王 晴， 錢玉梅， 李紅俠， 陳紅玲， 曹穩(wěn)根

(宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院, 安徽 宿州 234000)

0 引 言

玉米須是我國傳統(tǒng)的藥材，含有豐富的多糖，玉米須多糖具有清熱、平肝、抗腫瘤、抗衰老、抗疲勞、抗便秘、提高免疫力等諸多功效[1]，但對玉米須多糖降糖、抑菌作用罕見報道。目前玉米須多糖提取方法有溶劑法、酶法、微波法及超聲法等，徐彬等[2]采用水溶醇沉法得到玉米須在最佳工藝下多糖的提取率為3.66%；陳紅等[3]用微波協(xié)同纖維素酶提取玉米須多糖，通過單因素和正交試驗，得到多糖提取率最優(yōu)值為8.12%；張元薇[4]采用超聲輔助酶法提取玉米須多糖，最佳得率為15.53%。酶催化具有高效性和專一性，能提高多糖提取率，比大部分物理提取法效率高，回流提取避免提取液揮發(fā)又可節(jié)約用量，結(jié)合酶解法能高效提取玉米須多糖。以玉米須為原料，采用纖維素酶酶解-回流法提取多糖，探究玉米須多糖酶解-回流提取的最佳條件，并研究了其降糖、抑菌活性，為玉米須多糖的綜合開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮玉米須，市售；纖維素酶購于上海源葉生物科技有限公司；α-葡萄糖苷酶購于美國Sigma公司；阿卡波糖購于拜耳醫(yī)藥保健有限公司；金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌均為宿州學(xué)院微生物實驗室斜面保藏；其他試劑均為分析純。R-1001LN型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；SP-723型可見分光光度計(上海光譜儀器有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 玉米須多糖酶解粗提液的制備

新鮮玉米須去除雜質(zhì)，干燥后粉碎過100目篩得玉米須粉末，按料液比1∶50(g/mL)與2%纖維素酶溶液混合，在60 ℃、pH 5的條件下酶解60 min，75 ℃滅酶10 min，冷卻后得玉米須多糖酶解粗提液。

1.2.2 玉米須多糖提取率測定

苯酚-硫酸法[5]得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(Y=64.986X+0.0079，R2=0.9984)，并根據(jù)吸光值換算多糖濃度，計算玉米須多糖提取率：提取率(%)=多糖濃度(mg/mL)×稀釋倍數(shù)×所得提取液體積/玉米須質(zhì)量×100%。

1.2.3 單因素試驗

取新鮮玉米須按1.2.1方法進行酶解，回流溫度90℃、回流時間2 h，料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60，探究料液比對玉米須多糖提取率的影響；料液比1∶30、回流溫度90℃，回流時間0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h，探究回流時間對玉米須多糖提取率的影響；料液比1∶30、回流時間2 h，回流溫度70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃，探究回流溫度對玉米須多糖提取率的影響。

1.2.4 酶解-回流提取工藝的響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計

依據(jù)單因素結(jié)果，三個因素的低、中、高水平分別用-1，0，1表示，其中0是單因素試驗中多糖得率最大值所對應(yīng)的因素值[4-5]，利用Design-Expert 8.0軟件進行響應(yīng)面試驗設(shè)計并回歸優(yōu)化。

1.2.5 玉米須多糖生物活性研究

參照韓瑨等[6]研究方法，測定玉米須多糖α-葡萄糖苷酶抑制活性；參照雒江菡[7]的方法，采用濾紙片法測量抑菌圈直徑，測定玉米須多糖的抑菌活性。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 料液比對玉米須多糖提取率的影響

當(dāng)料液比在1∶10-1∶30間，提取液體積越大，提取率越高，達到1∶30提取率上升到最大值，隨后開始下降，故確定在料液比單因素試驗中最佳料液比為1∶30 。出現(xiàn)上述現(xiàn)象是由于提取液體積過小使得黏度偏大，導(dǎo)致分子擴散速度慢，阻礙多糖的溶出，隨著提取液體積增加，向細(xì)胞中擴散量增多使得提取液對多糖的溶解量增大，從而使多糖提取率增加，但提取液體積的繼續(xù)增大會導(dǎo)致過量的提取液使多糖溶解量達到飽和狀態(tài)，使得多糖提取率開始下降，且適宜的料液比已將多糖基本溶解出，過大時消耗溶劑量增加，同時去除溶劑負(fù)荷增加且期間可能會破壞多糖結(jié)構(gòu)。

2.1.2 回流時間對玉米須多糖提取率的影響

回流時間在0.5～2.0 h間，玉米須多糖提取率隨回流時間增加逐漸提高，當(dāng)回流時間增加到2 h，多糖提取率上升到最大值，隨后便開始下降，由此可確定在回流時間單因素試驗中最佳值為2 h。出現(xiàn)上述現(xiàn)象是由于在0.5～2 h范圍內(nèi)，隨著時間的增加多糖逐漸溶解使得提取率上升，當(dāng)超過2 h，隨著時間繼續(xù)延長，多糖發(fā)生一定程度的分解，使得多糖提取率下降。

2.1.3 回流溫度對玉米須多糖提取率的影響

回流溫度在70℃～90℃間，回流溫度增加玉米須多糖提取率增加， 90℃時多糖提取率最大值，隨后便開始下降，因此確定在提取溫度單因素試驗中最佳值為90℃。出現(xiàn)上述現(xiàn)象原因是當(dāng)溫度低于90℃時，溫度的升高有助于提取液分子向細(xì)胞中擴散從而提高多糖的溶解量，而溫度達到90℃后繼續(xù)升高，過高的溫度使得多糖的穩(wěn)定性下降甚至造成多糖高溫分解，結(jié)構(gòu)破壞，使得多糖的提取率降低。

圖1 料液比、回流時間、回流溫度對多糖提取率的影響

2.2 響應(yīng)面法探究最佳工藝條件

2.2.1 因素水平編碼與試驗

料液比(A)、回流時間(B)、回流溫度(C)為自變量，玉米須多糖提取率(Y)為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計進行試驗(表1)，得到的結(jié)果如下(表2)。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平

表2 響應(yīng)面分析方案及試驗情況

通過Design Expert 8.0軟件對試驗結(jié)果進行二次多項回歸擬合，得到的回歸方程為：Y=0.11A+0.53B+0.044C-0.80AB+0.13AC-0.28BC-1.36A2-1.09B2-1.64C2+35.02，試驗的方差分析如下(表3)。此模型的F值為17.31，p<0.001(p=0.000 5)，表明此模型極其顯著，方程中失擬項p>0.05(p=0.657 9)，未達顯著水平，表明該方程對試驗擬合好，可用其分析和預(yù)測實驗結(jié)果，即本方法可靠。從方差檢驗可看出，A2、C2對多糖提取率影響極其顯著(p<0.001)，B，AB,B2對多糖提取率影響顯著(p<0.05)，而A，C，AC，BC對多糖提取率影響均不顯著(表3)，由此可見，料液比、提取時間、提取溫度對多糖提取率的影響非單純線性關(guān)系。從單因素水平看，對多糖提取率影響順序：回流時間(B)>回流溫度(C)>料液比(A)，兩兩因素交互作用的影響主次順序為：AB>BC>AC。

表3 回歸模型方差分析

注： “Prob>F”值<0.05,影響顯著(<0.001極其顯著); 反之, 則不顯著

Note: “Prob>F” <0.05 significate(p<0.001 extremely significant); On the contrary, no significant difference

2.2.2 最佳提取條件的確定及驗證試驗

對所得的回歸方程分別對自變量A、B、C求一階偏導(dǎo)數(shù)，并令偏導(dǎo)數(shù)等于0，求出極值，即是最大多糖提取率的最優(yōu)條件：料液比1∶29.7、回流時間2.13 h、回流溫度89.95℃，玉米須多糖提取率達35.08%。考慮到操作便捷性，成本大小，最適宜條件調(diào)整為料液比1∶30 g/mL、回流時間2 h、回流溫度90 ℃，并平行重復(fù)3次進行驗證試驗，得到的平均提取率(35.14±0.02)%和預(yù)測值接近，表明了響應(yīng)面法優(yōu)化最佳條件的切實可行性。

2.3 玉米須多糖生物活性

2.3.1 玉米須多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

對α-葡萄糖苷酶具有抑制活性的物質(zhì)能夠抑制其對食物中淀粉和糖類的降解，延遲并減少葡萄糖的產(chǎn)生和吸收，從而達到餐后降糖效果[8]。玉米須多糖在濃度較低時即具有α-葡萄糖苷酶抑制活性，且在濃度為1.6 mg/mL時，抑制率達到80%以上且趨于穩(wěn)定。

2.3.2 玉米須多糖抑菌活性

玉米須多糖對三種細(xì)菌均有一定的抑制作用，且抑制作用隨玉米須多糖濃度的升高而增強，其中對大腸桿菌的抑制作用高于對枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用，說明玉米須多糖對革蘭氏陰性菌的抑制作用高于革蘭氏陽性菌。

圖2 玉米須多糖降糖、抑菌活性

3 結(jié) 語

玉米須作為一種常用藥材，具有多種生物學(xué)活性及應(yīng)用價值，因此對其提取工藝的優(yōu)化和藥理活性的開發(fā)具有重要現(xiàn)實意義。纖維素酶酶解玉米須得到玉米須多糖粗提物，以多糖提取率為評價指標(biāo)進行回流提取，優(yōu)化得到回流提取最優(yōu)條件：料液比1∶30 g/mL、回流時間2 h、回流溫度90 ℃，得到玉米須多糖提取率為(35.14±0.02)%，與理論值相符，高于課題組前期得到的纖維素酶-超聲波法玉米須多糖提取率(27.98±0.17%)和纖維素酶-微波法得到玉米須多糖提取率(31.20±0.50%)。在最優(yōu)條件下酶解-回流提取玉米須多糖，探究其生物活性，結(jié)果表明玉米須多糖能夠抑制α-葡萄糖苷酶活性，減少機體對葡萄糖的吸收，抑制細(xì)菌生長，對革蘭氏陰性菌抑制效果最好。