，具有明顯的形態(tài)學特征變化。當閉鎖發(fā)生時，卵泡由圓潤飽滿開始皺縮變形，顏色由光亮變灰暗并有明顯出血點［3］。一般卵泡閉鎖分為兩種形式：一種是始于卵母細胞，即在卵泡發(fā)育前卵母細胞直接發(fā)生凋亡引起卵泡閉鎖；一種是始于顆粒細胞，即在發(fā)育過程中由于顆粒細胞凋亡而引起卵泡閉鎖［7-8］。根據(jù)結構的變化，顆粒細胞凋亡形式分為兩種，第一種是正常顆粒細胞之間在原位發(fā)生凋亡；第二種是顆粒細胞脫落到卵泡腔內(nèi)形成凋亡小體發(fā)生凋亡［9］。Lin 等［10］對哺乳動物卵泡顆粒細胞研究發(fā)現(xiàn)，閉鎖卵泡中的顆粒細胞層和膜細胞層明顯變的松散、破裂、凹陷、甚至脫落。黃正洋等［9］在鵝的閉鎖卵泡發(fā)現(xiàn)與Lin［10］在哺乳動物閉鎖卵泡的發(fā)現(xiàn)基本一致，并通過透視電鏡發(fā)現(xiàn)正常卵泡有明顯邊界，而閉鎖卵泡邊界不清晰，且還發(fā)現(xiàn)閉鎖卵泡顆粒細胞層與膜層邊界不明顯。這種現(xiàn)象可能是由于發(fā)生卵泡閉鎖后，細胞內(nèi)的細胞器以及各種內(nèi)容物被分解附著在卵泡邊界所致。以上結果表明，哺乳動物與家禽的卵泡閉鎖的形態(tài)學變化基本一致，先是顆粒細胞線粒體、內(nèi)質網(wǎng)等生物學活性減弱，通過分泌細胞信號因子抑制膜細胞與外界的物質交換，同時抑制卵母細胞的活動，在顆粒細胞的主導下三者共同作用調控引起卵泡發(fā)生閉鎖［11-13］。據(jù)報道，Choi 等［14］在體外利用細胞饑餓法誘導顆粒細胞凋亡，用熒光免疫染色法對顆粒細胞染色觀察，發(fā)現(xiàn)顆粒細胞出現(xiàn)正常的核皺縮、破裂等凋亡現(xiàn)象。在透視電鏡下還發(fā)現(xiàn)大量顆粒細胞出現(xiàn)細胞質累積，雙膜結合的空泡，細胞器發(fā)生變化，大量自噬體累積等現(xiàn)象。郭燕君等［15］通過對小鼠微管相關蛋白1輕 鏈3（Microtubule-associated proteins light chain 3，LC3）的定位也發(fā)現(xiàn)顆粒細胞凋亡過程中伴隨著大量自噬體的產(chǎn)生。以上研究結果表明，顆粒細胞自噬可能也是卵泡閉鎖的一種調節(jié)方式。

2 卵泡內(nèi)細胞調控

家禽卵泡閉鎖的發(fā)生與顆粒細胞、膜細胞、卵母細胞或次級卵母細胞之間的調控密切相關。它們之間通過信號傳導、物質交換及轉化等方式共同維持卵泡內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，防止卵泡閉鎖的發(fā)生。綜述下文文獻報道，其簡化調控模式圖見圖1。

2.1 卵母細胞調控機制

圖1 卵母細胞、顆粒細胞、膜細胞之間相互調控關系

家禽卵母細胞是卵泡內(nèi)最大的細胞，被顆粒細胞和膜細胞包裹，它調控卵泡閉鎖的機制主要與原始卵泡的啟動有關。據(jù)報道，原始卵泡的生長發(fā)育啟動是由顆粒細胞分泌的干細胞因子（Stem cell growth factors，SCF）結合卵母細胞上的c-kit 受體共同完成，此過程并不依賴激素調節(jié)［16］。若原始卵泡未接收到啟動信號，卵母細胞則一直處于“休眠狀態(tài)”，最終在顆粒細胞分泌的白細胞介素1β（Interleukin- 1β，IL1-β）和腫瘤壞死因子α（Tumor necrosis factor，TNF-α）的作用下原始卵泡開始皺縮、裂解，最終發(fā)生閉鎖，在3 日齡之前雞會有90%的原始卵泡發(fā)生閉鎖［7，17-18］。當卵母細胞接收到啟動信號后，在SCF 的作用下卵母細胞分泌生長分化因子（Growth differentiation factor 9，GDF9）作用顆粒細胞，促進顆粒細胞上促卵泡素受體（Folliclestimulating hormone receptor，F(xiàn)SHR）的率先表達，F(xiàn)SHR 在FSH 的作用下正反饋調節(jié)卵母細胞，增強GDF9 信號作用，同時GDF9 作用膜細胞促進膜細胞上類固醇合成急性調節(jié)蛋白（Steroidogenic acute regulatory protein，StAR）與細胞色素P450 家族 的17A1/19A1（CytochromeP450，F(xiàn)amily 17 /19，Subfamily A，Polypeptide1，CYP17/19A1）的表達和細胞膜上內(nèi)質網(wǎng)的活性［19］。顆粒細胞上的FSHR 的表達也標志著卵泡發(fā)育的啟動［3］。Yongje［20］通過下調GDF9 的表達發(fā)現(xiàn)顆粒細胞的增殖分化受到抑制，因此GDF9 可能是顆粒細胞增殖的必須因子，但也有研究發(fā)現(xiàn)卵母細胞的啟動信號受抗繆勒氏激素（Anti-mullerian hormone，AMH）的調 控［17-18］，其具體機制仍有待進一步研究。通過抑制或敲除雞FSHR 在顆粒細胞的表達，則會導致孕酮、雌激素、LH、TGFβ 等迅速下調甚至不表達，卵母細胞快速進入凋亡期，導致卵泡發(fā)生閉鎖［21-23］。因此，GDF9 和FSHR 的下調可能是引起卵母細胞凋亡，進而調控卵泡閉鎖的重要原因。

2.2 顆粒細胞調控機制

家禽卵泡顆粒細胞是卵泡內(nèi)數(shù)量、比重以及功能最多的細胞，它的增殖分化和凋亡主導卵泡的發(fā)育，決定卵泡的閉鎖。在家禽正常發(fā)育階段，家禽卵泡閉鎖主要與其嚴格的選擇機制有關。只有被選擇的卵泡的顆粒細胞才具有較強的分化能力，在FSH 的作用下顆粒細胞迅速增殖分化進入優(yōu)勢卵泡階段［22，24-25］。未被選擇的卵泡顆粒細胞FSHR 表達量下調甚至不表達，F(xiàn)SH 與FSHR 結合的活性減弱，抑制顆粒細胞膜環(huán)磷酸腺苷（Cyclic adenosine monophosphate，cAMP），通過下調cAMP的濃度抑制cAMP-PKA 信號通路。顆粒細胞的轉錄活性下降，CYP11A1、CYP17A1、StAR 等重要固醇轉運蛋白下調，同時下調顆粒細胞上雌激素受體（Estrogen receptor，ESR）、胰島素樣生長因子受體（Insulin like growth factor receptor，IGFR）、黃體素受體（Luteinizing hormone receptor，LHR）等受體的表達［11，26-28］。隨著FSH 的作用減弱，與其級聯(lián)反應的cAMP 依賴蛋白激酶A（Protein kinase A，PKA），P13K/Akt 信號均被抑制［29］。此外，F(xiàn)SH 的作用減弱導致顆粒細胞膜上Ca2+的濃度下調上游蛋白Ras，Ras 下調絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族信號通路，ERK1/2 的作用被減弱，顆粒細胞周期蛋白cyclinD2 的合成停止。同時，ERK5 信號通路增強，激活Caspase 信號通路，促進顆粒細胞凋亡［30-31］。隨著顆粒細胞上ESR、FSHR 等G 蛋白偶聯(lián)受體的表達量下調，它們可與IGF、轉化生長因子（Transforming growth factor，TGF）等家族的受體構成的復合受體在溶酶體的作用下裂解，顆粒細胞的一系列生理活動逐漸停止，凋亡信號增強［32-34］。Wang 等［35］利用轉錄組富集信號通路發(fā)現(xiàn)，在雞等級卵泡選擇過程中，被選擇優(yōu)勢卵泡過程中還存在較強Wnt4 信號的調控，而閉鎖卵泡中Wnt4 的信號富集顯著弱于優(yōu)勢卵泡，說明Wnt4 信號的減弱可能也會引起卵泡閉鎖。在凋亡因子的作用下，卵泡內(nèi)顆粒細胞由整齊緊湊逐漸變得疏松凌亂，最終卵泡發(fā)生閉鎖。

顆粒細胞的凋亡是引起卵泡閉鎖的根本原因，而顆粒細胞的凋亡主要受細胞凋亡因子的調控。卵泡閉鎖早期，卵泡內(nèi)固醇的合成以及生長因子無顯著差異變化，而是顆粒細胞上的FSHR、ESR、LHR等受體的數(shù)量減少，一系列蛋白合成以及酶的活性降低，線粒體活動減弱［21］。隨即顆粒細胞凋亡誘導因子（Apoptosis inducing factor，AIF）的表達量升高，細胞膜上的FAS 和FASL 信號作用增強，Akt信號通路作用B 淋巴細胞瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl2），Bcl2 的磷酸化和氧化作用增強，釋放Bax、Bak，與其聯(lián)級的Caspase3 信號作用也增強，并通過Caspase8 切割Bcl2 正反饋調控凋亡信號，在TNF-α 和IL-β 的作用下進入凋亡程序。在顆粒細胞凋亡信號的作用下，膜細胞隨著顆粒細胞的凋亡而凋亡，最終卵母細胞也隨之凋亡。當顆粒細胞的凋亡率達到10%時，標志著卵泡進入閉鎖狀態(tài)［36］。卵泡在發(fā)育過程中受到多種信號通路的調控，但其信號通路的作用強度依賴顆粒細胞內(nèi)的激素及受體作用。

2.3 膜細胞調控機制

家禽卵泡膜細胞位于卵泡膜內(nèi)側，顆粒細胞層外側，是連接卵泡內(nèi)和卵泡外物質和信號交流的重要通道，也是卵泡內(nèi)固醇合成加工的重要場所。卵泡膜細胞層主要由膜細胞、毛細血管和基底膜構成，在膜細胞的表面含有大量的滑面內(nèi)質網(wǎng)以及脂類物質構成的小泡狀結構。Gan 等［37］發(fā)現(xiàn)CYP17A1 和CYP19A1 主要表達在膜細胞，它們的密度、生存能力和它們合成固醇類物質的能力趨勢是一致的。當卵泡發(fā)生閉鎖時，凋亡信號增強，負反饋作用顆粒細胞和卵母細胞GDF9 的分泌，抑制膜細胞的增殖分化。膜細胞在凋亡因子的作用下，CYP17A1、CYP19A1 和StAR 被抑制甚至失活，而CYP17A1、CYP19A1 和StAR作為cAMP的依賴基因，因此cAMP-FSHR 信號的傳導也被抑制［24，38］。此外，家禽卵泡排卵時，會形成臨時分泌器官黃體，而膜細胞是通過豐富的毛細血管為顆粒細胞和黃體提供連接橋梁。由膜細胞分泌的BMP 減少，卵泡膜上毛細血管系統(tǒng)的發(fā)育受到阻滯，通過毛細血管連接以及膜連接與卵泡外進行營養(yǎng)物質的交換、信息交流以及生長因子的轉化能力減弱；另一方面通過間隙連接顆粒細胞為顆粒細胞和卵母細胞的發(fā)育提供營養(yǎng)物質和信息交流逐漸停止，加速卵泡閉鎖過程［24，39］。更為重要的是，膜細胞是雌激素、雄激素和孕酮等固醇合成和轉運的主要場所［40］。膜細胞在LH 的作用下促進CYP17A1 和CYP19A1 的大量表達，同時活化膜上的芳香化酶，膜細胞通過將卵泡外的固醇類物質合成雄激素，維持卵泡內(nèi)必須的雄激素含量外，在芳香化酶的作用下可將自身合成的雄激素以及顆粒細胞分泌的雄激素轉化為雌激素，刺激顆粒細胞的發(fā)育［41］。當膜細胞分泌大量雌激素時，雌二醇會負反饋作用LH 信號，維持卵泡內(nèi)雄激素和雌激素動態(tài)平衡［36，42］。因此，CYP17A1 和CYP19A1 的失活可能打破卵泡內(nèi)激素動態(tài)平衡，是引起卵泡閉鎖的一個重要因素。此外，Hattori 等［43］通過將膜細胞和顆粒細胞共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，膜細胞LH軸可以通過旁分泌上調雄激素或雌激素的合成激活IGF 信號抑制顆粒細胞凋亡和卵泡閉鎖。綜上所述，膜細胞參與卵泡閉鎖可能與細胞間信息交換和卵泡內(nèi)激素平衡有關。

3 顆粒細胞自噬

卵泡內(nèi)細胞自噬主要是卵泡在其發(fā)育過程中凈化自身參與或者受損細胞器的作用機制，機體借此維持蛋白代謝的平衡。目前，關于自噬調控家禽卵泡閉鎖的研究主要在顆粒細胞自噬，其調控機制主要包括兩個方面：（1）負調控因子m-tor 信號通路。（2）正調控因子JNK 信號通路。在雞顆粒細胞自噬的過程激活凋亡信號，二者共同調控卵泡閉鎖［44］。

顆粒細胞自噬主要發(fā)生在等級卵泡發(fā)育階段，尤其在優(yōu)勢卵泡選擇之后，卵泡發(fā)育中顆粒細胞自噬對促性腺激素（Gonadotropic hormone，GnH）呈線性負相關［5，9］。哺乳動物顆粒細胞在GnH的作用下，F(xiàn)SH 通過上調P13K/AKT 信號，增加AKT 和S6K 的磷酸化，活化m-tor 信號，m-tor 通過m-torc1 的作用增強細胞內(nèi)的活性蛋白合成，提高細胞活性并抑制LC3-II 和Caspase3 的表達，抑制細胞自噬和凋亡［45］。也有研究表明，F(xiàn)SH 也可以直接通過m-tor 活化因子MHY1485 的作用激活m-tor 顯著抑制自噬信號，但通過FSH 處理顆粒細胞發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SH 可顯著上調低氧誘導因子1（Hypoxia inducible factor1α，HIF1α）的表達，并通過HIF1α 的作用誘導自噬信號的傳導引起卵泡閉鎖［46］。m-tor 作為m-tor/HIF1α 軸的上游主要信號因子，F(xiàn)SH 通過活化HIF1α 的作用可能遠遠弱于m-tor 的信號作用［47-48］。因此，m-tor 信號通路在顆粒細胞自噬調節(jié)具有重要作用，但在家禽卵泡閉鎖過程中的機制仍有待進一步研究。此外，F(xiàn)SH也可參與顆粒細胞自噬正向因子JNK 信號通路。Gao 等［49］發(fā)現(xiàn)FSH 通過抑制核轉錄因子（Nuclear factor-kappa B，NF-κB）的水平，促進p65 在顆粒細胞細胞質的表達，在p65 的作用下增強JNK 信號，JNK 通過對Bcl2 的磷酸化抑制Bcl2 的作用，并降低“自噬調節(jié)器”Beclin1 和Bcl2 的結合能力或者使Beclin1-Bcl2 復合體分離，使Beclin1 的作用機制增強，誘導細胞自噬引起卵泡閉鎖發(fā)生［50-51］。據(jù)報道，Beclin1 主要表達于雞膜細胞，通過與 LC3β-II 相結合，下調p62 和上調Beclin1 的作用，顯著增加膜細胞層的自噬活性，并且Beclin1 誘導Caspase3的表達促進顆粒細胞凋亡［44］。該結果表明，Beclin1的表達可能與膜細胞存在密切的關系，并可推測顆粒細胞的自噬可能取決于膜細胞的調控。綜上所述，在細胞自噬信號的傳導過程中伴隨著Bcl2 和Caspase3 等凋亡信號的產(chǎn)生，因此顆粒細胞凋亡和自噬可能共同調控卵泡閉鎖。

另一方面，顆粒細胞自噬還受其它多種因素調控。Yu 等［52］發(fā)現(xiàn)鵝卵泡內(nèi)環(huán)境的不均衡會引起自噬正調控因子miR-7，miR-29，miR-100，miR-181，PRLR，LC3，p53，Beclin1，Atg9 和Atg12的表 達上調，負調節(jié)因子miR-34b 和miR-34c 的下調導致顆粒細胞自噬。Lou 等［53］發(fā)現(xiàn)顆粒細胞的氧化損傷通過抑制m-tor 和促進p53 信號通路調節(jié)顆粒細胞自噬，但褪黑素可以通過GFP-MAP1LC3B 和SQSTM1降解Beclin1 靶向抑制JNK/Bcl2/Beclin1 信號傳導，也可以通過介導FOXO1 脫乙?；捌渑cATG 蛋白的相互作用以及抑制氧化應激的顆粒細胞中自噬需要SIRT1 信號傳導的激活，抑制顆粒細胞因氧化損傷發(fā)生自噬［54-55］。Kang 等［56］通過3-硝基丙酸（3-nitropropionic acid，3-NPA）刺激鵝顆粒細胞氧化應激反應發(fā)現(xiàn)，抑制Bcl2 促進Caspase3 的表達，引起顆粒細胞自噬和凋亡。引起卵泡顆粒細胞發(fā)生自噬的因素眾多，但自噬的發(fā)生最終途徑都涉及到m-tor 信號或JNK 信號的調控，并且伴隨著凋亡的發(fā)生。因此，通過應用m-tor 激動劑或者JNK 信號抑制劑可能對家禽因自噬導致卵泡閉鎖具有較好療效。

4 展望

家禽卵泡閉鎖受凋亡和自噬共同調控，影響家禽的產(chǎn)蛋性狀，但適量的卵泡閉鎖會加速優(yōu)勢卵泡的發(fā)育和排卵，并有研究發(fā)現(xiàn)顆粒細胞自噬和凋亡過程中產(chǎn)生的TNFα 可以通過減少卵母細胞釋放數(shù)量和誘導未破裂卵泡的顆粒細胞死亡重塑卵巢組織［57］。因此，家禽繁殖性能與卵泡閉鎖數(shù)量相關，如何建立一個閉鎖標準，充分挖掘家禽的產(chǎn)蛋性狀是一個值得探究的問題。此外，在哺乳動物中被認為顆粒細胞凋亡開關的Dicer 酶可通過抑制黃體的形成引起卵泡閉鎖［58］，而家禽不同于哺乳動物存在明顯的黃體，僅在家禽排卵時作為臨時分泌器官出現(xiàn)，是否該酶在家禽卵泡閉鎖的調控機制與哺乳動物相同，Dicer 酶也是合成microRNA 和siRNA 的必須酶，microRNA 和siRNA 在顆粒細胞、膜細胞和卵母細胞之間可能有著重要的傳遞信息的功能，在分子輔助生殖技術中，將microRNA 在各細胞中的豐度作為評價卵泡成熟和重量的一個重要指標［59-60］。隨著第三代測序技術的發(fā)展，對microRNA、siRNA以及circRNA 等小片段RNA 的挖掘更全面，筆者認為，在未來進一步完善小片段RNA 在顆粒細胞的凋亡和自噬的調控網(wǎng)絡對家禽繁殖性狀具有重要意義。