李小軍，金官佑，張曉丹，吳賢哲，金倫喆*，劉向前

1贛南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 國家中藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心客家中醫(yī)藥資源研究分中心，贛州 341000；2湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長沙 410208；3圓光大學(xué)藥學(xué)院，益山 54538；4浙江理工大學(xué)生命科學(xué)與醫(yī)藥學(xué)院，杭州 310000

糙葉五加Acanthopanaxhenryi(Oliv.) Harms為中國特有的五加科五加屬植物，廣泛分布于湖南、甘肅、四川等地。湖南省中藥材地方標準收載的“五加皮”就是以該植物的根皮入藥，具有祛風(fēng)濕、活血化瘀、壯筋骨等功效，主要用于治療風(fēng)濕痹痛、拘攣麻木、筋骨痞軟、水腫、跌打損傷、疝氣腹痛等[1]。然而，從資源可持續(xù)、合理利用的角度考慮，根皮入藥為不可再生；而其地上部位包括葉、莖、花、果實為可持續(xù)再生資源。為了探究糙葉五加的地上各部位是否可以替代其根皮入藥，我們課題組前期對其葉、莖、花進行了系統(tǒng)研究并作了相應(yīng)報道[2-7]。目前為止，對其果實的研究鮮有報道[8]。基于此，我們首次對糙葉五加果實進行了物質(zhì)基礎(chǔ)研究，對糙葉五加果實甲醇提取物依次進行了石油醚(60～90)、乙酸乙酯、正丁醇萃取，基于LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞BV2模型對各萃取部分進行抗神經(jīng)炎活性篩選，對活性較好的乙酸乙酯萃取部分進行分離純化。

1 儀器與材料

NMR波譜(1D和2D)測試采用JEOL JNM ECP-400核磁共振儀(日本，東京)；HMQC和HMBC實驗參數(shù)設(shè)置分別為1JCH=140 Hz和nJCH=8 Hz；ESI-MS測試采用Q-TOF micro LC-MS/MS質(zhì)譜儀(美國，Waters)；旋光度測試采用Jasco p-2000全自動數(shù)字旋光儀(日本，東京)；高相液相色譜儀為YL9100 HPLC系統(tǒng)(韓國，英麟)；正相和反相TLC采用Kieselgel 60 F254和RP-18 F254s(德國，默克)；常規(guī)柱色譜硅膠(Kieselgel 60，70～230目和230～400目，默克)；反相柱色譜材料YMC-C18(德國，默克)；Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)和胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自Gibco BRL Co.(Grand Island，NY，USA)；脂多糖(LPS)、3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、Griess試劑購自美國Sigma-Aldrich公司(St.Louis，MO)；陽性對照紫鉚因(butein)為韓國圓光大學(xué)藥學(xué)院生藥及天然產(chǎn)物研究室自制(HPLC純度≥98.5%)；小鼠小膠質(zhì)細胞BV2來源于韓國圓光大學(xué)Park Hyun教授實驗室。

本實驗樣品于2015年10月份采自湖南省新化，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院劉向前教授和韓國圓光大學(xué)藥學(xué)院金倫喆教授共同鑒定為五加科五加屬植物糙葉五加Acanthopanaxhenryi(Oliv.) Harms的果實，標本保存于湖南省重點實驗室中藥新藥研究與開發(fā)實驗室，標本號為AHF20151025。

2 提取與分離

干燥的糙葉五加果實5 kg，粉碎至粗粉，以甲醇回流提取3次，合并提取液,濃縮后得總浸膏?？偨嗉尤脒m量蒸餾水分散后依次用石油醚(60～90)、乙酸乙酯、正丁醇進行萃取。回收溶劑，得石油醚萃取物(40 g)、乙酸乙酯萃取物(20 g)、正丁醇萃取物(100 g)。

分別以LPS誘導(dǎo)的巨噬細胞RAW264.7和小膠質(zhì)細胞BV2作為抗炎活性篩選模型，對上述三個萃取部分進行活性篩選。取抗炎活性較好的部位乙酸乙酯浸膏(20 g)經(jīng)反相C18柱色譜，以甲醇-水(1 ∶4→1 ∶0，V/V)梯度洗脫，得13個組分Fr.E1～E13。Fr.E2(309 mg)經(jīng)正相硅膠柱色譜反復(fù)純化得化合物1(5.8 mg)。組分Fr.E3(500 mg)經(jīng)正相硅膠柱色譜，以二氯甲烷-甲醇(20 ∶1→1 ∶1，V/V)梯度洗脫，得化合物2(6.0 mg)和3(61.0 mg)。Fr.E5(796 mg)經(jīng)正相硅膠柱色譜分離，以正己烷-乙酸乙酯梯度洗脫，再經(jīng)甲醇反復(fù)重結(jié)晶純化，得無色針晶4(5.0 mg)。組分Fr.E8(1.3 g)先經(jīng)正相硅膠柱色譜分離，以三氯甲烷-甲醇(7 ∶1→1 ∶1，V/V)梯度洗脫，得9個亞組分Fr.E8.1～E8.9。Fr.E8.4(125 mg)經(jīng)硅膠柱色譜分離，以三氯甲烷-甲醇(10 ∶1，V/V)洗脫，得化合物5(41 mg)。Fr.E8.5(57 mg)經(jīng)硅膠柱色譜分離，以三氯甲烷-甲醇(5 ∶1，V/V)洗脫，得化合物6(24 mg)。Fr.E8.2(126 mg)經(jīng)反相C18柱色譜分離，以乙腈-水(1 ∶4，V/V)洗脫，再經(jīng)甲醇重結(jié)晶，得無色針晶8(14 mg)。組分Fr.E6(2.0 g)先經(jīng)反相C18柱色譜分離，以甲醇-水(1 ∶4→2 ∶3，V/V)梯度洗脫，得6個亞組分Fr.E6.1～E6.6；亞組分Fr.E6.4(1.4 g)再經(jīng)正相硅膠柱色譜分離，以三氯甲烷-甲醇-水(3 ∶1 ∶0.1，V/V/V)洗脫，得7個亞組分Fr.E6.4.1～E6.4.7。Fr.E6.4.1(244 mg)經(jīng)反復(fù)正相硅膠柱色譜分離純化，以正己烷-乙酸乙酯(3 ∶1～1 ∶3，V/V)為流動相，再經(jīng)正相制備薄層純化(正己烷-丙酮=2 ∶3，V/V)，得化合物11(1.8 mg)、12(5.0 mg)、13(8.8 mg)。亞組分Fr.E6.4.1.4(26 mg)經(jīng)C18-HPLC分離純化，以甲醇-水為流動相，得化合物14(2.0 mg)和15(7.5 mg)。Fr.E6.4.2(99 mg)先經(jīng)正相硅膠柱色譜，以三氯甲烷-甲醇(15 ∶1→10 ∶1，V/V)梯度洗脫，再經(jīng)C18-HPLC分離純化，以乙腈-水為流動相，得化合物7(2.1 mg)、10(2.5 mg)、17(2.5 mg)、18(2.3 mg)。Fr.E9(3.1 g)經(jīng)硅膠柱色譜分離純化，以正己烷-乙酸乙酯(3 ∶1→2 ∶1，V/V)為流動相，得化合物9(24 mg)。組分Fr.E10(1.9 g)先經(jīng)硅膠柱色譜反復(fù)分離純化，再經(jīng)甲醇重結(jié)晶脫色素處理得化合物16(34 mg)。

圖1 化合物1～18的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of compounds 1-18

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1無色針晶(甲醇)；1H NMR(400 MHz,CD3OD)δH：9.53(1H，s，-CHO)，7.38(1H，d，J=3.6 Hz，H-3)，6.58(1H，d，J=3.6 Hz，H-4)，4.60(2H，s，-CH2OH)；13C NMR(100 MHz,CD3OD)δC：152.6(C-2)，123.4(C-3)，109.6(C-4)，161.9(C-5)，56.3(C-6，-CH2OH)，178.1(C-7，-CHO)。以上數(shù)據(jù)與文獻[9]報道一致，故鑒定化合物1為5-羥甲基-2-糠醛。

化合物2白色粉末(甲醇)；1H NMR(400 MHz,CD3OD)δH：7.84(1H，s，H-6)，2.31(3H，s，2-CH3)；13C NMR(100 MHz,CD3OD)δC：150.5(C-2)，141.6(C-3)，168.9(C-4，C=O)，144.5(C-5)，139.1(C-6)，13.2(C-7，-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[10]報道一致，故鑒定化合物2為5-羥基麥芽酚。

化合物3無色針晶(甲醇)；1H NMR(400 MHz,CD3OD)δH：7.45(1H，d，J=2.0 Hz，H-2)，7.42(1H，dd，J=8.0，2.0 Hz，H-6)，6.79(1H，d，J=8.0 Hz，H-5)；13C NMR(100 MHz,CD3OD)δC：121.8(C-1)，116.5(C-2)，150.2(C-3)，144.7(C-4)，122.7(C-5)，114.5(C-6)，169.1(C-7，-COOH)。以上數(shù)據(jù)與文獻[11]報道一致，故鑒定化合物3為原兒茶酸。

化合物4無色針晶(甲醇)；UV254和365 nm均顯亮藍色熒光；1H NMR(400 MHz,CD3OD)δH：7.85(1H，d，J=9.6 Hz，H-4)，7.09(1H，s，H-5)，6.76(1H，s，H-8)，6.20(1H，d，J=9.6 Hz，H-3)，3.90(3H，s，-OCH3)；13C NMR(100 MHz,CD3OD)δC：162.7(C-2)，151.7(C-7)，150.1(C-9)，145.8(C-6)，144.8(C-4)，111.3(C-3)，111.2(C-10)，108.7(C-5)，102.7(C-8)，55.5(-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[12]報道一致，故鑒定化合物4為6-甲氧基-7-羥基香豆素。

化合物5黃色粉末(甲醇)；1H NMR(400 MHz,CD3OD)δH：8.05(2H，d，J=9.2 Hz，H-2′，6′)，6.88(2H，d，J=9.2 Hz，H-3′，5′)，6.38(1H，d，J=2.0 Hz，H-8)，6.19(1H，d，J=2.0 Hz，H-6)，5.24(1H，d，J=7.6 Hz，glc-H-1′′)，3.70～3.40(6H，m，H-2′′～6′′)；13C NMR(100 MHz,CD3OD)δC：157.2(C-2)，134.2(C-3)，178.2(C-4)，161.7(C-5)，98.6(C-6)，164.6(C-7)，93.5(C-8)，157.7(C-9)，104.4(C-10)，121.5(C-1′)，131.0(C-2′，6′)，114.8(C-3′，5′)，160.2(C-4′)，102.9(glc-C-1′′)，74.4(C-2′′)，76.7(C-3′′)，70.0(C-4′′)，77.1(C-5′′)，61.3(C-6′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[13]報道一致，故鑒定化合物5為山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物6黃色粉末(甲醇)；1H NMR(400 MHz,CD3OD)δH：8.06(2H，d，J=9.2 Hz，H-2′，6′)，6.89(2H，d，J=9.2 Hz，H-3′，5′)，6.41(1H，d，J=2.0 Hz，H-8)，6.21(1H，d，J=2.0 Hz，H-6)，5.10(1H，d，J=7.6 Hz，glc-H-1′′)，4.50(1H，d，J=1.2 Hz，rha-H-1′′′)，3.81(1H，dd，J=11.0，1.2 Hz，H-6′′a)，3.63(1H，m，H-6′′b)，3.70～3.20(8H，m，glc-H-2′′～5′′，rha-H-2′′′～5′′′)，1.12(3H，d，J=6.0 Hz，H-6′′′，rha-CH3)；13C NMR(100 MHz,CD3OD)δC：157.2(C-2)，134.2(C-3)，178.0(C-4)，161.6(C-5)，98.7(C-6)，164.7(C-7)，93.7(C-8)，158.2(C-9)，104.4(C-10)，121.4(C-1′)，131.1(C-2′，6′)，114.9(C-3′，5′)，160.2(C-4′)，103.4(glc-C-1′′)，74.4(C-2′′)，75.9(C-3′′)，70.2(C-4′′)，76.8(C-5′′)，67.3(C-6′′)，101.1(rha-C-1′′′)，70.8(C-2′′′)，71.0(C-3′′′)，72.6(C-4′′′)，68.4(C-5′′′)，16.6(C-6′′′，rha-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[14]報道一致，故鑒定化合物6為山柰酚-3-蕓香苷。

化合物10白色粉末(甲醇)；1H NMR(400 MHz,CD3OD)δH：7.42(2H，m，H-3′，5′)，7.31(2H，m，H-2′，6′)，7.23(1H，m，H-4′)，6.70(1H，d，J=16.0 Hz，H-3)，6.39(1H，dt，J=16.0，6.4 Hz，H-2)，4.55(1H，ddd，J=12.8，5.7，1.6 Hz，H-1a)，4.37(1H，d，J=7.6，Hz，H-1″)，4.33(1H，ddd，J=12.8，6.5，1.4 Hz，H-1b)，3.89(1H，dd，J=13.2，1.6 Hz，H-6″a)，3.69(1H，m，H-6″b)，3.20～3.37(4H，m，H-2″～5″)；13C NMR(100 MHz,CD3OD)δC：69.4(C-1)，125.4(C-2)，132.5(C-3)，136.9(C-1′)，126.2(C-2′，6′)，128.2(C-3′，5′)，127.4(C-4′)，102.1(glc-C-1′′)，73.8(C-2′′)，76.7(C-3′′)，70.4(C-4′′)，76.8(C-5′′)，61.5(C-6′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[18]報道一致，故鑒定化合物10為松香。

化合物11無色膠狀物質(zhì)(甲醇)；1H NMR(400 MHz,CDCl3)δH：7.34(5H，m，H-2～6)，4.91(1H，d，J=11.6 Hz，H-7a)，4.61(1H，d，J=11.6 Hz，H-7b)，4.35(1H，d，J=8.0 Hz，H-1′)，3.53(1H，m，H-3′)，3.42(3H，m，H-2′，4′，5′)，4.45(1H，d，J=12.4 Hz，H-6′a)，4.30(1H，d，J=12.4 Hz，H-6′b)，2.11(3H，s，H3-1′′，CH3CO-)；13C NMR(100 MHz,CDCl3)δC：136.9(C-1)，128.3(C-2，6)，128.6(C-3，5)，128.2(C-4)，71.3(C-7)，101.6(glc-C-1′)，73.7(C-2′)，76.0(C-3′)，70.0(C-4′)，74.1(C-5′)，63.4(C-6′)，21.0(C-1′′，CH3CO-)，171.9(C-2′′，CH3CO-)。以上數(shù)據(jù)與文獻[19]報道一致，故鑒定化合物11為苯甲基-β-D-吡喃葡萄糖苷-6′-O-醋酸酯。

化合物16白色粉末(甲醇)；1H NMR(400 MHz,CD3OD)δH：5.23(1H，t，J=3.6 Hz，H-12)，4.38(1H，d，J=7.6 Hz，GluA-H′-1)，3.77(1H，d，J=10.0 Hz，GluA-H′-5)，3.50(1H，t，J=9.2 Hz，GluA-H′-4)，3.36(1H，t，J=9.6 Hz，GluA-H′-3)，3.34(1H，s，GluA-H′-2)，3.24(1H，m，H-3)，3.18(1H，dd，J=11.2，4.0 Hz，H-18)，0.80，0.84，0.90，0.93，0.94，1.05，1.16(each 3H，s，7 × -CH3)；13C NMR(100 MHz,CD3OD)δC：38.5(C-1)，25.7(C-2)，89.8(C-3)，38.9(C-4)，55.7(C-5)，18.0(C-6)，32.5(C-7)，39.3(C-8)，47.7(C-9)，36.6(C-10)，22.8(C-11)，122.4(C-12)，143.8(C-13)，41.6(C-14)，27.5(C-15)，23.2(C-16)，46.3(C-17)，41.4(C-18)，46.0(C-19)，30.3(C-20)，33.6(C-21)，32.7(C-22)，27.2(C-23)，15.7(C-24)，14.7(C-25)，16.4(C-26)，25.2(C-27)，180.5(C-28)，22.7(C-29)，32.3(C-30)，105.7(glc-C-1′)，74.0(C-2′)，76.4(C-3′)，71.9(C-4′)，75.2(C-5′)，171.4(C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[24]報道一致，故鑒定化合物16為齊墩果酸-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷。

4 活性測定

MTT法細胞毒性試驗：取對數(shù)生長期BV2細胞接種于96孔板中(1×105個細胞/孔)，37℃、5% CO2條件下溫孵培養(yǎng)12 h后，給藥組分別加入不同濃度的待測樣品(終濃度分別為5、10、20、40、80 μM)，同時每種藥物均設(shè)加入或不加入LPS(1 μg/mL)兩組。溶劑對照組均不加入受試藥物及LPS，但加入體積分數(shù)為0.1%的DMSO。繼續(xù)溫孵培養(yǎng)12 h后，每孔取出100 μL上清液，加入終質(zhì)量濃度為100 mg/mL的MTT工作液孵育0.5 h。形成的甲臜鹽使用酸化異丙醇溶解，在酶標儀(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)540 nm處測定各孔吸光度(A)值，以正常組細胞(未處理)的A值所對應(yīng)的細胞存活率為100%，計算細胞存活率。每組重復(fù)3次獨立實驗，結(jié)果見表1。

NO抑制試驗：采用Griess法檢測對LPS刺激下的BV2細胞分泌NO的抑制作用。取對數(shù)生長期BV2細胞接種于96孔板中(1×105個細胞/孔)，37 ℃、5% CO2條件下溫孵培養(yǎng)12 h后加入100 μL不同濃度的待測樣品(終濃度分別為5、10、20、40、80 μM)，溫孵培養(yǎng)1 h后加入100 μL的LPS(1 μg/mL)，同時設(shè)模型組(LPS+培養(yǎng)液)、陽性對照組(紫鉚因+LPS+培養(yǎng)液)、空白對照組(培養(yǎng)液)，繼續(xù)溫孵培養(yǎng)12 h。每組重復(fù)3次獨立實驗。將上清液(100 mL)與等體積的格氏試劑混合，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定混合物在540 nm處的A值，計算NO抑制率，結(jié)果見表1。

表1 化合物1～18對LPS誘導(dǎo)的小鼠小膠質(zhì)細胞BV2的細胞毒性和一氧化氮產(chǎn)生的抑制效果

注：每組數(shù)據(jù)均以三次獨立的重復(fù)實驗的平均值±SD表示。a化合物16在測試濃度達到 40～80 μM時具有較強的細胞毒性，測試抗炎結(jié)果無實際意義；在安全濃度范圍0～20 μM且在5 μM濃度時，其表現(xiàn)出了相對較好的NO抑制效果，抑制率為20.6%。Note:Each group of data is represented by the mean ± SD of three independent repeated experiments.aCompound 16 shows strong cytotoxicity when the tested concentration reaches 40-80 μM,and it has no practical significance for the test of anti-inflammatory activity.In the safe concentration range of 0-20 μM and at 5 μM,it showed a moderate NO inhibition effect with the inhibition rate 20.6%.

5 結(jié)論

本文基于脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞BV2模型，首次對糙葉五加果實進行了抗炎活性導(dǎo)向下的化學(xué)成分研究，從抗炎活性較好的乙酸乙酯萃取部位中分離鑒定出了18個單體化合物，包括5個木脂素、4個單萜、2個黃酮苷、1個酚酸、1個香豆素、1個苯丙素苷、1個糠醛、1個麥芽酚類、1個苯甲苷和1個三萜苷，其主要成分類型為木脂素和單萜類；而其葉的化學(xué)成分研究，已報道了31個化合物，包括16個三萜皂苷、5個黃酮、6個咖啡酰基奎寧酸、1個蒽醌、1個脂肪酰胺苷、1個有機酸、1個甾體苷[2-5]，葉的主要成分為三萜皂苷、黃酮和咖啡酰基奎寧酸；前期研究中對糙葉五加莖報道了18個化合物，包括8個酚類、5個咖啡?；鼘幩犷?、2個植物甾醇、1個木脂素、1個香豆素、1個長鏈脂肪酸，其主要成分類型為酚類和咖啡?；鼘幩犷?；而對糙葉五加花報道的17個化合物中，包括9個咖啡?；鼘幩犷?、6個黃酮及其苷類、1個木脂素苷類、1個苯丙素苷類，其主要成分為二取代的咖啡?；鼘幩犷惣皫в虚纹に鼗蛏侥畏幽负说狞S酮類。比較果實、葉、莖和花的化學(xué)成分發(fā)現(xiàn)，它們的物質(zhì)基礎(chǔ)均存在明顯的差異，表明各不同部位有著不同的用途。

對所得的化合物進行抗炎活性篩選發(fā)現(xiàn)，被測試化合物均表現(xiàn)出了一定的一氧化氮(NO)抑制活性，其中，化合物1、4、7、9、12、13、18表現(xiàn)出了較好的抑制NO生成的活性，對于這些單體化合物的潛在抗炎活性研究有待進一步進行。本文進一步豐富了五加科五加屬植物的研究內(nèi)容，同時為中國特產(chǎn)植物糙葉五加的研究提供一定的參考和借鑒。