羅 輯，鐘雅婷，張 斌，趙錦文，鄒東霞，常明山，蔣學(xué)建，吳耀軍

（1.廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院，廣西南寧 530002；2.全州縣林業(yè)局，廣西桂林 541500）

松毛蟲是鱗翅目（Lepidoptera）枯葉蛾科（Lasio?campidae）松毛蟲屬昆蟲的統(tǒng)稱，我國分布有27種，是為害松科（Pinaceae）、柏科（Cupressaceae）和杉科（Taxodiaceae）植物的主要食葉害蟲[1]。桂林市為廣西松樹重要種植區(qū)，近些年松毛蟲連年發(fā)生，對當(dāng)?shù)厮蓸洚a(chǎn)業(yè)造成了較為嚴(yán)重的影響。廣西桂林市主要有馬尾松毛蟲（Dendrolimus punctatus）及思茅松毛蟲（D.kikuchii），主要危害馬尾松（Pinus massoni?ana）和濕地松（P.elliottii）。

目前，松毛蟲的防治主要依靠菊酯類化學(xué)農(nóng)藥，以及阿維菌素和白僵菌等生物農(nóng)藥?；瘜W(xué)農(nóng)藥見效快，防治效果好，能在較短時(shí)間內(nèi)對松毛蟲進(jìn)行控制，是林農(nóng)防治松毛蟲的首選，但對環(huán)境會造成一定影響，也會導(dǎo)致松毛蟲抗藥性增加[2]。目前，政府部門推廣使用的生物農(nóng)藥相對化學(xué)農(nóng)藥起效慢，但其藥效期較長，對環(huán)境也相對友好，值得廣泛推廣[3]。這2種農(nóng)藥主要是防治松毛蟲幼蟲，如果監(jiān)測不及時(shí)，當(dāng)松毛蟲已進(jìn)入暴食期，會對松林造成較嚴(yán)重的損害。

赤眼蜂是昆蟲卵期的寄生蜂，主要寄生在鱗翅目昆蟲卵中。其在世界各地均有分布，是目前應(yīng)用最廣且最為成熟的生物防治手段之一[4-6]。為了利用本地赤眼蜂資源對當(dāng)?shù)厮擅x進(jìn)行防控，本研究通過采集自然寄生的松毛蟲卵塊，調(diào)查全州縣松毛蟲卵期赤眼蜂的種類及豐度，為赤眼蜂的擴(kuò)繁及全州縣松毛蟲的生物防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究地點(diǎn)

本研究在廣西壯族自治區(qū)桂林市全州縣展開，在前期調(diào)查松毛蟲發(fā)生情況的基礎(chǔ)上，選擇全州縣蔡家村（111°04′E，25°56′N）、周家坪村（111°02′E，25°58′N）、竹溪田村（110°59′E，25°57′N）、珠塘村（111°03′E，25°52′N）和三塘村（110°52′E，25°45′N）5個(gè)村的松林作為研究地點(diǎn)。

1.2 采樣方法

2018年5月在上述研究地點(diǎn)，以“S”形踏查的方法在林間采集松毛蟲卵塊，每個(gè)樣地采集20個(gè)卵塊，將收集到的卵塊分別裝入單獨(dú)的試管中，帶回實(shí)驗(yàn)室，將試管放入光照培養(yǎng)箱中，在26℃、70%RH和L∶D=16∶8的條件下保存。每天觀察試管中蟲卵的狀態(tài)，若松毛蟲幼蟲孵出，則去除；若有寄生蜂羽化，則收集保存于-20℃冰箱。

1.3 赤眼蜂的培養(yǎng)與分子鑒定

將單頭赤眼蜂放入PCR管中，加入5 μL抽提液（100 mmol/L Tris-HCl，0.2 mol/L KCl，10 mmol/L EDTA，pH 9.5），用封口槍頭搗碎后，放入PCR儀95℃加熱10 min，4℃保存待用。分子鑒定所用COII引物參照Simon等[7]1994年的設(shè)計(jì)：5’-ATTG?GACATCAATGATATTGA-3’和 5’-CCACCAATTTC TGAACATTGACCA-3’，擴(kuò)增片段大小為300 bp左右；所用ITS-2引物參照李正西等[8]2002年的設(shè)計(jì)：5’-TTCTCGCATCGATGAAGAACG-3’和5’-TCCTCC?GCTTATTGATATGC-3’，擴(kuò)增片段大小為568 bp左右。在50 μL反應(yīng)體積中進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為 DNA 模板 2 μL，10×Buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，10 μmol/L正向和反向引物各1.6 μL，Taq酶（天根）0.8 μL，雙蒸水35 μL。在PCR儀（Ap?plied Biosystems SimpliAmp?）上進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min后4℃保存。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分離，將電泳條帶正確的產(chǎn)物回收后送Invitrogen公司雙向測通。

1.4 序列分析

在GenBank中分別搜索赤眼蜂屬的COII及ITS-2序列，以分索赤眼蜂屬（Trichogrammatoidea Girault）作為外類群。將序列用Mega X比對后，用Neighbor-Joining的方法同時(shí)使用Bootstrap 1 000次構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.5 多樣性指數(shù)

根據(jù)研究尺度，生物多樣性測定可分為α多樣性、β多樣性和γ多樣性。α多樣性主要關(guān)注局域均勻生境下的物種數(shù)目，本研究主要關(guān)注α多樣性。α多樣性指數(shù)按照香農(nóng)-威納指數(shù)（Shannon-Wiener index）公式計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 赤眼蜂寄生率

本次共采集100個(gè)松毛蟲卵塊，其中68個(gè)為馬尾松毛蟲卵塊，32個(gè)為思茅松毛蟲卵塊（表1）。蔡家村、周家坪村和珠塘村主要發(fā)現(xiàn)馬尾松毛蟲，竹溪田村主要發(fā)現(xiàn)思茅松毛蟲，三塘村2種松毛蟲數(shù)量相當(dāng)。馬尾松毛蟲卵塊和思茅松毛蟲卵塊赤眼蜂寄生率分別約為50%和65%。

2.2 赤眼蜂COII及ITS-2序列

每個(gè)被赤眼蜂寄生的松毛蟲卵塊中隨機(jī)取10頭赤眼蜂用于分子鑒定，共收集550頭赤眼蜂。每頭赤眼蜂均擴(kuò)增測序COII及ITS-2序列用于種類鑒定。

去除PCR擴(kuò)增失敗和測序失敗等因素導(dǎo)致未獲得序列的數(shù)據(jù)，共獲得赤眼蜂COII序列468條（圖1a），ITS-2序列482條（圖1b）。利用Mega X軟件進(jìn)行比對后，僅保留3’端第1個(gè)所有序列均有堿基的位點(diǎn)至5’端最后1個(gè)所有序列均有堿基的位點(diǎn)。最終獲取COII合并序列231 bp，ITS-2合并序列361 bp。

將序列進(jìn)行進(jìn)化分析后發(fā)現(xiàn)，無論是COII基因還是ITS-2基因，赤眼蜂均分為3組，且3組赤眼蜂的數(shù)量在2個(gè)基因分類標(biāo)準(zhǔn)上相近（圖1）。Group I數(shù)量最多，Group III數(shù)量最少。獲得的赤眼蜂應(yīng)該包括3個(gè)種類。

表1 全州縣采集的松毛蟲卵塊數(shù)及被赤眼蜂寄生情況Tab.1 Egg masses of Dendrolimus collected in Quanzhou and parasitization by Trichogramma

圖1 利用COII及ITS-2基因構(gòu)建的無根進(jìn)化樹Fig.1 Rootless evolutionary trees constructed using COII and ITS-2 genes

2.3 赤眼蜂的種類

每組隨機(jī)選取一些序列與NCBI中收集的序列進(jìn)行比對，并構(gòu)建進(jìn)化樹后，發(fā)現(xiàn)Group I與松毛蟲赤眼蜂（T.dendrolimi）聚在一起，Group II與螟黃赤眼蜂（T.chilonis，也稱擬澳洲赤眼蜂T.confusum）聚在同一分支上（圖2）。Group III在利用COII基因進(jìn)行分類時(shí)，自成一支后與T.brassicae及T.mwanzai聚在一支上，但Bootstrap值較低，僅有30左右；而在利用ITS-2基因進(jìn)行分類時(shí)，Group III與T.umerus聚在一支，且Bootstrap值較高，此分支與玉米螟赤眼蜂（T.ostriniae）、粘蟲赤眼蜂（T.leucaniae）及舟蛾赤眼蜂（T.closterae）聚在一支上。ITS-2構(gòu)建的進(jìn)化樹中，T.brassicae及T.mwanzai與Group III不在同一分支上且距離較遠(yuǎn)，因此判斷COII基因所構(gòu)建的進(jìn)化樹不能很好地反映檢測赤眼蜂的分類地位。

結(jié)合2個(gè)基因構(gòu)建的進(jìn)化樹，Group I為松毛蟲赤眼蜂，Group II為螟黃赤眼蜂，Group III為T.umerus。

圖2 COII及ITS-2基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic trees constructed by COII and ITS-2 genes

2.4 全州縣松毛蟲卵期赤眼蜂多樣性

5個(gè)地點(diǎn)赤眼蜂種類有所差異，在周家坪村僅發(fā)現(xiàn)松毛蟲赤眼蜂，蔡家村發(fā)現(xiàn)松毛蟲赤眼蜂及螟黃赤眼蜂，其他3個(gè)地點(diǎn)3種赤眼蜂均有發(fā)現(xiàn)（表2）。從數(shù)量上看，松毛蟲赤眼蜂在各地分布較為均勻，各地?cái)?shù)量間差異不顯著；螟黃赤眼蜂在竹溪田村與三塘村差異不顯著，但顯著多于其他3個(gè)村（P＜0.05），三塘村顯著多于周家坪村（P ＜0.05）；T.umerus在珠塘村顯著多于其他4個(gè)村（P＜0.05）。珠塘村多樣性指數(shù)最高（1.05），三塘村多樣性指數(shù)與其接近（1.03），蔡家村多樣性指數(shù)較低（0.27），周家坪村只發(fā)現(xiàn)1種赤眼蜂，指數(shù)為0。

表2 全州不同地點(diǎn)松毛蟲卵赤眼蜂多樣性Tab.2 Diversity of Trichogramma in different locations in Quanzhou

3 討論

赤眼蜂是松毛蟲卵期重要的寄生天敵，自然狀況下赤眼蜂寄生率一般低于30%[9]，如果人工大量擴(kuò)繁后進(jìn)行林間釋放，則會增加赤眼蜂寄生率，可對松毛蟲進(jìn)行適當(dāng)防控[10-11]。桂林市全州縣的赤眼蜂主要為松毛蟲赤眼蜂，與文獻(xiàn)報(bào)道的其他地區(qū)一致[12-14]。調(diào)查中還發(fā)現(xiàn)其他2種赤眼蜂種類，螟黃赤眼蜂也是松毛蟲卵期的一種寄生蜂，但分布沒有松毛蟲赤眼蜂廣泛，部分地區(qū)調(diào)查中未發(fā)現(xiàn)[15]；另一種赤眼蜂T.umerus是Jose等[16]在2005年發(fā)現(xiàn)的新種，此赤眼蜂被收集于日本琉球群島，野外寄生于小菜蛾（Plutella xylostella）卵，也可寄生用于誘集赤眼蜂的地中海粉螟（Ephestia kuehniella）卵，除此之外未有其他報(bào)道，此赤眼蜂為國內(nèi)首次報(bào)道，但具體定種還需后續(xù)形態(tài)學(xué)進(jìn)一步核對。

在利用分子技術(shù)進(jìn)行種類鑒定時(shí)，COII基因應(yīng)用不如ITS-2基因廣泛，導(dǎo)致提交到NCBI數(shù)據(jù)庫中的赤眼蜂COII基因序列過少，影響了種類鑒定的準(zhǔn)確性，而ITS-2序列相對較多，因此利用ITS-2基因的分類結(jié)果較為準(zhǔn)確。本研究中COII基因的結(jié)果大部分可與ITS-2基因的結(jié)果相匹配，也驗(yàn)證了分類的準(zhǔn)確性。

調(diào)查的5個(gè)地點(diǎn)中，有的地方只發(fā)現(xiàn)松毛蟲赤眼蜂，有的地方發(fā)現(xiàn)3種赤眼蜂，可能是因?yàn)椴蓸拥氐乃擅x發(fā)生情況不同。松毛蟲發(fā)生較少的地方，采集的20個(gè)卵塊分布面積較大；松毛蟲發(fā)生較多的地方，采集的20個(gè)卵塊分布較為集中，可能導(dǎo)致分布較少的赤眼蜂未能采集到。松毛蟲種類的差異也有可能導(dǎo)致這樣的結(jié)果，馬尾松毛蟲卵塊較小，常多層覆蓋，思茅松毛蟲卵塊較大，常單層排列于松針上，赤眼蜂僅能寄生裸露在表面的松毛蟲卵塊，導(dǎo)致思茅松毛蟲卵塊寄生率明顯高于馬尾松毛蟲卵塊，進(jìn)而使得思茅松毛蟲較多的點(diǎn)赤眼蜂種類可能更多。赤眼蜂寄生數(shù)量很大，而抽樣數(shù)量有限，不一定所有種類赤眼蜂都能抽到。