張茜

（上海藥明康德新藥開(kāi)發(fā)有限公司，上海 200131）

組織工程學(xué)經(jīng)過(guò)33年的發(fā)展，已經(jīng)成為一門(mén)研究開(kāi)發(fā)生物活性替代物的專(zhuān)業(yè)學(xué)科。血管組織工程技術(shù)是利用血管細(xì)胞與可降解材料來(lái)構(gòu)建血管替代物的一門(mén)技術(shù)，血管支架是血管組織工程的重中之重，靜電紡絲法以其獨(dú)特的技術(shù)為血管的修復(fù)和移植提供了一種新的選擇。以玉米為主要原料的聚乳酸，具有良好的生物性能，且無(wú)毒性、可降解，可以廣泛用于藥理學(xué)研究及臨床研究等方面。海藻多糖是一種水溶性多糖，易于人體吸收，生物活性強(qiáng)，且原料豐富易于提取。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

海藻多糖，西安西海生物科技有限公司；聚乳酸，上海塑享貿(mào)易有限公司；明膠，上海山浦化工有限公司；草酸銨和EDTA-Na2為分析純，蘭州科器化玻有限公司；氯仿和無(wú)水乙醇為分析純，天津市富寧精細(xì)化工有限公司；蒸餾水，蘭州鋒源純凈水有限公司；小鼠血清，蘭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

TJ-1000高壓靜電發(fā)生，天津大學(xué)現(xiàn)代科技有限公司；移液槍?zhuān)?0～1 000 μL），蘭州博輝化玻儀器有限公司；IX71-A21PH光學(xué)顯微鏡，奧林巴斯；ES-2002H電子天平，長(zhǎng)沙湘平科技發(fā)展有限公司；游標(biāo)卡尺，蘭州科器化玻有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，國(guó)華電器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 聚乳酸溶液的配制

取干燥潔凈的燒杯，準(zhǔn)確稱(chēng)取 0.6 g、0.8 g、1.0 g和1.2 g聚乳酸后，加入10 mL氯仿，密封、靜置，溶解后攪拌至澄清，制得6%，8%，10%，12%不同濃度的聚乳酸溶液。

1.2.2 多糖明膠溶液的配制

多糖明膠溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取 0.2 g、0.4 g、0.6 g、0.8 g和1.0 g多糖至潔凈干燥的燒杯中，加入10 mL蒸餾水，配置成濃度為2%、4%、6%、8%和10%的多糖溶液，加熱溶解，后準(zhǔn)確稱(chēng)取7.0 g明膠，加入已溶解的多糖溶液中，加熱振蕩使溶解完全。

1.2.3 復(fù)合電紡支架的構(gòu)建

靜電紡裝置見(jiàn)圖1。由于多糖溶液和聚乳酸溶液互不相容，因此采用夾層靜電紡絲方法，并以旋轉(zhuǎn)的軸心來(lái)收集帶電的聚合物射流形成的細(xì)絲，先在旋轉(zhuǎn)軸上收集10%的聚乳酸形成纖維層，隨后覆蓋一層多糖纖維，然后繼續(xù)收集聚乳酸纖維層，重復(fù)幾次。

收集聚乳酸時(shí)采用自動(dòng)裝置，用1 mL的玻璃針管吸取不同濃度聚乳酸1 mL，用鐵架臺(tái)固定，使針管和地面豎直，調(diào)整接收距離為12 cm，高壓靜電發(fā)生器的電源電壓設(shè)置為12 kV，收集裝置接地，注射泵流速設(shè)為0.8 mL/h，開(kāi)通電源。收集多糖時(shí)采用手推裝置，用1 mL塑料針管吸取不同濃度多糖溶液，用鐵架臺(tái)固定，使針管和地面平行，接收距為10 cm，針頭接15 kV的電壓，收集裝置接地，開(kāi)通電源。改變接收距、電源電壓和注射泵流速，構(gòu)建不同參數(shù)下的復(fù)合電紡支架。

圖1 聚乳酸靜電紡裝置（a）和多糖靜電紡裝置（b）

1.2.4 力學(xué)性能測(cè)定

（1）抗拉強(qiáng)度：從不同濃度的復(fù)合電紡支架上切取3段3.00 cm的支架，每段任意選擇5點(diǎn)測(cè)其厚度，計(jì)算其平均值，即為厚度，計(jì)算橫截面積；任取一段支架，一端固定，另一端用夾子固定在空的礦泉水瓶中，使整個(gè)裝置垂直于地面，然后慢慢向礦泉水瓶中加水，直到細(xì)長(zhǎng)條斷裂，稱(chēng)量礦泉水的重量，計(jì)算出最大荷重，按照公式1計(jì)算抗拉強(qiáng)度。

（2）斷裂伸長(zhǎng)率：從不同濃度的復(fù)合支架上切取2.00 cm的支架，固定在游標(biāo)卡尺上，適量拉伸，直到即將斷裂，用游標(biāo)卡尺計(jì)算出拉伸后的長(zhǎng)度，按照公式2計(jì)算斷裂伸長(zhǎng)率。

（3）爆破強(qiáng)度：取最優(yōu)工藝的電紡管狀支架1 cm，鋪成矩形，取緊鄰6個(gè)點(diǎn)測(cè)最大爆破強(qiáng)度，然后用其堵住真空泵，打開(kāi)真空泵，在壓力表上讀出數(shù)據(jù)，即為爆破強(qiáng)度。

1.2.5 血小板黏附性實(shí)驗(yàn)

（1）血液的稀釋抗凝

無(wú)抗凝劑的新鮮血液，一段時(shí)間后會(huì)自動(dòng)結(jié)塊，無(wú)法用來(lái)測(cè)量血小板的黏附性實(shí)驗(yàn)。為了讓血液保持完好且不影響血小板的形狀，必須在新鮮的血液里添加抗凝劑。實(shí)驗(yàn)中選用草酸銨稀釋液阻止血液凝固，稀釋之后血小板形態(tài)清晰，便于觀察。

草酸銨稀釋液的配制方法為：準(zhǔn)確秤取5.0 g草酸銨、0.06 g EDTA-Na2，加適量蒸餾水使其完全溶解；為除去溶液里面的雜質(zhì)，用多層濾紙過(guò)濾2次，以防雜質(zhì)干擾血小板的觀察；然后把濾液定容至500 mL即可；密封好，保存在4 ℃的冰箱里備用。

取1.0 mL新鮮血液，加入配好的草酸銨稀釋至10 mL，裝入離心管中，總共取5管，存4 ℃冰箱備用。

（2）血小板黏附性實(shí)驗(yàn)

把原來(lái)稀釋10倍的血液用移液槍取出5 mL置于10 mL離心管中，加2.5 mL草酸銨稀釋液制得血液的15倍稀釋液；然后用移液槍取200 μL置于計(jì)數(shù)板中，靜置5 min后在光學(xué)顯微鏡的高倍鏡下，觀察血小板數(shù)并記錄，得出黏附前血小板數(shù)目。

準(zhǔn)備含有0%、2%、4%、6%、8%和10%多糖的聚乳酸復(fù)合電紡，用剪刀小心地剪取6段長(zhǎng)度均為0.8 mm的電紡支架，并沿著管孔把血管支架剪開(kāi)，形成一矩形即可。準(zhǔn)備1個(gè)大培養(yǎng)皿和6個(gè)潔凈干燥的小培養(yǎng)皿，分別編號(hào)1～6。把事先準(zhǔn)備好的6段電放支架依次放入6個(gè)小培養(yǎng)皿，分別添加1 mL草酸銨稀釋液，蓋上蓋子后放入大培養(yǎng)皿中，然后在恒溫38 ℃水浴鍋中孵育20 min。20 min后盡量倒干6個(gè)小培養(yǎng)皿中的稀釋液，再向小培養(yǎng)皿各加500 μL的血液15倍稀釋液。蓋上蓋子，在38 ℃水浴鍋中保溫40 min后取出，用鑷子夾著電紡膜，小心緩慢地用500 μL草酸銨稀釋液清洗掉電紡膜上的血液，清洗液合并到原來(lái)的小培養(yǎng)皿中，即血液由15倍變?yōu)?0倍。然后用移液槍取200 μL小培養(yǎng)皿中的血液置計(jì)數(shù)板中，靜置5 min后在光學(xué)顯微鏡的高倍鏡下，觀察血小板數(shù)，并記錄數(shù)據(jù)，得出黏附后的血小板數(shù)目。按照公式3計(jì)算血小板的黏附率。

2 結(jié)果與分析

2.1 電紡工藝

2.1.1 聚乳酸和多糖的濃度

（1）聚乳酸濃度

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)聚乳酸含量過(guò)低時(shí)，溶液太稀，即使高壓條件也無(wú)法形成纖維；含量過(guò)高時(shí)，溶液太黏，噴射液會(huì)堵塞針頭，并且纖維過(guò)粗過(guò)硬。見(jiàn)表1，因此，最終將聚乳酸濃度設(shè)為10%。

（2）多糖濃度

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，以不同濃度梯度（2%、4%、6%、8%和10%）的多糖溶液進(jìn)行紡絲，發(fā)現(xiàn)不同濃度的多糖都能形成電紡纖維。因此，多糖濃度并不是影響電紡纖維的主要因素。

2.1.2 接收距

接收距能夠影響納米纖維形態(tài)的參數(shù)。實(shí)驗(yàn)中，在電場(chǎng)不被干擾的情況下，當(dāng)接收距取值較小時(shí)，出絲效果不明顯，呈液滴狀態(tài)，很難形成纖維；當(dāng)接收距過(guò)大，電紡產(chǎn)生的纖維難以集中于滾軸收集器上，在收集器的周?chē)半妶?chǎng)外都有分布。通過(guò)實(shí)驗(yàn)，最終確定最優(yōu)的聚乳酸接收距為12 cm，多糖接受距為13 cm。

2.1.3 電壓

在其他因素一定的條件下，實(shí)驗(yàn)設(shè)定了電壓分別為10 kV、15 kV和20 kV的電場(chǎng)。當(dāng)電壓為10 kV時(shí)，噴射流開(kāi)始釋放，卻并不流暢，導(dǎo)致滾軸收集器形成的電紡纖維不夠連續(xù)；電壓升高至15 kV，滾軸收集器形成的電紡管狀支架很理想；當(dāng)電壓繼續(xù)升高至20 kV，電場(chǎng)強(qiáng)度的增大使得多次紡絲形成的纖維出現(xiàn)更多的缺陷。因此，電壓取15 kV為宜。

2.1.4 紡絲液流速

相關(guān)研究表明，紡絲液流速是影響纖維形態(tài)的次級(jí)因素之一[17]。紡絲液流速和電壓是兩個(gè)互相作用的參數(shù)，其一值的變化會(huì)引起另一值的改變?？紤]到電壓的設(shè)定，流速也將隨之調(diào)整。綜合考慮所有參數(shù)，將聚乳酸紡絲液流速設(shè)定為3個(gè)值：0.2 mL/h、0.8 mL/h和1.0 mL/h。當(dāng)流速太慢時(shí)，電紡過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生小液珠滴落的現(xiàn)象，影響成絲效果；流速過(guò)快時(shí)，電紡產(chǎn)生的纖維會(huì)出現(xiàn)過(guò)多孔眼。因此，將聚乳酸紡絲液流速的優(yōu)化值設(shè)定為0.8 mL/h。另外多糖明膠溶液紡絲時(shí)流速控制是關(guān)鍵，流速過(guò)快時(shí)，因轉(zhuǎn)速一定，出絲量大，使得滾軸收集到的纖維絲纏繞得松散不緊密，最終導(dǎo)致紡出的管子強(qiáng)度不夠；流速過(guò)慢時(shí)，針頭易被堵塞，很難出絲。因此，多糖明膠紡絲液的流速優(yōu)化值設(shè)定為4.8 mL/h，此條件下形成的電紡纖維形狀較為完好。

表1 不同濃度聚乳酸纖維現(xiàn)象

2.2 力學(xué)性能

2.2.1 抗拉強(qiáng)度

由于靜電紡絲的原理和方法相同，測(cè)得平均厚度均為0.042 cm，則原橫截面積為s=0.5×0.042=0.021 cm2（g=9.8 N/kg，1 N/cm2=1 Pa=10-3kPa）。不同多糖濃度的電紡支架抗拉強(qiáng)度結(jié)果見(jiàn)表2。當(dāng)厚度一定，即橫截面積不變時(shí)，隨著多糖濃度的增加，抗拉強(qiáng)度呈上升趨勢(shì)。

表2 不同多糖濃度的電紡支架的抗拉強(qiáng)度

2.2.2 斷裂伸長(zhǎng)率

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，所截取的細(xì)長(zhǎng)條長(zhǎng)度均為2.00 cm，即拉伸前長(zhǎng)度為2.00 cm。不同多糖濃度的電紡支架的斷裂強(qiáng)度見(jiàn)表3。當(dāng)厚度一定，即橫截面積不變時(shí)，隨著多糖濃度的增加，斷裂伸長(zhǎng)率基本在30%附近波動(dòng)。

表3 不同多糖濃度的電紡支架的斷裂強(qiáng)度

2.2.3 爆破強(qiáng)度

取聚乳酸濃度為10%、接收距離為12 cm、電壓為12 kV、紡絲液流速為0.8 mL/h；海藻多糖明膠溶液靜電紡絲接受距離為10 cm、電壓為15 kV、流速為4.8 mL/h時(shí)的電紡管狀支架1.0 cm，鋪成矩形，取緊鄰6個(gè)點(diǎn)測(cè)最大爆破強(qiáng)度，真空泵壓力表上的讀數(shù)分別為0.050 MPa、0.046 MPa、0.052 MPa、0.050 MPa、0.048 MPa和 0.046 MPa，取平均值為0.048 MPa。這一數(shù)值遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了人體血管所能承受的壓力。

2.2.4 血小板粘附實(shí)驗(yàn)

15倍血液黏附前的血小板總數(shù)取3次平行測(cè)定結(jié)果的平均值，結(jié)果為127.66。不同多糖濃度的電紡支架血小板黏附率如表4所示。隨多糖濃度升高，電紡支架的粘附率逐漸減小，而表中6%多糖濃度的血管支架的粘附率出現(xiàn)偏差，可能是紡絲過(guò)程中出現(xiàn)誤差，或者是測(cè)血小板粘附性時(shí)，育孵、顯微鏡計(jì)數(shù)板讀數(shù)時(shí)產(chǎn)生讀數(shù)誤差，使得該濃度下的粘附率出現(xiàn)偏高。但8%、10%濃度支架的粘附率均低于2%、4%的支架的粘附率，總體上血管支架的粘附率隨多糖濃度的升高而降低，10%聚乳酸的電紡支架在相同條件下未添加多糖時(shí)對(duì)血小板的黏附率最高。

表4 不同多糖濃度的電紡支架血小板粘附率

3 討論

實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建電紡支架時(shí)，如果聚乳酸的溶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，造成氯仿?lián)]發(fā)過(guò)多，會(huì)使得聚乳酸的濃度過(guò)大，流速減慢，容易使針頭堵塞，紡出的電紡管狀支架過(guò)硬過(guò)脆，無(wú)法達(dá)到預(yù)期要求；紡聚乳酸時(shí)，利用重力場(chǎng)作用，若轉(zhuǎn)軸的接收距離控制不好，會(huì)造成紡出的絲很難接收，通過(guò)改進(jìn)，在重力場(chǎng)和電場(chǎng)力的同時(shí)作用下，聚乳酸溶液可以順利出絲，成絲效果很理想；紡多糖時(shí)采用手推法，流速控制不好會(huì)使得噴出的絲粗細(xì)不均勻，且時(shí)間掌握不好針頭容易堵塞，通過(guò)對(duì)裝置改進(jìn)并熟練操作過(guò)程，可以使得紡出的電紡支架韌性、柔軟性都很好。

正常情況下，人體股動(dòng)脈理論抗拉強(qiáng)度為0.7～1.0 MPa，理論斷裂伸長(zhǎng)率36%～46%?，F(xiàn)階段使用的人造血管，是由膨體聚四氟乙烯材料制成，其抗拉強(qiáng)度為0.6～1.5 MPa，斷裂伸長(zhǎng)率為20%～30%。實(shí)驗(yàn)制備的復(fù)合電紡支架在多糖濃度為10%時(shí)，更接近人體股動(dòng)脈的抗拉強(qiáng)度。多糖濃度為4%、6%、8%時(shí)，復(fù)合電紡管狀支架的斷裂伸長(zhǎng)率接近正常人體股動(dòng)脈的斷裂伸長(zhǎng)率。因此，當(dāng)聚乳酸濃度為10%，多糖濃度為10%時(shí)，復(fù)合電紡人造血管的抗拉強(qiáng)度和斷裂伸長(zhǎng)率均高于或接近人體血管，抗拉強(qiáng)度和斷裂生長(zhǎng)率符合移植的基本要求。另外，復(fù)合電紡的爆破強(qiáng)度也是主要影響因素，人體在正常靜息狀態(tài)下的血壓值收縮壓不超過(guò)140 mmHg，舒張壓不超過(guò)90 mmHg，隱靜脈承受的最大壓力為（1 680±307）mmHg，約合（223.0±40.8）kPa。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所得到的爆破強(qiáng)度值為483 kPa，符合要求。因此復(fù)合管裝支架的力學(xué)性能接近人造血管。

本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)加入海藻多糖明顯改善了純PLA的血液相容性，能夠更好地抑制血小板的黏附，即在純PLA中加入海藻多糖后，復(fù)合電紡材料的抗黏附率更好。另外，海藻多糖的加入改變了復(fù)合電紡材料的表面電荷和和化學(xué)結(jié)構(gòu)，同時(shí)由于硫酸根基團(tuán)與硫酸纖維素鈉的抗凝血活性的影響，使得加了海藻多糖后的復(fù)合材料具有良好的血液相容性。

4 結(jié)論

采用復(fù)合管狀支架的靜電紡絲法，以高速旋轉(zhuǎn)的軸心收集帶電的聚合物射流形成的細(xì)絲，成功構(gòu)建了PLA/海藻多糖復(fù)合電紡管狀支架。隨著多糖的加入，復(fù)合電紡管狀支架的韌性增加，斷裂伸長(zhǎng)率基本維持在一定的范圍內(nèi)，血小板粘附性整體呈下降趨勢(shì)。說(shuō)明材料的血液相容性得到了明顯的改善。濃度為10%聚乳酸、10%多糖的復(fù)合電紡管狀支架的爆破強(qiáng)度超過(guò)人體血管所承受的最大壓力，且血小板粘附率最低，可作為血管移植工程的人造血管。