楚剛輝 王坤 尹學(xué)博

摘?要?采用溫和的方法制備了苯硼酸吸附劑，將其用于雪菊中微量木犀草苷的富集，并以此為基礎(chǔ)建立了快速、選擇性地測(cè)定雪菊中木犀草苷含量的近紅外光譜分析方法。富集了木犀草苷的吸附劑無需脫附，即可用近紅外漫反射光譜直接檢測(cè)，通過偏最小二乘回歸法建立了定量分析木犀草苷的校正模型，并成功實(shí)現(xiàn)了木犀草苷含量的測(cè)定。采用此苯硼酸吸附劑0.2 g，常溫振蕩吸附20 min后，吸附效率可達(dá)85.5%。結(jié)果表明，經(jīng)連續(xù)小波變換處理近紅外光譜分析數(shù)據(jù)，木犀草苷預(yù)測(cè)模型的預(yù)測(cè)濃度和參考濃度之間的相關(guān)系數(shù)為0.9765，且木犀草苷在0.15～19.5 mg/L濃度范圍內(nèi)具有較好的預(yù)測(cè)結(jié)果，預(yù)測(cè)回收率為84.7%～113.2%。本研究建立了苯硼酸吸附劑吸附預(yù)富集方法，與近紅外漫反射光譜結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了雪菊溶液中微量木犀草苷的選擇性測(cè)定，為近紅外光譜與吸附富集分析藥食用植物中的其它有效成分的研究提供了參考。

關(guān)鍵詞?木犀草苷;苯硼酸吸附劑;富集;選擇性檢測(cè);近紅外漫反射光譜

1?引 言

木犀草苷（Luteoloside）是一種天然植物黃酮類物質(zhì)，為弱酸性四羥基黃酮類化合物。木犀草苷又名木犀草素-7-O-葡萄糖苷（Luteolin-7-O-glucoside），其苷元為木犀草素，因最初是從木犀草科木犀草屬植物木犀草中分離出而得名。木犀草苷具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤和降低膽固醇等藥理作用[1，2]。雪菊是一種雙色堅(jiān)果菊花，作為一種藥食兩用植物，藥理研究證實(shí)雪菊具有極高的藥用價(jià)值。雪菊的有效成分包括黃酮類、糖類、礦物質(zhì)元素、酚類等，具有清熱解毒、活血、養(yǎng)胃、健脾、抗疲勞和抗氧化等功效[3～5]。植物樣品和中藥中木犀草苷的常見檢測(cè)方法包括高效液相色譜法[6，7]、超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[8]、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[9]和超臨界色譜法[10]等。這些方法選擇性好，但不同程度上存在有機(jī)試劑消耗量大、操作過程繁瑣、分析時(shí)間長(zhǎng)等問題。

近紅外光是介于中紅外和可見光之間的電磁波，其波長(zhǎng)范圍為780～2526 nm[11]，近紅外光譜技術(shù)可根據(jù)有機(jī)物含氫基團(tuán)（主要包括CH、NH、OH、SH等）對(duì)近紅外光譜吸收的差異，區(qū)分不同物質(zhì)并測(cè)定其濃度[12]，具有無損、簡(jiǎn)單、方便、處理量大、快速、準(zhǔn)確、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)[13]。自20世紀(jì)90年代以來，近紅外光譜技術(shù)逐漸應(yīng)用在生產(chǎn)和基礎(chǔ)研究中 [14，15]。藥食兩用植物屬于復(fù)雜體系，選擇性檢測(cè)其中的有效成分一直是相關(guān)研究的熱點(diǎn)，而近紅外光譜可用于復(fù)雜體系成分分析[16，17]。由于近紅外光譜的檢出限高，待測(cè)組分的含量一般應(yīng)大于0.1%。為提高近紅外光譜的檢出限和分析靈敏度，文獻(xiàn)報(bào)道了多種吸附材料，用于樣品中微量成分的富集及近紅外光譜檢測(cè)[18～20]。為了提高檢測(cè)的靈敏度和選擇性，本研究基于含苯硼酸基團(tuán)的化合物與多元醇化合物的共價(jià)化學(xué)鍵特異性結(jié)合的性質(zhì)[21，22]，采用溫和的方法制備了苯硼酸吸附劑，用于富集雪菊中微量的木犀草苷，采用近紅外光譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法實(shí)現(xiàn)了其中木犀草苷的選擇性檢測(cè)。

2?實(shí)驗(yàn)部分

2.1?儀器與試劑

SF-TDL-2SOA低速離心機(jī)（上海菲恰爾分析儀器有限公司）;SJZ-82電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）;DZF-6050真空干燥箱（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）;HY-2型多用調(diào)速振蕩器（江蘇省金壇醫(yī)療儀器廠）;AntarisⅡ近紅外光譜儀（美國(guó)Thermo公司）;TU-1900 型雙光束紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）;DF-4型壓片機(jī)（天津市港東科技發(fā)展有限公司）;JJ-2增力電動(dòng)攪拌器（金壇市醫(yī)療儀器廠）。

3-氨基苯硼酸（3-Aminophenylboronic acid，APB）、3-縮水甘油基氧基丙基三甲氧基硅烷（3-Glycidyloxypropyltrimethoxysilane，GLMYO）、硅酸四乙酯（Tetraethyl orthosilicate，TEOS）、木犀草苷（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）;甲醇、氨水和無水乙醇均為分析純?cè)噭?。選擇產(chǎn)于新疆巴楚的雪菊，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后備用。

2.2?實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1?苯硼酸吸附劑的制備?參考文獻(xiàn)[23]的方法，并做適當(dāng)修改。取1.16 g APB、80 mL甲醇及2.0 mL GLYMO于三頸圓底燒瓶中，在40℃恒溫水浴中電動(dòng)攪拌反應(yīng)12 h，得到GLYMO-APB。然后加入6.0 mL TEOS、2.0 mL純凈水、2.0 mL氨水，繼續(xù)電動(dòng)攪拌24 h（圖1）。GLYMO-APB和TEOS在氨水條件下同步水解完成合成過程。反應(yīng)完畢，將產(chǎn)物離心，先用水洗至中性，再用甲醇洗滌一次，收集固體樣品，于真空干燥箱中60℃烘干24 h，干燥后研細(xì)，備用。

2.2.2?木犀草苷的吸附實(shí)驗(yàn)?以木犀草苷為研究對(duì)象，稱取0.20 g苯硼酸吸附劑于100 mL錐形瓶中，加入50.0 mL木犀草苷/雪菊提取溶液，在室溫下，于振蕩器中振蕩20 min，經(jīng)量筒式過濾器過濾，測(cè)定濾液在349 nm的吸光度，木犀草苷的吸附率（R，%）的計(jì)算公式如下：

式中，A0和A分別代表木犀草苷溶液吸附前后的吸光度。

2.2.3?木犀草苷的HPLC測(cè)定法?采用HPLC法進(jìn)行供試雪菊樣品中木犀草苷的含量測(cè)定。 色譜條件： Agilent HC-C18色譜柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相A為乙腈，B為0.2%醋酸溶液，梯度洗脫： 0～40 min，15%～90% A;40～50 min，90%A。流速： 1 mL/min;柱溫，常溫;進(jìn)樣量： 10 μL;檢測(cè)波長(zhǎng)： 349 nm。配制0.5～590 mg/L木犀草苷系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取10 μL，按上述色譜條件分析，獲得木犀草苷色譜峰的峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（mg/L）為橫坐標(biāo)，得線性回歸方程： y=76330x-2×106（R2=0.9820）。 雪菊樣品溶液采用微孔濾膜（0.45 μm）過濾，取續(xù)濾液，進(jìn)行色譜分析，木犀草苷標(biāo)準(zhǔn)樣和雪菊提取液的色譜圖見圖2。

2.2.4?雪菊分析試液的制備與木犀草苷的富集?分別稱取適量的巴楚雪菊于100 mL錐形瓶中，加入50 mL 35% （V/V）甲醇浸泡過夜（12 h）;抽濾，收集上清液于干凈錐形瓶中，備用。按照雪菊樣品色譜檢測(cè)的濃度結(jié)果，制成系列不同木犀草苷濃度的雪菊提取液68組，濃度范圍為1.5～19.5 mg/L。稱取0.2 g苯硼酸吸附劑于100 mL一系列錐形瓶?jī)?nèi)，將制備的68組雪菊提取溶液每組50 mL依次加入其中。于常溫下振蕩20 min，實(shí)現(xiàn)木犀草苷的富集，抽濾得68個(gè)富集有木犀草苷的吸附劑固體。富集有木犀草苷的吸附劑無需脫附，直接用于近紅外光譜檢測(cè)，得到68個(gè)樣本的近紅外光譜，其中39個(gè)用于建立定量校正模型，29個(gè)（其中12對(duì)重復(fù)樣本）作為預(yù)測(cè)模型建立近紅外光譜分析方法。

2.2.5?光譜測(cè)量方法?68個(gè)固體樣本通過近紅外積分球漫反射測(cè)量得到近紅外光譜，選擇儀器分辨率為4 cm1，光譜掃描范圍為4000～10000 cm1。于室溫下開機(jī)預(yù)熱1 h后進(jìn)行測(cè)量，測(cè)量時(shí)，每隔1 h，背景校正1次。為了減小誤差，68個(gè)樣本進(jìn)行隨機(jī)測(cè)量;為提高樣品測(cè)定的信噪比，每個(gè)樣品近紅外光譜均經(jīng)過64次掃描，并重復(fù)3次測(cè)量，以3次結(jié)果的平均值作為最終光譜。本研究聯(lián)合多變量校準(zhǔn)法和偏最小二乘回歸（Partial least square regression，PLSR）進(jìn)行分析，并根據(jù)儀器軟件包TQ analyst 9實(shí)現(xiàn)建模和預(yù)測(cè)。

3?結(jié)果與討論

3.1?苯硼酸吸附劑的紅外光譜

為驗(yàn)證苯硼酸的成功接枝，將二氧化硅和苯硼酸吸附劑與KBr按質(zhì)量比1∶100～1∶200壓片，紅外光譜見圖3。通過比較二氧化硅的紅外光譜，苯硼酸吸附劑在1357 cm?1顯示BO鍵的伸縮振動(dòng)峰，1506和1598 cm?1處有苯環(huán)的特征吸收峰，2943和2880 cm?1處屬于甲基和亞甲基的伸縮振動(dòng)峰。與二氧化硅紅外光譜比較，這些新出現(xiàn)的吸收峰表明苯硼酸已經(jīng)結(jié)合在二氧化硅表面。

3.2?苯硼酸吸附劑對(duì)木犀草苷的吸附

為確定苯硼酸吸附劑對(duì)木犀草苷的吸附性能，以10 mg/L 木犀草苷標(biāo)準(zhǔn)溶液為目標(biāo)溶液，按照2.2.2節(jié)的方法進(jìn)行吸附實(shí)驗(yàn)。采用紫外-可見光譜檢測(cè)吸附前后木犀草苷溶液的光譜，計(jì)算吸附率（圖4），其中349 nm為木犀草苷的特征吸收波長(zhǎng)。研究表明，苯硼酸可與含有順式二醇結(jié)構(gòu)的鄰苯二酚類物質(zhì)發(fā)生特異性結(jié)合作用[24，25]。比較10 mg/L木犀草苷標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸收光譜（a曲線）和經(jīng)苯硼酸吸附劑吸附后的吸收光譜（b曲線），349 nm處的吸收明顯減少，計(jì)算得到木犀草苷吸附率為85.5%。結(jié)果表明，苯硼酸吸附劑對(duì)木犀草苷具有良好的吸附作用。

按照2.2.4和2.2.5節(jié)的方法對(duì)吸附了木犀草苷的吸附劑進(jìn)行光譜檢測(cè)，得到了68個(gè)固體樣品的近紅外光譜（圖5）。根據(jù)儀器軟件包TQ analyst 9，選擇的波數(shù)范圍為4115～8115 cm?1。

3.3?木犀草苷的近紅外光譜定量結(jié)果

3.3.1?木犀草苷定量校正模型的建立?通過PLSR法建立木犀草苷定量模型，為了優(yōu)化定量校正模型，選擇不同的方法，如一階導(dǎo)數(shù)（First derivative，1st）、標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換（Standard normal variate，SNV）、多元散射校正（Multiplicative scatter correction，MSC）、連續(xù)小波變換（Continuous wavelet transform，CWT）、移動(dòng)窗口最小二乘多項(xiàng)式平滑（Savitzky-golay smoothing，SG）等光譜預(yù)處理方法[26，27]，通過蒙特卡洛交叉驗(yàn)證（Monte carlo cross-validation，MCCV）法確定模型的因子數(shù)，表1為不同光譜預(yù)處理方法得到的木犀草苷PLSR定量校正模型及交叉驗(yàn)證結(jié)果。這些模型的因子數(shù)在8～12之間，因?yàn)榻t外光譜中既包括了木犀草苷的信息，也包含有苯硼酸吸附劑和雪菊中其它復(fù)雜化合物的組分信號(hào)。采用PLSR方法，在樣品中提取木犀草苷的定量信息，以3個(gè)參數(shù)綜合評(píng)價(jià)木犀草苷PLSR定量模型的預(yù)測(cè)能力，分別為相關(guān)系數(shù)（Related coefficient，R）、交叉驗(yàn)證均方根誤差（Root mean square error of cross validation，RMSECV）和預(yù)測(cè)殘差值（Residual predictive deviation，RPD）。R反映木犀草苷的預(yù)測(cè)濃度與真實(shí)濃度的相關(guān)程度，RMSECV反映預(yù)測(cè)濃度與實(shí)際濃度的偏離程度。前期文獻(xiàn)結(jié)果表明，當(dāng)模型的RPD>2.5時(shí)，該處理方法可用于定量預(yù)測(cè)，RPD越大，說明定量結(jié)果越準(zhǔn)確[28，29]。

由表1可知，相比無處理方法，雪菊樣品的近紅外光譜經(jīng)二階導(dǎo)數(shù)（Second derivative，2nd）、MSC、SNV處理后，RPD值顯示結(jié)果更差;而經(jīng)1st、SG平滑、CWT、MSC+1st、SNV+1st處理后，RPD值更大，說明這些光譜預(yù)處理可有效改善定量結(jié)果。比較這5種方法與無處理方法中的R、RMSECV、RPD值，經(jīng)CWT處理后的相關(guān)系數(shù)R值最大，且RMSECV值最小，RPD值最大，達(dá)到5.88。為了使光譜干擾更小、誤差更小、預(yù)測(cè)更準(zhǔn)確，達(dá)到最優(yōu)的定量效果，本研究選用CWT方法對(duì)所有木犀草苷樣品的近紅外光譜進(jìn)行處理。結(jié)果表明，通過預(yù)富集和CWT方法可以提取樣品中待測(cè)組分木犀草苷的有效檢測(cè)信息。

3.3.2?木犀草苷定量模型的驗(yàn)證?使用29個(gè)預(yù)測(cè)集樣品（12對(duì)重復(fù)樣本）檢驗(yàn)所建立的PLS模型，以考察對(duì)木犀草苷定量校正模型的預(yù)測(cè)能力。預(yù)測(cè)集樣品的制備方法、光譜測(cè)量條件、建模方法類似于校正集樣品。圖6中的虛心圈為校正集樣品的散點(diǎn)，實(shí)心圈為預(yù)測(cè)集樣品的散點(diǎn)，虛線為校正集樣本的擬合曲線，實(shí)線為預(yù)測(cè)集樣本的擬合曲線。由圖6可見，模型的擬合值均勻分布在被擬合值點(diǎn)附近，兩類樣品偏PLS模型中預(yù)測(cè)濃度與參考濃度之間的擬合關(guān)系良好。在0.15～19.5 mg/L濃度范圍內(nèi)，測(cè)得預(yù)測(cè)集樣品的相關(guān)系數(shù)為0.9765，預(yù)測(cè)均方根誤差（Root mean square error of prediction，RMSEP）為0.9745 mg/L。木犀草苷預(yù)測(cè)集樣本的回收率在84.7%～113.2%范圍內(nèi)，表明能夠?qū)崿F(xiàn)雪菊提取液中木犀草苷的富集，為近紅外光譜的微量檢測(cè)提供了可能。綜上，雪菊提取液中木犀草苷經(jīng)苯硼酸吸附劑后，即使存在有各種基體干擾，仍能被準(zhǔn)確測(cè)定，因此可實(shí)現(xiàn)雪菊中木犀草苷的選擇性檢測(cè)。模型診斷一般用殘差的結(jié)果進(jìn)行判斷，殘差散點(diǎn)分布均勻，說明模型的性能良好[30，31];由圖7的預(yù)測(cè)殘差可見，各點(diǎn)殘差值即預(yù)測(cè)響應(yīng)值和實(shí)際響應(yīng)值之差在0 mg/L上下呈對(duì)稱分布，且具有恒定均勻的擴(kuò)散，表明模型穩(wěn)定，適于含量預(yù)測(cè)。因此，本研究成功建立了木犀草苷定量校正模型，并實(shí)現(xiàn)了對(duì)預(yù)測(cè)集樣品含量的預(yù)測(cè)，結(jié)果良好，模型穩(wěn)健有效;在復(fù)雜光譜背景下，經(jīng)過CWT法對(duì)樣品的近紅外光譜進(jìn)行處理和有效檢測(cè)信息提取，可以準(zhǔn)確、選擇性地測(cè)定雪菊提取液中的木犀草苷含量。

4?結(jié) 論

采用溫和方法制備了苯硼酸吸附劑，通過紅外光譜進(jìn)行了表征。將此吸附劑用于雪菊中木犀草苷的富集，與近紅外光譜檢測(cè)方法結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了木犀草苷的定量測(cè)定。用苯硼酸吸附劑常溫振蕩吸附20 min，對(duì)木犀草苷的吸附效率可達(dá)到85.5%，吸附效果良好。將其用于雪菊提取液中木犀草苷的富集，采用近紅外漫反射光譜方法對(duì)其中微量的木犀草苷進(jìn)行定量分析，選擇CWT對(duì)近紅外光譜進(jìn)行預(yù)處理，可達(dá)到最好的交叉驗(yàn)證結(jié)果。用PLSR法建立木犀草苷的定量校正模型，以29個(gè)樣本作為預(yù)測(cè)集進(jìn)行外部檢驗(yàn)回歸模型的準(zhǔn)確性。在0.15～19.5 mg/L濃度范圍內(nèi)，預(yù)測(cè)集相關(guān)系數(shù)為0.9765，預(yù)測(cè)集中預(yù)測(cè)集樣本的回收率在84.7%～113.2%范圍內(nèi)。結(jié)果表明，苯硼酸吸附劑提高了近紅外光譜對(duì)木犀草苷的檢測(cè)靈敏度，實(shí)現(xiàn)了雪菊提取溶液中微量木犀草苷的選擇性檢測(cè)，表明基于吸附富集策略與近紅外光譜結(jié)合，采用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，可以實(shí)現(xiàn)藥食兩用植物中微量成分的分析和測(cè)定。

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