劉蘭畦，趙燕芳，謝含儀，王珊珊，陳相峰

(齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院) 山東省分析測(cè)試中心, 山東 濟(jì)南 250014)

中國(guó)現(xiàn)階段人口老齡化發(fā)展十分迅速，越來越多的人口步入老年。隨著環(huán)境污染和生活壓力的加劇，老年人肺癌的發(fā)病率不斷增加[1-2]。肺癌是發(fā)病率和死亡率增長(zhǎng)最快，對(duì)人們健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一[3-4]。肺癌的治療方法除了傳統(tǒng)的手術(shù)，還有化療、靶向治療、免疫治療以及中藥治療等。以靶向治療為例，治療的藥物需要經(jīng)過嚴(yán)格的基因檢測(cè)，找到合適的突破靶點(diǎn)后才選擇合適的靶向藥物。鹽酸厄洛替尼[5-7]又稱特羅凱，是一種分子靶向治療晚期非小細(xì)胞肺癌的藥物，鹽酸厄洛替尼片通過抑制人體細(xì)胞內(nèi)表皮生長(zhǎng)因子上一種特定酶的活性從而達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用，對(duì)提高患者的帶瘤生存率和改善生存質(zhì)量有很好的治療效果[8-11]。但是老年肺癌患者由于臟器功能衰退、代謝功能降低和其他疾病的增多，對(duì)藥物伴隨毒副反應(yīng)耐受性較差，需要對(duì)患者所服用的靶向藥物進(jìn)行基因毒性雜質(zhì)檢測(cè)，來避免對(duì)服藥患者的二次傷害?；蚨拘噪s質(zhì)是指能直接或間接損害DNA、引起基因突變或致癌的一類物質(zhì)，鹽酸厄洛替尼在生產(chǎn)和儲(chǔ)藏過程中引入的雜質(zhì)存在著一定的毒副反應(yīng)[12-14]，給患者治療造成不良影響，有必要對(duì)其加以嚴(yán)格控制[15-18]。本文研究并建立了采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定鹽酸厄洛替尼片中基因毒性雜質(zhì)3-乙炔苯胺含量的方法，毒理學(xué)限值小于10×10-6[19]，能夠有效地用于對(duì)其中3-乙炔苯胺的質(zhì)量控制。

1 儀器與材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

QTRAP 5500型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀、Thermo UltiMate 3000液相系統(tǒng)、Thermo Hypersil GOLD C8色譜柱(美國(guó)Thermo公司) ；KQ2202 型數(shù)控超聲波清洗機(jī)(上海楚柏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；Mettle AB265-S 型電子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

對(duì)照品3-乙炔苯胺純度98%(上海時(shí)代生物科技有限公司)；甲醇為色譜純(美國(guó)天地有限公司)；娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)；鹽酸厄洛替尼片(上海羅氏制藥有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜條件

色譜柱為Thermo Hypersil GOLD C8(100 mm×4.6 mm，3 μm)，進(jìn)樣量，5 μL ，柱溫，35 ℃，流速，0.4 mL/min。流動(dòng)相為甲醇和水，梯度洗脫：0～2 min，20%甲醇；2～6 min，95%甲醇；6～9.5 min，95%甲醇；9.5～12 min，20%甲醇。

2.2 質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源(ESI)，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式，正離子檢測(cè)，選擇離子對(duì)118→75、118→91；離子源噴射電壓5500 V，氣簾氣體(CUR)壓力40 psi(1 psi=6.895 kPa)，碰撞氣體(CAD)壓力Medium，溫度600 ℃，霧化氣(GAS1)壓力45 psi，輔助氣(GAS2)壓力50 psi，去簇電壓(DP) 40 eV，碰撞能量(CE) 37 eV。

2.3 溶液的制備

供試品溶液的制備：取供試品鹽酸厄洛替尼片，粉碎成粉末，過500目篩，精密稱定5.0 mg，置10 mL量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，超聲2 min，即得。

對(duì)照品貯備液的制備：取3-乙炔苯胺對(duì)照品，精密稱定100.0 mg，置100 mL量瓶中，加入少量甲醇使其溶解，然后用甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成1 mL含1 mg的3-乙炔苯胺的溶液。取上述溶液用甲醇逐級(jí)稀釋成濃度為1 mL含100 ng的3-乙炔苯胺溶液，配制100 mL，即得。

對(duì)照品溶液的制備：取對(duì)照品貯備液5.0 mL，精密量取，置100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成1 mL含5 ng的溶液，即得。

3 分析方法驗(yàn)證

3.1 專屬性驗(yàn)證

取甲醇試劑作為空白溶液、供試品溶液質(zhì)譜進(jìn)樣，證明空白溶液、供試品溶液對(duì)被測(cè)物測(cè)試無干擾；并取供試品含雜質(zhì)的混合溶液進(jìn)樣。相應(yīng)的二級(jí)全掃描質(zhì)譜圖見圖1。結(jié)果表明，空白溶液、供試品中其他雜質(zhì)對(duì)目標(biāo)化合物的檢測(cè)無干擾，方法專屬性強(qiáng)。

圖1 對(duì)照品溶液、供試品溶液及供試品含雜質(zhì)溶液的提取離子流色譜圖Fig.1 Extraction ion chromatograms for the control solution, test solution, and test product solution with the impurity

3.2 定量限及檢測(cè)限驗(yàn)證

信噪比(S/N)在3～5的濃度為檢測(cè)限濃度，信噪比在10～15的濃度為定量限濃度，計(jì)算定量限濃度6針對(duì)應(yīng)的信噪比的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)應(yīng)小于等于10.0%。

精密移取對(duì)照品溶液1 mL，置10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，制成0.5 ng/mL的溶液，作為檢測(cè)限驗(yàn)證濃度。

精密移取對(duì)照品溶液2 mL，置10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，制成1 ng/mL的溶液，作為定量限驗(yàn)證濃度。測(cè)試結(jié)果見表1、表2。

表1 檢測(cè)限實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 定量限實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果顯示：該分析方法中3-乙炔苯胺的檢出限為1.0×10-6；3-乙炔苯胺的定量限為2.0×10-6，其定量限6針信噪比的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.08%，且小于10%。

3.3 線性范圍驗(yàn)證

取對(duì)照品貯備液適量，分別用甲醇溶液逐級(jí)稀釋配制成濃度為1、2、5、6、10、20 ng/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，作為線性范圍驗(yàn)證溶液。取上述溶液各5 μL進(jìn)樣，記錄色譜圖。

結(jié)果顯示，該分析方法中3-乙炔苯胺在1.0～20.0 ng/mL 的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，線性方程為y=23 983.3x-5 594.8，線性相關(guān)系數(shù)R2= 0.999 4，呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。

3.4 方法精密度驗(yàn)證

取對(duì)照品溶液作為方法精密度測(cè)試溶液，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積響應(yīng)值,并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果顯示該分析方法中3-乙炔苯胺峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.13%，證明方法精密度高。

3.5 重復(fù)性驗(yàn)證

取鹽酸厄洛替尼片，粉碎成粉末，精密稱定5.0 mg，置10 mL量瓶中，再精確加入0.5 mL 3-乙炔苯胺對(duì)照品貯備溶液，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，超聲2 min，配制成含3-乙炔苯胺標(biāo)準(zhǔn)限度值為100% 濃度的測(cè)試溶液，作為重復(fù)性測(cè)試溶液，平行6份，各取5 μL進(jìn)樣，記錄濃度測(cè)定值，并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，6份平行樣品待測(cè)物實(shí)測(cè)濃度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.74%。結(jié)果顯示，該分析方法中3-乙炔苯胺重復(fù)性好。

3.6 加標(biāo)回收率驗(yàn)證

取鹽酸厄洛替尼片，粉碎成粉末，精密稱定5.0 mg，置10 mL量瓶中，再精確加入0.4 mL 3-乙炔苯胺對(duì)照品貯備溶液，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，超聲2 min，配制成含3-乙炔苯胺標(biāo)準(zhǔn)限度值為80% 濃度的測(cè)試溶液，配制3份；取鹽酸厄洛替尼片，粉碎成粉末，精密稱定5.0 mg，置10 mL量瓶中，再精確加入0.5 mL 3-乙炔苯胺對(duì)照品貯備溶液，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，超聲2 min，配制成含3-乙炔苯胺標(biāo)準(zhǔn)限度值為100% 濃度的測(cè)試溶液，配制3份；取鹽酸厄洛替尼片，粉碎成粉末，精密稱定5.0 mg，置10 mL量瓶中，再精確加入0.6 mL 3-乙炔苯胺對(duì)照品貯備溶液，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，超聲2 min，配制成含3-乙炔苯胺標(biāo)準(zhǔn)限度值為120% 濃度的測(cè)試溶液，配制3份，作為回收率測(cè)試溶液。計(jì)算添加3-乙炔苯胺含量的回收率及回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，驗(yàn)證測(cè)定結(jié)果與真實(shí)值的差異，來確定該分析方法能否獲得準(zhǔn)確的測(cè)試結(jié)果。3-乙炔苯胺加標(biāo)回收測(cè)試結(jié)果見表3。

表3 3-乙炔苯胺回收率測(cè)試結(jié)果

結(jié)果顯示，該分析方法中3-乙炔苯胺低、中、高的加標(biāo)的回收率范圍為90.1%～106.1%，回收率相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.1%，回收率測(cè)試結(jié)果良好。

3.7 樣品含量測(cè)定

將建立的方法學(xué)應(yīng)用于對(duì)鹽酸厄洛替尼片中基因毒性雜質(zhì)3-乙炔苯胺的分析。分別取鹽酸厄洛替尼片3個(gè)不同批次作為樣品1、樣品2、樣品3，粉碎成粉末，過500目篩，精密稱定5.0 mg，分別置10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，超聲2 min后，各取5 μL進(jìn)樣。測(cè)定結(jié)果顯示，樣品1～3均未檢出3-乙炔苯胺。經(jīng)加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，得到樣品中回收率在87.5%～104.5%之間，回收率結(jié)果良好，可見該方法可以應(yīng)用到實(shí)際樣品的分析中。

4 結(jié)論

通過對(duì)上述各項(xiàng)指標(biāo)的驗(yàn)證，表明采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定鹽酸厄洛替尼中的基因毒性雜質(zhì)3-乙炔苯胺的分析方法，專屬性強(qiáng)，靈敏度高，回收率好，方法準(zhǔn)確、可靠，能夠達(dá)到藥物基因毒性雜質(zhì)檢測(cè)的技術(shù)要求。