姜倩倩，汪承建

（濰坊學(xué)院，山東省高校生物化學(xué)與分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濰坊 261061）

土壤鹽漬化是全球農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展和生態(tài)環(huán)境面臨的一個(gè)嚴(yán)峻問題，一般會(huì)導(dǎo)致土壤理化性狀惡化，養(yǎng)分釋放慢，土壤好氣微生物活動(dòng)性變差等問題。滲透脅迫、離子失調(diào)會(huì)影響植物正常代謝，造成光合色素含量降低、光合速率下降、根系生長(zhǎng)受阻，嚴(yán)重時(shí)會(huì)使植株死亡[1]。

近年來，隨著設(shè)施栽培的迅速發(fā)展，長(zhǎng)期以來的管理措施不當(dāng)和自然降雨淋溶減少，導(dǎo)致土壤的次生鹽漬化問題嚴(yán)重[2]。相關(guān)研究表明，氮肥化合物Ca(NO3)2提供的硝酸根（NO3-）是植物吸收利用的最主要氮源，過量施用且大量積累于土壤中時(shí)會(huì)使設(shè)施土壤次生鹽漬化，是造成設(shè)施作物生長(zhǎng)障礙的主導(dǎo)因子[3]。多項(xiàng)研究表明，作為重要的氣體信號(hào)分子，一氧化氮（Nirtic oxide，NO）和硫化氫（Hydrogen sulfide，H2S），既參與了種子休眠、萌發(fā)、根系形態(tài)建成等生長(zhǎng)發(fā)育過程，也可調(diào)控植物對(duì)脅迫的抗逆應(yīng)答，在植物體內(nèi)具有廣泛的生理作用[4-5]。有關(guān)H2S 和NO 相互關(guān)系的研究曾報(bào)道，H2S 能促進(jìn)番薯、旱柳和大豆的根形態(tài)發(fā)生過程，而且這一生物學(xué)效應(yīng)是通過H2S激活NO 信號(hào)途徑實(shí)現(xiàn)的[6]?？梢?，研究植物的耐鹽性生理對(duì)于提高植物的耐鹽能力，從植物角度出發(fā)解決土壤鹽漬化危害有重要的意義。鑒于此，本試驗(yàn)以設(shè)施栽培面積較大的黃瓜為試材，初步研究了外源NO 供體硝普鈉（亞硝基鐵氰化鈉，簡(jiǎn)稱SNP）和H2S 供體硫氫化鈉（NaHS）對(duì)硝酸鹽脅迫下黃瓜種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響，以期為作物抗鹽性探索新的技術(shù)途徑。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

供試黃瓜品種為“新泰密刺”。硝酸鈣，分析純，購自天津市科密歐化學(xué)試劑公司；硝普鈉和硫氫化鈉，分析純，購自美國(guó)Sigma 公司。乙醇、氯化三苯基四氯唑（TTC），均為分析純，購自上?；瘜W(xué)試劑有限公司。

1.2 試驗(yàn)處理

試驗(yàn)于2018 在濰坊學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。挑選飽滿黃瓜種子480 粒，經(jīng)1%次氯酸鈉（NaClO）消毒15 min 后，蒸餾水沖洗3 次，置于25 ℃智能光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)浸種，浸種12 h 之后，將種子分成24 份，每皿20 粒，分別放入鋪有濾紙的培養(yǎng)皿（直徑9 cm）中，采用紙培法進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)。培養(yǎng)皿內(nèi)分別加入8 種處理液，每種處理液體積為10 mL，每個(gè)處理重復(fù)3 次。試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 各試驗(yàn)處理設(shè)計(jì)Table 1 Design of test treatment

擺好種子后在培養(yǎng)皿上罩保鮮膜，膜上扎透氣孔，減少水分散失。將培養(yǎng)皿置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。溫度調(diào)至（25±1）℃，每天觀察并統(tǒng)計(jì)發(fā)芽情況，等發(fā)芽后測(cè)定根系構(gòu)型和葉片葉綠素含量等指標(biāo)。試驗(yàn)處理所用器皿和濾紙均經(jīng)過高壓滅菌消毒處理。

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

（1）種子發(fā)芽率

播種4 d 后統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽的個(gè)數(shù)，發(fā)芽率計(jì)算公式見式（1）。

（2）胚軸、胚根的長(zhǎng)度

種子發(fā)芽4 d 后用刻度尺測(cè)量胚軸和胚根的長(zhǎng)度。

（3）根系長(zhǎng)度、根尖數(shù)、表面積

用專業(yè)版WinRHIZO 根系分析系統(tǒng)獲取種子發(fā)芽4 d后幼苗根系的掃描圖像并分析獲取相應(yīng)的數(shù)據(jù)。

（4）幼苗鮮質(zhì)量

種子發(fā)芽4 d 后用電子天平稱量幼苗的質(zhì)量。

（5）葉片的葉綠素含量

取種子發(fā)芽4 d 后幼苗的新鮮葉片用乙醇萃取法提取葉綠素，用分光光度計(jì)測(cè)定。

（6）根系活力

取種子發(fā)芽4 d 后幼苗的根系，用氯化三苯基四氯唑（TTC）還原法測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 SNP、NaHS 對(duì)硝酸鈣脅迫下種子發(fā)芽率的影響

SNP 和NaHS 對(duì)硝酸鈣脅迫下黃瓜種子發(fā)芽率的影響見圖1。由圖1 可知，黃瓜種子在蒸餾水（CK）中的發(fā)芽率最高，而硝酸鈣明顯抑制了黃瓜種子萌發(fā)，使該處理的發(fā)芽率最低，比CK 降低了51.4%；與只加入硝酸鈣的處理對(duì)比，在外源SNP 或NaHS 的作用下，黃瓜種子的發(fā)芽率分別提高了57.1%和34.2%，同時(shí)加入外源SNP 和NaHS 時(shí)，黃瓜種子的發(fā)芽率提高了85.7%。與CK 相比，單獨(dú)進(jìn)行SNP、NaHS 或NaHS 和SNP 共同處理時(shí)，黃瓜的發(fā)芽率稍有下降，分別降低了17.0%、13.9%和14.2%。

2.2 SNP、NaHS 對(duì)硝酸鈣脅迫下幼苗胚軸的影響

SNP 和NaHS 對(duì)硝酸鈣脅迫下黃瓜幼苗胚軸長(zhǎng)度的影響如圖2 所示。由圖可知，硝酸鈣處理的黃瓜幼苗根系胚軸長(zhǎng)度最短，與蒸餾水（CK）相比降低了48.4%。加入硝酸鈣和SNP 處理的胚軸長(zhǎng)度比單獨(dú)硝酸鈣處理的提高了41.1%，加入硝酸鈣和NaHS 處理的胚軸長(zhǎng)度與單獨(dú)硝酸鈣處理的基本一致。同時(shí)加入硝酸鈣、NaHS 和SNP 處理的胚軸長(zhǎng)度比單獨(dú)硝酸鈣處理的提高了74.3%。與CK 相比，單獨(dú)進(jìn)行SNP，或NaHS 和SNP 共同處理時(shí)，黃瓜的胚軸長(zhǎng)度均比對(duì)照長(zhǎng)，分別增加了14.3%和8.05%，單獨(dú)進(jìn)行NaHS 處理時(shí)，黃瓜的胚軸長(zhǎng)度與對(duì)照基本一致。

2.3 SNP 和NaHS 對(duì)硝酸鈣脅迫下幼苗根系總長(zhǎng)度的影響

SNP 和NaHS 對(duì)硝酸鈣脅迫下黃瓜幼苗根系總長(zhǎng)度的影響見圖3。由圖3 可知，硝酸鈣顯著抑制了黃瓜種子根系的生長(zhǎng)，與蒸餾水（CK）相比，根系總長(zhǎng)度降低了92.3%倍。硝酸鹽處理下，添加外源SNP 和NaHS 均可明顯緩解硝酸鈣脅迫對(duì)黃瓜幼苗根系生長(zhǎng)的抑制，根系總長(zhǎng)度分別提高了264.5%和74.2%。硝酸鹽處理下，同時(shí)添加SNP 和NaHS 時(shí)，根系總長(zhǎng)度比硝酸鈣處理的提高了356.4%倍。與CK 相比，單獨(dú)進(jìn)行SNP、NaHS 或NaHS和SNP 共同處理時(shí)，幼苗根系總長(zhǎng)度分別增加了24.8%、22.4%和24.1%。

2.4 SNP、NaHS 對(duì)硝酸鈣脅迫下幼苗根尖數(shù)的影響

SNP 和NaHS 對(duì)硝酸鈣脅迫下黃瓜幼苗根尖數(shù)的影響如圖4 所示。由圖可知，硝酸鈣處理的黃瓜幼苗根尖數(shù)最少，比蒸餾水（CK）減少了83.8%。硝酸鈣處理時(shí)加入SNP 和NaHS，幼苗根尖數(shù)比單獨(dú)硝酸鈣處理的分別增加了156%和58.3%；硝酸鈣處理同時(shí)加入SNP 和NaHS，幼苗根尖數(shù)比單獨(dú)硝酸鈣處理的增加了218%。與CK 相比，單獨(dú)用NaHS 處理或NaHS 和SNP 共同處理時(shí)，幼苗根尖數(shù)分別增加了43.9%和17.6%，單獨(dú)進(jìn)行SNP 處理對(duì)幼苗根尖數(shù)沒有影響。

2.5 SNP、NaHS 對(duì)硝酸鈣脅迫下幼苗根系表面積的影響

SNP 和NaHS 對(duì)硝酸鈣脅迫下黃瓜幼苗根系表面積的影響見圖5。由圖5 可知，與CK 處理相比，加入硝酸鈣的培養(yǎng)皿中的黃瓜幼苗的根系表面積最小，降低了86.6%；硝酸鈣處理再加入SNP 處理或NaHS 和處理時(shí)，幼苗根系表面積比單獨(dú)硝酸鈣處理的增加了208%和156%；硝酸鈣處理同時(shí)加入SNP 和NaHS 時(shí)，幼苗根系表面積比單獨(dú)硝酸鈣處理的增加了314%。與CK 相比，單獨(dú)進(jìn)行SNP 或NaHS 和SNP 共同處理時(shí)，幼苗根系表面積也明顯增加，分別提高了61.3%、25.7%和64.2%。

2.6 SNP、NaHS 對(duì)硝酸鈣脅迫下幼苗根系活力的影響

SNP 和NaHS 對(duì)硝酸鈣脅迫下黃瓜幼苗根系活力的影響如圖6 所示。由圖可知，硝酸鈣脅迫導(dǎo)致黃瓜幼苗根系活力降低，比CK 降低了59.9%。硝酸鈣處理時(shí)分別加入SNP 或NaHS，幼苗根系活力比單獨(dú)硝酸鈣處理提高了69.3%和80.8%；同時(shí)加入SNP 和NaHS 時(shí)，幼苗根系活力進(jìn)一步提高，比單獨(dú)硝酸鈣處理提高了98.7%。與CK 相比，單獨(dú)進(jìn)行SNP 處理或NaHS 和SNP 共同處理時(shí)，幼苗根系活力與CK 基本一致。

2.7 SNP、NaHS 對(duì)硝酸鈣脅迫下幼苗葉綠素的影響

SNP 和NaHS 對(duì)硝酸鈣脅迫下黃瓜幼苗葉綠素含量的影響如圖7 所示。由圖7 知，受硝酸鈣脅迫的影響，黃瓜幼苗的葉綠素含量比CK 處理減少了45.6%。硝酸鈣處理加入SNP 或NaHS，幼苗的葉綠素含量比單獨(dú)硝酸鈣處理增加了33.5%和50.9%；同時(shí)加入SNP 和NaHS，使幼苗的葉綠素含量比單獨(dú)硝酸鈣處理增加了62.7%。與CK 相比，單獨(dú)進(jìn)行SNP，或NaHS 和SNP 共同處理時(shí)，幼苗葉綠素含量稍有提高。

2.8 SNP、NaHS 對(duì)硝酸鈣脅迫下幼苗鮮質(zhì)量的影響

SNP 和NaHS 對(duì)硝酸鈣脅迫下黃瓜幼苗鮮重的影響如圖8 所示。由圖可知，CK 處理的黃瓜幼苗的鮮質(zhì)量最高，加入硝酸鈣溶液的幼苗與CK 相比，鮮質(zhì)量降低了68.4%。硝酸鈣處理時(shí)分別加入SNP 或NaHS，幼苗鮮質(zhì)量比單獨(dú)硝酸鈣處理增加了83.3%和100%；同時(shí)加入SNP 和NaHS，幼苗鮮質(zhì)量比單獨(dú)硝酸鈣處理增加了133%。與CK 相比，單獨(dú)進(jìn)行SNP 或NaHS 和SNP 共同處理時(shí)，幼苗鮮質(zhì)量與CK 基本一致。

3 討論

硝態(tài)氮是植物易吸收的氮素營(yíng)養(yǎng)形式，合理施用硝態(tài)氮肥可促進(jìn)作物的生長(zhǎng)、提高產(chǎn)量；而過量施用硝態(tài)氮肥，不僅會(huì)使土壤發(fā)生次生鹽漬化，還會(huì)影響作物的生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量品質(zhì)。目前，過量施用硝態(tài)氮肥對(duì)黃瓜生理生化機(jī)能的影響及其緩解措施研究多集中于地上部[7-8]，對(duì)根系生長(zhǎng)發(fā)育影響的研究較少。本試驗(yàn)中，硝酸鈣降低了黃瓜種子萌發(fā)率，影響了與硝酸鈣溶液直接接觸的根系的生長(zhǎng)，表現(xiàn)為根尖數(shù)、總長(zhǎng)度、表面積均減少，根系活力降低。根系是植物體吸收水分和養(yǎng)分的主要部位，其生長(zhǎng)狀況和活力水平影響地上部生長(zhǎng)。生長(zhǎng)在硝酸鈣溶液中的黃瓜幼苗的胚軸縮短，葉綠素含量降低，最終整個(gè)植株的生長(zhǎng)受到限制，鮮質(zhì)量降低。因而，增強(qiáng)黃瓜根系對(duì)硝酸鹽脅迫的抗性，可為生產(chǎn)中尋求硝酸鹽脅抵御途徑提供參考。

張華等[9]在研究外源NO 對(duì)滲透脅迫下小麥種子萌發(fā)及活性氧代謝的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)SNP 可明顯促進(jìn)小麥種子的萌發(fā)及胚根和胚芽的伸長(zhǎng)。Zhang 等[10]也發(fā)現(xiàn)外源H2S 可以降低滲透脅迫下甘薯的氧化傷害而降低葉綠素的降解。用NaHS 作為H2S 供體可以促進(jìn)小麥種子萌發(fā)過程中淀粉酶的活性[11]，提高黃瓜種子在鎘脅迫下的發(fā)芽率和胚軸、胚根的長(zhǎng)度，使子葉葉綠素含量明顯增加[12]。本試驗(yàn)研究中，H2S 供體NaHS 和NO 供體SNP 緩解了硝酸鹽脅迫對(duì)黃瓜種子發(fā)芽的抑制，還有效緩解了硝酸鹽脅迫對(duì)種子鮮質(zhì)量、根長(zhǎng)、根表面積、葉綠素含量、根系活力的不利影響，且同時(shí)外源加入NaHS 和SNP 對(duì)硝酸鹽脅迫的緩解有疊加效應(yīng)。