王素星，魏金剛，邵偉華，呂彩霞，苑曉燁△

(1.河北省人民醫(yī)院老年病二科，石家莊 050051；2.石家莊市第五醫(yī)院外科，河北 石家莊 050000)

追趕生長是機體在營養(yǎng)、疾病等不利因素影響下出現(xiàn)生長抑制，在相關(guān)因素解除后出現(xiàn)的快速生長現(xiàn)象，可出現(xiàn)在胎兒期、嬰幼兒期、青少年期和成年期[1，2]。隨著經(jīng)濟的發(fā)展，人民生活水平的提高，孕期保健的重視，低體重兒的出生率大大降低，普遍意義上的幼年追趕生長現(xiàn)象在逐步減少，而成年期追趕生長現(xiàn)象更為常見。在神經(jīng)性厭食癥、各種消耗性疾病、刻意的減重過度等所致體重下降后體重恢復的成年人中觀察到了追趕生長現(xiàn)象[3,4]。成年期追趕生長在限制飲食后的重飼過程中，熱卡攝入量發(fā)生了顯著變化。眾所周知，飲食變化會對身體成分產(chǎn)生重要影響[5]。白藜蘆醇是一種存在于紅酒中的多酚，以往的研究表明，白藜蘆醇可以抑制脂肪生成，刺激脂肪分解，增加脂肪酸氧化和熱生成[6]，同時白藜蘆醇也能誘發(fā)肌管肥大，影響肌肉代謝[7]。然而，目前尚未發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇對成年期追趕生長模型中體成分的影響。本文以限制熱卡，進而恢復正常飲食的成年大鼠為模型，觀察成年期追趕生長過程中大鼠的體成分發(fā)生了怎樣的變化，白藜蘆醇的干預效應(yīng)及其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及實驗設(shè)計

36只8周齡雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按隨機數(shù)字表法分為6組(共2個時間點)，即4周時間點3組:正常飲食4周(NC4)組、熱卡限制4周(R4)組，熱卡限制同時白藜蘆醇治療(R4E)組；12周時間點3組：正常飲食12周(NC12)組，追趕生長(CUG)組，追趕生長白藜蘆醇治療(CUGE)組。每組含6只大鼠，具體分組見圖1。其中，R4E組為限食同時予以白藜蘆醇治療4周，追趕生長CUG組為限食4周+8周正常飲食，追趕生長+白藜蘆醇干預CUGE組為限食4周+8周(正常飲食+白藜蘆醇治療)。動物及普通飼料均購自河北醫(yī)科大學實驗動物學部。NC組自由進食，限食期間予以60%NC 組體重匹配大鼠進食量，追趕生長期間給予100% NC組體重匹配大鼠進食量。白藜蘆醇(Sigma,St Louis,MO)用生理鹽水配制成一定濃度懸濁液，用時混勻，按100 mg/(kg·d)劑量予實驗動物灌胃治療。分別于4和12周末進行實驗指標檢測。

Fig. 1 The experimental design

NC4/NC12: Normal chow for 4 w or 12 w; CUG: Catch-up growth; R4: Caloric restriction for 4 w; E: Resveratrol treatment

1.2 體重及能量攝入量

電子秤稱取實驗動物每日食物攝入重量及體重(精確至0.1 g)，以“周”為單位計算動物每周平均每天能量攝入量。

1.3 體成分測定

大鼠禁食過夜，選用美國GE Lunar公司生產(chǎn)的雙能X線吸收測量儀(Dual Energy X-ray Absorptiometry,DEXA)行軀干及全身的體成分測定。分析不同部位脂肪含量、肌肉含量及軀干與全身脂肪比例。

1.4 標本收集

實驗結(jié)束后以致死量戊巴比妥鈉腹腔注射(150 mg/kg)處死大鼠，迅速剝離附睪脂肪和脛骨前肌標本，置-80℃冰箱凍存留作Western blot檢測沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1, SIRT1)及過氧化物酶體增殖劑激活受體γ(peroxisome proliferators-activated receptor γ, PPARγ)。附睪脂肪和腎周脂肪組織作為內(nèi)臟脂肪的重要組成部分，鑒于課題組既往留取附睪脂肪組織較多，技術(shù)嫻熟，故選取附睪脂肪組織作為內(nèi)臟脂肪的代表。

1.5 Western blot

參照文獻[8]方法提取并定量組織蛋白。取40 g蛋白樣品行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，分別用SIRT1(1∶2 000，Abcam公司)、PPARγ(1∶2 500，Abcam公司)、β-actin(1∶1 000，SantaCruz公司)4℃孵育過夜；次日洗膜、二抗(1∶4 000，Pierce公司)孵育1 h、ECL化學發(fā)光試劑凝膠顯影。實驗以β-actin為內(nèi)參, Western blot條帶用Quantity One軟件進行圖像灰度分析。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 實驗大鼠體重比較

限制飲食4周后，R4組實驗動物體重明顯低于正常對照NC4組(P<0.01)；開放飲食后，CUG組體重表現(xiàn)為快速增長，但至實驗結(jié)束仍較正常對照NC12組低(P<0.05)；白藜蘆醇干預后，R4E組、CUGE組體重輕度下降，但分別與R4組及CUG組相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05，表1)。

2.2 軀干體成分的變化

與NC4組相比，R4組軀干肌肉含量及脂肪含量無明顯變化(P>0.05，表1)。12周末，CUG組的軀干肌肉含量較NC12組顯著下降，軀干脂肪含量明顯升高(P<0.01)。相對于R4組，CUG組在追趕生長過程中軀干肌肉及脂肪含量改變較明顯。白藜蘆醇干預后，熱卡限制組和追趕生長組的軀干脂肪含量較未干預組均顯著下降(P<0.01)，CUGE組的軀干肌肉含量明顯升高，達到NC組水平(P> 0.05)。白藜蘆醇對熱卡限制組的軀干肌肉含量無明顯影響。

GroupTrunkmusclecontent(%)Trunkfatcontent(%)Bodyweight(g)(a)NC470.955±0.4667.985±0.667264.83±8.78R469.093±0.3298.117±0.204174.75±6.89R4E69.073±0.2847.525±0.261##165.45±7.61##(b)NC1269.343±0.4159.198±0.569379.57±9.59CUG66.275±0.373△△11.890±0.337△△359.43±8.99△CUGE68.612±0.353▲▲8.955±0.399▲▲350.12±9.43▲

NC4/NC12: Normal chow for 4 w or 12 w; R4: Caloric restriction for 4 w; CUG: Catch-up growth; E: Resveratrol treatment

##P<0.01vsR4 group;△P<0.05，△△P<0.01vsNC12 group；▲▲P<0.01vsCUG group

2.3 全身體成分的變化

R4組全身肌肉含量、脂肪含量及軀干與全身脂肪比例與NC4組相比無明顯變化(P>0.05)。12周末，CUG組的全身肌肉含量較NC12組顯著下降，全身脂肪含量明顯升高(P<0.01)，同時軀干與全身脂肪比例較NC12組亦明顯升高(P<0.05)。與R4組相比，CUG組在追趕生長過程中以上三指標的改變較為顯著。白藜蘆醇使全身脂肪含量顯著下降(P<0.05,P<0.01)，軀干與全身脂肪比例亦呈明顯降低趨勢(P<0.01,P<0.05)，恢復至正常對照組水平(P>0.05)。同時CUGE組的全身肌肉含量明顯升高，達到NC12組水平(P>0.05)，R4E組全身肌肉含量無明顯變化(表2)。

GroupWBmusclecontent(%)WBfatcontent(%)TrunktoWBfatratio(a)NC486.845±0.60411.243±0.6110.662±0.020R485.343±0.31812.045±0.3230.692±0.025R4E85.717±1.38310.110±0.443#0.640±0.002##(b)NC1285.402±0.60311.963±0.6150.703±0.015CUG81.942±0.211△△15.802±0.249△△0.748±0.012△CUGE85.793±0.624▲▲11.878±0.646▲▲0.702±0.007▲

NC4/NC12: Normal chow for 4 w or 12 w; R4: Caloric restriction for 4 w; CUG: Catch-up growth; E: Resveratrol treatment

#P<0.05，##P<0.01vsR4 group;△P<0.05，△△P<0.01vsNC12 group；▲P<0.05，▲▲P<0.01vsCUG group

2.4 Western blot檢測SIRT1、PPARγ蛋白質(zhì)的表達

追趕生長結(jié)束時，CUG組附睪脂肪和骨骼肌SIRT1表達均低于NC12組(P均<0.01)，附睪脂肪PPARγ表達高于NC12組(P<0.01)。白藜蘆醇干預后，CUGE組附睪脂肪和骨骼肌SIRT1表達較CUG組明顯升高(P均<0.01)，與NC12組無明顯統(tǒng)計學差異(P>0.05)，附睪脂肪PPARγ表達較干預前明顯降低，且低于NC12組(P<0.05，圖2，表3)。

Fig. 2 SIRT1 and PPARγ protein expressions in 12-week group

NC12: Normal chow for 12 w; CUG: Catch-up growth; E: Resveratrol treatment

GroupSIRT1/β-actin(epididymaladiposetissue)PPARγ/β-actin(epididymaladiposetissue)SIRT1/β-actin(skeletalmuscle)NC120.751±0.0240.405±0.0270.928±0.033CUG0.409±0.011△△0.495±0.019△△0.618±0.022△△CUGE0.809±0.019▲▲0.348±0.017△▲▲1.026±0.037△▲▲

NC12: Normal chow for 12 w; CUG: Catch-up growth; E: Resveratrol treatment

△P<0.05，△△P<0.01vsNC12 group;▲▲P<0.01vsCUG group

3 討論

近年來，研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇具有改善胰島素抵抗、降低血糖、調(diào)節(jié)脂代謝等作用[9,10]。本研究顯示白藜蘆醇在追趕生長的不同階段均可顯著降低軀干和全身的體脂含量，同時降低腹部脂肪與全身脂肪的比例，減輕腹部脂肪堆積。我們亦發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇在降低體脂成分的同時，可以增加追趕生長大鼠的肌肉含量。諸多研究也顯示白藜蘆醇與脂質(zhì)和肌肉代謝密切相關(guān)。白藜蘆醇能夠增加腓腸肌和肩胛棕色脂肪兩大產(chǎn)熱組織能量消耗，從而起到調(diào)控生熱作用[11]。它亦可影響內(nèi)臟脂肪組織RBP4 蛋白表達，降低脂質(zhì)含量，并增加脂解酶的表達，增加脂肪組織的脂解作用，從而降低體脂含量，增強胰島素敏感性[11,12]。

追趕生長是能量改變的過程，而沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1, SIRT1)是體內(nèi)重要的能量代謝感受器,可感知機體的能量代謝狀態(tài),通過改變下游分子的基因表達或活性調(diào)節(jié)機體能量代謝[13]。SIRT1作為白藜蘆醇的主要作用靶點，通過脫乙酰作用抑制脂肪生成相關(guān)基因過氧化物增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator activated receptor, PPARγ)轉(zhuǎn)錄活性,從而抑制脂肪細胞分化,降低脂肪沉積,促進脂肪動員[14]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，在追趕生長結(jié)束時附睪脂肪組織SIRT1的表達明顯減少，進而對PPARγ的抑制作用減低，使PPARγ在追趕過程中表達增加，促使脂質(zhì)合成增加，軀干部脂肪比例增加。而白藜蘆醇可提升附睪脂肪組織SIRT1的表達，后者表達的增加抑制了PPARγ的表達，進而使脂質(zhì)合成減少，體脂含量降低。

眾多研究顯示，白藜蘆醇與肌肉代謝密切相關(guān)，它可誘發(fā)肌管肥大，促進受損肌管的生長，有助于維持肌肉細胞功能和再生[15,16]。Wang等人[6]發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可以激活AMPK/SIRT1途徑，抑制肌細胞凋亡，改善肌肉質(zhì)量，預防肌萎縮[6]。本研究亦顯示，成年期追趕生長大鼠骨骼肌組織SIRT1的表達下降，肌肉含量降低，經(jīng)白藜蘆醇治療后，大鼠骨骼肌SIRT1的表達顯著增加，同時肌肉含量增加。由此我們推測，白藜蘆醇對成年期追趕生長大鼠肌肉代謝的影響通過激活SIRT1途徑實現(xiàn)的。

值得注意的是，在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇增加肌肉含量作用的發(fā)揮與能量供應(yīng)相關(guān)。在熱卡限制期間，白藜蘆醇對肌肉含量無明顯提升作用，開放飲食后，白藜蘆醇顯著增加軀干及全身的肌肉含量。對于這種不一致性，我們推測其一，由于飲食限制，骨骼肌合成所需的基本原料很少，從而抑制了骨骼肌細胞的活性。其次，相對嚴重的食物缺乏(減少40%的食物攝入)激活了能量守恒機制，能量被優(yōu)先分配到關(guān)鍵器官，以確保生命的基本代謝活動。因此，白藜蘆醇對熱量限制期間促進骨骼肌生成的作用無法發(fā)揮，但一旦營養(yǎng)供應(yīng)充足，這種促進骨骼肌合成的作用得以呈現(xiàn)。本研究中，我們未觀察SIRT1在該模型骨骼肌中表達的動態(tài)改變，尚不確定SIRT1途徑是否在此過程中起了主導作用，亦或有其他調(diào)控因素參與，需進一步驗證。

綜上，白藜蘆醇可以顯著降低成年期追趕生長大鼠體脂含量，增加肌肉含量，降低軀干與全身脂肪比例，其機制可能與增加骨骼肌及內(nèi)臟脂肪組織SIRT1表達，抑制內(nèi)臟脂肪PPARγ的表達有關(guān)。白藜蘆醇可能為治療成年期追趕生長模型在營養(yǎng)變遷過程中體脂成分增加、肌肉成分丟失提供新策略。