王 濤， 李慧娟， 耿啟泉， 常 娟， 王 平， 尹清強(qiáng)*，劉超齊， 朱 群

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南鄭州 450046；2.河南省鄭州種畜場(chǎng)，河南鄭州 450011；3.河南省衛(wèi)輝市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河南衛(wèi)輝 453100；4.河南德鄰生物制品有限公司，河南新鄉(xiāng) 453000）

黃曲霉毒素主要是由真菌屬的黃曲霉菌或寄生曲霉菌產(chǎn)生的一類帶香豆素和雙呋喃環(huán)的毒性代謝產(chǎn)物。在飼料中，黃曲霉毒素多數(shù)來自于發(fā)霉的玉米（段保寧，2018）。在黃曲霉毒素中，AFB1被世界癌癥研究中心列為人類第一類致癌物，被認(rèn)定是最強(qiáng)并最常見的致癌物質(zhì)（Marroquíncardona等，2014），其毒性是氰化鉀的10倍、砒霜的68倍、亞硝胺的75倍（Choudhury等，2011）。 人類在誤食了含有黃曲霉毒素的食物后，可導(dǎo)致黃曲霉毒素急性中毒 （朱輝，2012），同時(shí)肝臟也受到損害，甚至誘發(fā)肝癌（Gholami-Ahangaran 等，2016）。

玉米赤霉烯酮又稱F-2毒素，是由禾谷鐮刀菌 （Fusarium graminearum）、木賊鐮孢（Fusarium equiseti）、三線鐮刀菌（Fusarium tricinctum）等真菌在適宜的條件下，生成的一類非甾體結(jié)構(gòu)的化合物，具有類雌激素活性（Kuiper等，1997）。ZEA污染糧食后，在加工過程中不易被消除，進(jìn)入飼料、動(dòng)物養(yǎng)殖甚至食品加工領(lǐng)域，引起嚴(yán)重的食品安全問題，甚至危害人類的健康（陳繼發(fā)等，2016；王怡凈等，2002）。

近些年，霉菌毒素問題已經(jīng)困擾了大多數(shù)畜牧產(chǎn)業(yè)，造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。由于目前關(guān)于單一AFB1或ZEA的吸收、代謝和危害的研究較多，而同時(shí)對(duì)兩種毒素的交互作用、疊加毒性及危害機(jī)理的研究較少，有必要做深入研究。霉菌毒素的脫毒方式分為物理法、化學(xué)法以及生物法，其中霉菌毒素生物降解法被公認(rèn)為是最有效的方法。本研究選用具有降解霉菌毒素能力的枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌與產(chǎn)朊假絲酵母，利用響應(yīng)面回歸設(shè)計(jì)獲得最佳的復(fù)合益生菌配伍對(duì)兩種霉菌毒素進(jìn)行降解，為消除霉菌毒素的危害奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L、NaCl 10 g/L、酵母浸粉5 g/L，用蒸餾水定容至1 L，用NaOH溶液調(diào)節(jié)使pH為7.0，在121℃、1.034×105Pa條件下高壓蒸汽滅菌20 min，于4℃保存?zhèn)溆?。YPD培養(yǎng)基：蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L、酵母浸粉10 g/L，用蒸餾水定容至1 L，在121℃、1.034×105Pa條件下高壓蒸汽滅菌20 min，4℃保存?zhèn)溆谩RS培養(yǎng)基（g/L)：胰蛋白胨15 g/L、葡萄糖20 g/L、酵母浸粉10 g/L、磷酸氫二鉀2 g/L、乙酸鈉2 g/L、檸檬酸二銨2 g/L、硫酸鎂0.2 g/L、硫酸錳0.05 g/L、吐溫80 1 mL，用蒸餾水定容至1 L，在121℃、1.034×105Pa條件下高壓蒸汽滅菌20 min，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 菌種的活化與培養(yǎng) 枯草芽孢桿菌接種到LB培養(yǎng)基上，37℃、200 r/min培養(yǎng)；干酪乳桿菌接種到MRS培養(yǎng)基上，37℃靜止?fàn)顟B(tài)下培養(yǎng)；產(chǎn)朊假絲酵母接種到Y(jié)PD培養(yǎng)基上，30℃、200 r/min培養(yǎng)。三種菌培養(yǎng)24 h后分別按2%的接種量接入對(duì)應(yīng)的新鮮培養(yǎng)基，再培養(yǎng)24 h后測(cè)定活菌數(shù)。

1.3 復(fù)合益生菌體外降解霉菌毒素的響應(yīng)面回歸設(shè)計(jì) 基于生產(chǎn)實(shí)際考慮，將上述的益生菌活菌數(shù)調(diào)至 1.0×105、1.0×106、1.0×107cfu/mL，運(yùn)用響應(yīng)面回歸法進(jìn)行三因素三水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)，測(cè)定降解霉菌毒素效果最佳的組合。利用Design-Expert 8.0.6軟件，采用Box-Behnken Design （BBD）設(shè)計(jì)、模型擬合和數(shù)據(jù)分析。試驗(yàn)因素及水平見表1。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及編碼水平cfu/mL

為了體現(xiàn)自變量和因變量的關(guān)系，采用二次多項(xiàng)方程進(jìn)行擬合，預(yù)測(cè)二次多項(xiàng)方程式如下：Y=β0+β1X1+β2X2+β3X3+β11X12+β22X22+β33X32+β12X1X2+β13X1X3+β23X2X3。式中：Y 是益生菌組合對(duì)霉菌毒素的降解率；X1、X2、X3是自變量，分別對(duì)應(yīng)枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母；β0是截距；β1、β2、β3是線性系數(shù)；β11、β22、β33是平方系數(shù)；β12、β13、β23是交叉系數(shù)。

1.4 復(fù)合益生菌體外同步降解AFB1+ZEA的測(cè)定方法 對(duì)照組：1.825 mL生理鹽水+3 mL MRS培養(yǎng)基+0.125 mL AFB1標(biāo)準(zhǔn)品（2 mg/L）+0.05 mL ZEA標(biāo)準(zhǔn)品（50 mg/L）。試驗(yàn)組：不同體積的三種益生菌，加入 0.125 mL AFB1標(biāo)準(zhǔn)品（2 mg/L）和0.05 mL ZEA 標(biāo)準(zhǔn)品（50 mg/L），加入 3 mL MRS培養(yǎng)基，再加生理鹽水補(bǔ)足5 mL。該設(shè)計(jì)共18個(gè)試驗(yàn)組，每個(gè)試驗(yàn)組做3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)設(shè)定AFB150μg/L、ZEA 500μg/L。 在37℃及200 r/min恒溫培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)24 h，然后在4℃及10000 r/min的離心機(jī)中離心5 min，取一定量的上清液，利用拜發(fā)試劑盒測(cè)定ZEA和AFB1的含量。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel初步整理后，采用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)響應(yīng)面數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。采用SPSS 17統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和Duncan多重比較，差異顯著性用P＜0.05表示，所有結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

根據(jù)Design-Expert 8.0.6軟件中Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，其中對(duì)照組24 h后ZEA含量為589.60μg/L，AFB1含量為57.75μg/L， 對(duì)試驗(yàn)組AFB1+ZEA的降解率進(jìn)行回歸分析，建立響應(yīng)面二次回歸模型，尋求最優(yōu)因素水平，試驗(yàn)結(jié)果與回歸方程方差分析見表2～4。利用Design-Expert 8.0.6對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次回歸擬合，由于在模型上選擇“Quadratic”2次方重復(fù)多次試驗(yàn)所得的R2結(jié)果均偏低，于是選用模型“Cubic”三次方得出回歸模型方程如下：

在選擇模型“Cubic”三次方的基礎(chǔ)上，多項(xiàng)及三次方的系數(shù)為0，所以方程里未出現(xiàn)系數(shù)為0的多項(xiàng)。與上述分析相似，由表3和表4可知，兩個(gè)響應(yīng)值的模型P＜0.05，說明此模型可用，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義?；貧w模型的決定系數(shù)為R2和 R2adj均大于0.80，說明回歸方程的擬合度越好?；陧憫?yīng)面分析，當(dāng)枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌與產(chǎn)朊假絲酵母的活菌數(shù)分別為 1×107、1×106、1×107cfu/mL時(shí)，同時(shí)降解兩種毒素的效果最好，實(shí)測(cè)AFB1降解率為38.67%，ZEA降解率為26.29%。

表2 Box-Behnken設(shè)計(jì)參數(shù)與AFB1和ZEA降解率%

表3 AFB1降解率響應(yīng)面回歸方程系數(shù)的方差分析

3 討論

當(dāng)兩種以上的霉菌毒素同時(shí)存在時(shí)，其毒性常常有加性效應(yīng)（曹冬梅等，2010）。研究表明，多種霉菌毒素聯(lián)合可引起動(dòng)物慢性中毒，甚至導(dǎo)致癌癥發(fā)生及免疫抑制 （Battacone等，2003；Avantaggiato等，2003）。據(jù)報(bào)道，ZEA 與 AFB1存在一定的劑量依賴關(guān)系，在AFB1濃度低的條件下，ZEA可以降低AFB1的腎細(xì)胞毒性，但當(dāng)AFB1濃度高的時(shí)候，ZEA則與其呈現(xiàn)出協(xié)同毒性效應(yīng)（雷明彥，2013）。 Williams 等（1994）報(bào)道，生長(zhǎng)豬食用被ZEA和DON污染的玉米后，其生長(zhǎng)性能受到影響，日采食量和日增重均下降。范彩云等（2017）研究表明，單一AFB1以及其與ZEA聯(lián)合均能影響奶山羊腸道微生物區(qū)系的結(jié)構(gòu)，其中混合毒素作用比單一毒素影響更大，此外混合毒素聯(lián)合作用后，山羊的腸道微生物總數(shù)顯著降低。本研究得到的復(fù)合益生菌組合可同時(shí)降解AFB1和ZEA，但與單一的毒素降解效果對(duì)比，兩種毒素同時(shí)降解的效率都偏低，推測(cè)在添加益生菌菌液后，兩種毒素存在協(xié)同作用，從而對(duì)益生菌的降解產(chǎn)生抵制。

表4 ZEA降解率響應(yīng)面回歸方程系數(shù)的方差分析

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌、 產(chǎn)朊假絲酵母活菌數(shù)分別為 1×107、1×106、1×107cfu/mL時(shí)，可顯著地降解AFB1和ZEA，AFB1和ZEA的降解率分別為38.67%、26.29%。