楊慧蘭 易葉葉 侯海瑞 蘇善恒 譚彩春 況燕△

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣西 南寧 530021；2.長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖南 長(zhǎng)沙 410005)

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，死亡率居?jì)D科腫瘤之首[1]。由于腫瘤的生物學(xué)特性和卵巢的位置，在早期診斷該病一直很困難，確診卵巢癌時(shí)大多數(shù)患者已為晚期[2]。因此研究影響卵巢癌的發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，尋找卵巢癌早期診斷及治療的新靶點(diǎn)是我們刻不容緩需要解決的問(wèn)題。Toll樣受體4(TLR4)及KDM2B均在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著不同程度的作用，但兩者之間關(guān)系在卵巢癌的研究中未見報(bào)道。本研究采用免疫組化法檢測(cè)TLR4及KDM2B在不同卵巢組織中的表達(dá)情況，分析兩者之間的相互關(guān)系以及與卵巢癌臨床病理特征的相關(guān)性，為卵巢癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象 收集2017年12月至 2019年9月在廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院進(jìn)行診治的100例卵巢疾病患者的卵巢組織標(biāo)本，包括20例正常卵巢組織(來(lái)源于患子宮肌瘤或子宮腺肌病行全子宮雙附件切除術(shù)的患者)，25例良性卵巢腫瘤組織(14例粘液性囊腺瘤，11例漿液性囊腺瘤)，55例卵巢癌組織(30漿液性腺癌、22例黏液性腺癌，3例透明細(xì)胞癌)。所有病例在取材前均未接受藥物、放療等特殊治療，并經(jīng)過(guò)組織病理學(xué)檢查明確診斷。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2主要試劑 TLR4兔多克隆抗體(Abcam公司，批號(hào)：ab13556)KDM2B兔多克隆抗體(SAB公司，批號(hào)：47690)，SP試劑盒(博士德生物公司，批號(hào)：SV0002)和DBA顯色試劑盒(博士德生物公司，批號(hào)：AR1022)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 應(yīng)用免疫組化SP法分別檢測(cè)正常卵巢組織、良性卵巢腫瘤組織、卵巢癌組織中TLR4及KDM2B的表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格按照試劑使用說(shuō)明書進(jìn)行。其中TLR4及KDM2B抗體的工作液濃度分別為 1∶1 000、1∶200，以磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照，以已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照。最終在顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.4結(jié)果評(píng)定標(biāo)準(zhǔn) TLR4與KDM2B陽(yáng)性定位分別是細(xì)胞膜及細(xì)胞核，故在細(xì)胞膜或細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃褐色顆粒定義為陽(yáng)性表達(dá)。在400倍高倍鏡下，每張切片均隨機(jī)取5個(gè)視野，每個(gè)視野根據(jù)染色強(qiáng)度計(jì)分和陽(yáng)性細(xì)胞百分比。染色程度評(píng)定：不著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)定： <25% 為1分，25%～50% 為2分，50%～75%為3分，>75%為4分。最后將染色程度和陽(yáng)性細(xì)胞百分比相乘作為最終判定結(jié)果：0分為陰性(-) ，1～4 分為弱陽(yáng)性( + )，4～8分為中度陽(yáng)性( + + )，8～12 分為強(qiáng)陽(yáng)性 ( + + + )。其中( + ) 、( + + ) 、( + + + ) 均為陽(yáng)性表達(dá)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料以n(%)表示，采用χ2檢驗(yàn)；采用 Spearman相關(guān)系數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析；以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1TLR4及KDM2B在不同卵巢組織中的表達(dá)情況 免疫組化結(jié)果顯示，卵巢癌中TLR4及KDM2B陽(yáng)性表達(dá)率均明顯高于良性卵巢腫瘤組織和正常卵巢組織(P均<0.05)。見表1、圖 1。

表1 TLR4和KDM2B在不同卵巢組織中的表達(dá)情況[n(%)]

注:A、B、C分別為TLR4在正常卵巢組織、良性卵巢腫瘤組織及卵巢癌組織中的表達(dá)情況；D、E、F分別為KDM2B在正常卵巢組織、良性卵巢腫瘤組織及卵巢癌組織的表達(dá)情況。圖1 TLR4和KDM2B分別在不同卵巢組織中的表達(dá)情況(DAB染色，×400)

2.2TLR4及KDM2B陽(yáng)性表達(dá)情況與卵巢癌臨床病理學(xué)特征的關(guān)系 TLR4及KDM2B在低分化卵巢癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率均較高分化卵巢癌組織高(P<0.05)，且隨著國(guó)際婦產(chǎn)科協(xié)會(huì)(FIGO)分期的增加而升高(P<0.05)，其中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者表達(dá)陽(yáng)性率較高(P<0.05)。兩者的陽(yáng)性表達(dá)率與年齡無(wú)關(guān)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05) 。見表2。

表2 TLR4及KDM2B陽(yáng)性表達(dá)與卵巢癌患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系[n(%)]

2.3TLR4與KDM2B在卵巢癌中表達(dá)的相關(guān)性分析 在卵巢癌組織中TLR4與KDM2B的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.310，P=0.021<0.05)。

3 討 論

Toll樣受體(TLRs)是一種進(jìn)化保守的膜結(jié)合蛋白，廣泛表達(dá)在免疫細(xì)胞表面。TLRs在真核生物的免疫、神經(jīng)發(fā)生和發(fā)育過(guò)程中起著重要作用[3]。TLR4作為TLR家族的一員，主要在免疫細(xì)胞中表達(dá)，并且在先天和獲得性免疫中發(fā)揮著重要作用[4]。Y.Li等[5]研究發(fā)現(xiàn)，TLR4激活在多個(gè)位點(diǎn)誘導(dǎo)組蛋白甲基化變化，其中KDM3A通過(guò)參與TLR4對(duì)肺腺癌細(xì)胞Foxp3轉(zhuǎn)錄的調(diào)控，促進(jìn)抑制細(xì)胞因子的分泌，從而促進(jìn)肺癌細(xì)胞的免疫逃逸，揭示了表觀遺傳組蛋白甲基化在肺癌細(xì)胞免疫逃逸調(diào)控中的重要作用。TLR4也在胃癌、腸癌等多種腫瘤組織和細(xì)胞中呈高表達(dá)，并起到促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和免疫逃逸的作用[6-7]。本研究通過(guò)免疫組化法檢測(cè)TLR4在不同卵巢組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示TLR4在卵巢癌組織中的表達(dá)均高于良性卵巢腫瘤和正常卵巢組織(P<0.05)，且TLR4的表達(dá)陽(yáng)性率隨著腫瘤組織分級(jí)及 FIGO 分期的增加而升高(P<0.05)， 存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者TLR4的表達(dá)陽(yáng)性率較高(P<0.05)，這一結(jié)果與G.Vlad等[8]結(jié)果相似，提示TLR4可能在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要作用。

KDM2B(也稱為NDY1、FBXL10、JHDM1B和CxxC2)，是JHDM (jmjc domain-containing histone demethylase)家族的成員之一[9]。它是一種普遍存在的核蛋白，對(duì)H3K36me2和H3K4me3 進(jìn)行脫甲基[10-11]。KDM2B具有抑制細(xì)胞衰老，防止細(xì)胞分化，促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移，調(diào)節(jié)干細(xì)胞自我更新等多種生物學(xué)作用[12]。研究[13-14]發(fā)現(xiàn)KDM2B的過(guò)表達(dá)促進(jìn)了MoMuLV誘導(dǎo)的T細(xì)胞淋巴瘤，急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)和急性骨髓性白血病(AML)的進(jìn)展。敲除ALL、慢性髓細(xì)胞白血病和AML細(xì)胞系中的KDM2B，不僅減少了細(xì)胞生長(zhǎng)，而且減少了小鼠的肺轉(zhuǎn)移。KDM2B在基底樣三陰性(ER-，PR-和Her2-)乳腺癌中高表達(dá)，并與其不良預(yù)后有關(guān)[15]。A.Tzatsos等[16]研究表明KDM2B激活MYC和KDM5A基因的表達(dá)從而促進(jìn)胰腺癌的進(jìn)程，其直接作用于MYC啟動(dòng)子，進(jìn)而抑制胃癌的糖酵解.KDM2B可通過(guò)增加EMT促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，從而膀胱癌的細(xì)胞增殖，遷移，血管生成和癌癥干細(xì)胞自我更新[17]。此外，KDM2B可以通過(guò)激活PI3K/mTOR途徑促進(jìn)鼻咽癌的進(jìn)展[18]。綜上說(shuō)明KDM2B在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程起著重要作用。本研究結(jié)果顯示KDM2B在卵巢癌組織中的表達(dá)均高于良性卵巢腫瘤及正常卵巢組織(P<0．05)，KDM2B的表達(dá)陽(yáng)性率隨著腫瘤組織分級(jí)及 FIGO 分期的增加而升高(P<0．05)，存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者KDM2B的表達(dá)陽(yáng)性率較高(P<0.05)，與Y.Kuang等[19]研究結(jié)果相似，提示KDM2B的高表達(dá)影響卵巢癌的發(fā)生發(fā)展。并且研究結(jié)果顯示TLR4與KDM2B在卵巢癌中的表達(dá)呈正相關(guān)，由此我們推測(cè)TLR4與KDM2B可能一同參與了卵巢癌的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，在卵巢癌組織中TLR4與KDM2B均呈高表達(dá)，兩者在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的具體作用機(jī)制可能不同。其中TLR4激活時(shí)在多個(gè)位點(diǎn)誘導(dǎo)組蛋白甲基化變化，而KDM2B是一種去甲基化酶，那么KDM2B是否在TLR4激活時(shí)參與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程則有待深入研究。這將拓展卵巢癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制研究范疇，為卵巢癌的臨床治療提供新思路。