孫 霞，劉 揚，王 芳，譚 嵐，張 虎

(1.山東江河濕地生態(tài)研究院，山東 濟南 271100;2.中國水利水電科學研究院，北京 100038;3.湖南百舸水利建設股份有限公司，湖南長沙 410007)

隨著我國工業(yè)化和城市化進程加快，大量含氮、磷等營養(yǎng)物質(zhì)的工業(yè)廢水和生活污水排入江河、湖泊等水體，導致水生態(tài)平衡遭受嚴重破壞。水利部發(fā)布的《中國水資源公報》顯示，在2018年所調(diào)查的121個湖泊中，中營養(yǎng)湖泊占26.5%，富營養(yǎng)湖泊占73.5%;而2009年調(diào)查的71個湖泊中，中營養(yǎng)湖泊占33.8%，輕度和中度富營養(yǎng)湖泊分別占38.0%和26.8%。水質(zhì)也有所下降，劣Ⅴ類水體面積占比由2009年的 14.0%上升到 2018年的16.1%，人類的清潔優(yōu)質(zhì)水資源日益受到威脅。因此如何改善水質(zhì)和富營養(yǎng)化狀況，成為熱點問題。

目前處理(修復)富營養(yǎng)化水體的方法主要有物理、化學及生物法，其中以降解污染物為目標的微生物技術由于無二次污染、運行成本低、對周圍環(huán)境影響小等優(yōu)勢得到廣泛關注和應用。然而微生物技術的工業(yè)化應用受2個主要因素限制:一是缺乏長期的操作穩(wěn)定性，二是微生物細胞的分離回收和再利用困難。而固定化微生物技術，即用物理或化學方法將游離微生物細胞限定在某一空間區(qū)域內(nèi)，保持其生物活性，進而可重復循環(huán)利用的技術，可以有效克服這些缺點［1-2］。與游離微生物相比，固定化微生物技術具有生物負載量大、穩(wěn)定性高、對環(huán)境耐受性強、不易被流水沖刷等優(yōu)勢［3-4］。近年來，許多學者針對不同的污水性質(zhì)，采用不同的固定化體系進行大量研究，如將蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)固定到海藻酸鈣載體中以降解石油廢水中的酚類化合物［5］，用藻酸鹽凝膠固定微藻(Isochrysis galbana)吸附水中的 Cr(Ⅲ)［3］，將氨氧化菌固定化到海藻酸鈣載體中以去除氨氮，且固定化細胞具有更好的保存、循環(huán)和生物降解能力［6］。總體而言，固定化微生物技術顯示了較強的水處理效果。

雖然目前關于固定化微生物技術的文獻很多，尤其是對工業(yè)廢水污染物的生物降解報道非常豐富，但對富營養(yǎng)化水體中氮磷污染物的處理鮮見全面的綜述。為此，筆者重點對富營養(yǎng)化水體修復中固定化載體的選擇、固定化微生物細胞的種類以及適用的固定化技術進行綜述，試圖確定該技術在富營養(yǎng)化水體修復中面臨的挑戰(zhàn)和今后的研究方向。

1 固定化載體

載體材料的選擇是影響微生物固定化效果的重要因素之一，是固定化技術能否投入實際應用的關鍵。良好的載體材料應具備低廉易得、對微生物無毒、不被生物降解、傳質(zhì)性能良好、能為微生物提供充分的生存空間、易于處理和再生等特性［7］。

目前常用的載體主要有5種類型:無機載體、有機載體、復合載體、改性載體及新型載體(表1)。

表1 固定化載體的分類Table 1 Classifications of immobilization carriers

無機載體包括活性炭、沸石、黏土等，材料廉價易得，但微生物負載量小，易脫落。有機載體包括天然及合成有機載體2類。天然有機載體具有較高的污染物去除率且更環(huán)保;合成有機載體具有更好的穩(wěn)定性和更高的機械強度，但可能對微生物有毒性。海藻酸鹽和聚乙烯醇(PVA)是最常用的2類有機材料，如利用海藻酸鈉(SA)固定蠟樣芽孢桿菌［8］，利用海藻酸鈣固定氨氧化菌［6］，利用 PVA 固定硝化細菌［9］等。海藻酸鹽作為載體材料的優(yōu)點是無毒性、滲透性強，能為固定化細胞提供非常溫和的環(huán)境，在固定化過程中微生物細胞能不受外界條件變化的影響［3］。PVA的優(yōu)勢是價格低廉、容易獲得、無毒，氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)在PVA載體孔隙中容易擴散，使生物降解更容易完成。復合載體通常是有機載體和無機載體的組合，即將兩者的優(yōu)勢互補。如用PVA+SA+生物炭作為載體固定硝化細菌來處理富氨氮水體，結(jié)果顯示運行72 h時氨氮的去除率可達96.3%，酸堿穩(wěn)定性和傳質(zhì)性分別提升12.5%和 55.8%，固定化顆粒的破損率降低2.4%［10］。改性載體指在載體加工過程中添加改性物質(zhì)，或?qū)d體材料表面基團或孔結(jié)構進行改性優(yōu)化，改性后載體和微生物的結(jié)合強度增加，生物負載量提高且不易脫落。如用鑭/鋁改性沸石可以擴大沸石的比表面積，避免孔道被雜質(zhì)堵塞，增強孔道間連通性，提高沸石對磷的吸附能力［11］。新型載體是具有表面效應、量子尺寸效應以及磁學性質(zhì)的一類載體。尤其是磁性納米材料因易于回收、可多次反復利用、應用成本低等優(yōu)勢，受到廣泛關注。

近年來，學者們對固定化載體的研究經(jīng)歷了從單一載體到復合載體、從改性載體到新型載體的發(fā)展過程，隨著材料科學、生物技術以及水處理技術等學科的交叉發(fā)展，新型復合載體的開發(fā)應用必將成為固定化微生物技術的主要研究趨勢。

2 固定化微生物

優(yōu)良的微生物菌劑是固定化技術的首要條件。目前，許多研究者針對不同污染物選育了大量優(yōu)勢菌株，如降解多環(huán)芳烴類有機物(PAHs)的綠膿假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、紅球菌(Rhodococcussp.)、分枝桿菌(Mycobacteriumsp.)、類芽孢桿菌(Paenibacillussp.)和白腐真菌(Phanerochaete chrysosporium)等［25］，但是針對氮、磷污染物的優(yōu)良菌種相對較少。表2列舉了部分富營養(yǎng)化水體中脫氮除磷的微生物種類。

表2 應用于富營養(yǎng)化水體脫氮除磷的部分微生物種類Table 2 Application of immobilized microorganisms for removal of nitrogen and phosphorus from eutrophic water

傳統(tǒng)的生物脫氮理論由氨氧化菌及硝化菌完成硝化過程，繼而由反硝化菌將硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮逐步轉(zhuǎn)化為 N2O和 N2，最終將氮從水體去除［34］。1983年，ROBERTSON 等［35］發(fā)現(xiàn)泛養(yǎng)硫球菌(Thiosphaera pantotropha)〔后更名為脫氮副球菌(Paracoccus denitrificans)〕能同時利用氧和硝酸鹽作為電子受體，并提出了異養(yǎng)硝化的概念。與自養(yǎng)硝化菌相比，異養(yǎng)硝化菌具有生長速率快、需氧濃度低、耐酸性強、環(huán)境適應性強等優(yōu)點［36］。隨后，研究者發(fā)現(xiàn)大多數(shù)異養(yǎng)硝化菌也具有好氧反硝化功能［37-38］，于是既具有異養(yǎng)硝化能力又具有好氧反硝化能力的微生物被分離出來，使硝化和反硝化能夠同時進行。目前已報道的異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌主要包括副球菌屬(Paracoccus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、產(chǎn)堿桿菌屬 (Alcaligenes)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、紅球菌屬 (Rhodococcuus)等細菌，曲霉屬(Aspergillus)、黑粉菌屬 (Ustilago)、紅酵母屬(Rhodotorula)等真菌，鏈霉菌屬(Streptomyces)等放線菌以及古菌等［39-40］。

微生物對氮磷的同步去除是富營養(yǎng)化水體處理的主要目標，但在實際脫氮除磷過程中存在硝化菌和聚磷菌菌齡不同、碳源需求競爭等諸多矛盾。1980 年代，OSBORN 等［41］和 BORTONE 等［42］相繼發(fā)現(xiàn)某些反硝化菌在硝酸鹽存在情況下具有吸磷功能，之后學者們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)某些聚磷菌可以利用亞硝酸鹽作為最終電子受體進行吸磷，一些兼具脫氮和除磷特性的反硝化聚磷菌被分離出來，使得脫氮除磷同步進行成為可能。已報道的反硝化聚磷菌有不動桿菌屬(Acinetobacter)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、副球菌屬(Paracoccus)、寡營養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)、莫拉氏菌屬(Moraxella)和腸桿菌屬(Enterobacter)等［43-45］。

發(fā)揮多種微生物的協(xié)同代謝優(yōu)勢，可實現(xiàn)多種污染物同時降解。如固定光合細菌(photosynthetic bacteria，PSB)處理污水，對氨氮、總氮和總磷的去除率最高分別達91.30%、73.51%和 84.88%［46］;固定生絲微菌屬(Hyphomicrobium)為主的反硝化菌群處理高濃度含氮廢水，對硝態(tài)氮的去除率可達92%［47］;用 PVA 固定 EM 菌(effective microorganisms)處理合成廢水，對COD和總氮的去除率分別可達 93%和 73%［48］;用 SA固定蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)及光合細菌(PSB)，對磷和氮的去除率分別為84%和95%，且使用固定化菌藻球凈化養(yǎng)殖廢水比單獨使用菌類或藻類效果更好［32］。

固定化微生物細胞的生物降解作用受微生物的菌齡、表面結(jié)構、表面電荷、疏水性等自身因素［49］以及pH值、營養(yǎng)物質(zhì)組成及濃度、無機離子濃度等環(huán)境因素［50］影響。固定化微生物細胞必須具有高生物催化活性、細胞的長期穩(wěn)定性、重復利用的可能性以及固定化過程中活性的低損失性等特性。

3 微生物固定化方法

3.1 吸附法(adsoption)

吸附法是微生物細胞直接和載體接觸，然后通過物理吸附、化學鍵吸附、離子交換吸附等方式黏附和定植于載體［51］。該法被認為是固定化方法中最簡單、傳統(tǒng)的方法［52］，具有反應溫和、簡單快速、不需要化學添加劑、載體可重復利用等優(yōu)點［53］。但由于微生物與載體之間的結(jié)合作用力較弱，微生物細胞易從載體上脫落［52］。為了防止脫落，選擇合適有效的吸附載體是該法的關鍵［51］，載體的質(zhì)地、比表面積、表面電荷等都是判斷載體吸附性能的重要依據(jù)。此外，細胞的胞外聚合物以及pH值、流速、溫度等外界環(huán)境都是影響吸附性能的重要因素。

無機吸附材料如活性炭、硅藻土、膨潤土、沸石、蛭石等，由于具有較大的孔隙度和比表面積、成本低、易獲得等優(yōu)勢，受到廣泛關注。朱曦等［28］分別以沸石、火山石、陶環(huán)、核桃殼、牡蠣殼為吸附載體處理養(yǎng)殖廢水，結(jié)果表明沸石對細胞負載量最大，牡蠣殼作為吸附載體降解氨氮和COD的能力較強。吳露等［54］比較膨潤土、紅壤和爐渣3種吸附載體的除磷特性，結(jié)果顯示，膨潤土吸附量最低，而爐渣吸附量最高。由于膨潤土、紅壤等無機吸附材料表面沒有帶電荷的官能團，主要依靠物理吸附，所以存在飽和吸附容量小、易脫落等問題。而爐渣的飽和吸附量及吸附速度優(yōu)于膨潤土和紅壤，主要原因是爐渣的Ca、Fe等金屬離子氧化物的含量明顯高于膨潤土和紅壤。載體材料中金屬氧化物和菌體細胞及水中的離子形成離子交換吸附，使結(jié)合力增強，載體材料的磷吸附能力與Ca、Mg、Al和Fe等金屬氧化物含量呈正相關［55］。研究發(fā)現(xiàn)，金屬氧化物和金屬有機框架化合物(MOFs)形成的復合材料展現(xiàn)出良好的吸附除磷性能。LI等［56］合成了一種中空磁性 Fe3O4@NH2-MIL-101(Fe)(比表面積為825.15 m2·g-1)，在pH值為7條件下吸附50 min，能夠?qū)⑺w磷質(zhì)量濃度由0.60降至 0.045 mg·L-1，實現(xiàn)了對磷的快速選擇性吸附。

研發(fā)高效載體材料是吸附法推廣應用的關鍵。近年來，鑭系元素改性吸附材料［11］、酸堿改性吸附材料(Zr-APT)［57］、磁性納米吸附材料［58］、人工合成吸附材料［59］等改性和新型吸附材料不斷研發(fā)并應用于富營養(yǎng)化水體除磷，在吸附容量和吸附速度等方面都表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢。

3.2 包埋法

包埋法分為凝膠包埋(entrapment)和微囊包埋(encapsulation)。凝膠包埋是將微生物固定在載體材料內(nèi)部，使菌體細胞免受外界環(huán)境因子的侵害［51］，是一種不可逆的固定化方法。該法由于操作簡單、固定化微球強度高，是目前最常用、研究最廣泛的一類固定化技術。但由于包埋過程中微生物要忍耐交聯(lián)階段的低溫，微生物細胞的活性會受到影響［60］，凝膠包埋會造成傳質(zhì)阻力大，所以適用于底物及產(chǎn)物都是小分子的反應系統(tǒng)，且該方法透氣性不好，不適于好氧微生物的固定化［61］。常用作包埋載體的材料如海藻酸鹽、PVA、瓊脂、卡拉膠、聚丙烯酰胺等，它們都具有多孔結(jié)構，這使得污染物和代謝產(chǎn)物很容易進入載體內(nèi)部［53］。

微囊包埋是將微生物固定在半透膜的微膠囊中，固定化細胞可在核心空間內(nèi)自由漂浮，外層 (外殼)由半透膜包裹，形成直徑幾毫米的微囊結(jié)構［62］。半透膜允許小分子營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物自由進出。而微生物細胞被包裹在膜內(nèi)，可防止外溢且保護其不受外界環(huán)境條件的影響。該技術的優(yōu)點是不需要對核心材料進行化學改性或修飾，這意味著固定化微生物的活性不受損失［63］。

包埋固定化技術自20世紀70年代開始應用于富營養(yǎng)化水體治理，獲得了很好的脫氮除磷效果。WANG等［64］用PVA+SA包埋硝化細菌置于人工濕地中，連續(xù)實驗結(jié)果表明該包埋顆粒對氨氮的去除率為85%，對COD的去除率為73%。唐艷葵等［65］對SA+PVA包埋反硝化聚磷菌群(DNPAOs)的脫氮除磷性能進行探討，結(jié)果發(fā)現(xiàn)包埋小球上的菌種多樣性較好，固定化體系平均除磷效率為 95.3%，COD去除率為74.9%，氨氮去除率為95.2%。

包埋載體材料的好壞直接決定固定化效率、固定化微生物活性及穩(wěn)定性等，是影響固定化效果的關鍵因素。因此許多研究者在包埋載體中加入改性劑，如添加活性炭、累托石、膨潤土等，以提高包埋材料的傳質(zhì)性能、機械強度以及包埋微生物的密度、催化活性，從而提高包埋體系的污染物去除能力。龐朵等［66］用SA+PEG作為包埋材料固定異養(yǎng)硝化菌去除水中氨氮時發(fā)現(xiàn)，加入適量活性炭后包埋小球的機械強度和小球內(nèi)的活菌數(shù)明顯提高。

3.3 共價結(jié)合法(covalent binding)

共價結(jié)合法是利用細胞表面的官能團和載體表面的反應基團形成化學共價鍵，從而固定微生物的方法。該法被認為是一種比較經(jīng)濟的方法［67］，也是一種不可逆的方法［68］。通過共價結(jié)合使固定化微生物和載體間結(jié)合力強，不易脫落，穩(wěn)定性好［69］，但是該方法操作和控制較復雜，反應條件激烈，對微生物細胞的損傷較大。共價結(jié)合法主要應用于酶固定，在細胞固定上應用較少［53］。

3.4 交聯(lián)法(cross linking)

交聯(lián)法又稱無載體固定法，該固定化方法不利用載體，主要依靠菌體間或通過交聯(lián)劑使微生物細胞相互結(jié)合，形成網(wǎng)狀結(jié)構。常用的交聯(lián)劑有戊二醛、甲苯二異氰酸酯和聚乙烯亞胺等。交聯(lián)固定法具有微生物間結(jié)合強度高、穩(wěn)定性好、細胞密度大、抗外界干擾能力強等優(yōu)點，但是該固定過程化學反應劇烈，對細胞活性影響大，且交聯(lián)劑大多昂貴，因此在水處理實際應用中受到一定限制。鄭建永等［27］采用聚乙烯亞胺和戊二醛交聯(lián)法對大腸桿菌的固定化工藝進行研究，發(fā)現(xiàn)與游離細胞相比，固定化細胞的酶活性、酸堿穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性均有一定程度提高，表明該固定化工藝具有潛在的工業(yè)化應用價值。

3.5 聯(lián)合固定化法(compound immobilization method)

聯(lián)合固定化法是將2種或2種以上的固定化方法結(jié)合，構成新的微生物固定化系統(tǒng)，如包埋-交聯(lián)法、吸附-包埋法、吸附-包埋-交聯(lián)法等，該技術彌補了單一固定化方法的不足，在微生物處理性能和處理效果等方面是單一固定化方法的數(shù)倍。鄭華楠等［10］用SA和PVA包埋固定硝化細菌，添加蘆葦生物炭作為吸附材料，利用吸附-包埋固定化方法處理富氨氮水體，結(jié)果顯示2種方法聯(lián)合使用有利于基質(zhì)的運輸和擴散，酸堿穩(wěn)定性和傳質(zhì)性分別提升12.5%和55.8%，固定化顆粒的破損率降低2.4%，72 h內(nèi)氨氮的去除率達 96.3%。李廷梅等［70］用吸附-包埋法處理河水中氨氮，反應24 h后總氮的去除率均在90%以上，說明該方法可有效應用于河道水質(zhì)凈化系統(tǒng)。朱倩等［9］用PVA和SA包埋硝化細菌處理水體中氨氮，加入交聯(lián)劑戊二醛后，載體的化學穩(wěn)定性和微生物的負載量都有所提升，氨氮的去除率可達90%以上。

4 固定化微生物技術在富營養(yǎng)化水體處理中的應用

目前已有膜處理、離子交換、吸附處理、電解處理、化學沉淀等多種污(廢)水氮磷的去除方法［71］。學者們針對固定化微生物技術開展了很多探索，該技術顯示出顯著的脫氮除磷效果。如張煥杰等［26］將分離篩選的高效反硝化菌——斯氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)用PVA+SA為載體包埋固定，開展人工濕地模擬污水試驗，結(jié)果顯示pH值、溫度、DO等外界條件波動對固定化反硝化菌的脫氮效果均小于游離反硝化菌，因此固定化技術可削弱環(huán)境因素對人工濕地的脫氮效果。佘夢林等［33］用SA包埋固定具高效聚磷作用的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)，處理 10 mg·L-1的含磷廢水，12 h可達到排放標準(TP質(zhì)量濃度＜0.5 mg·L-1)，處理時間比用游離菌縮短一半。除了應用單菌外，也有研究者將2種高效單菌復配以達到同時脫氮除磷。如周躍龍等［72］將高效脫氮菌及除磷菌進行復配，利用PVA進行包埋固定，在模擬河流中對氨氮和總磷的降解率分別達82.7%和79.27%。尹莉等［73］對硝化菌、反硝化菌、除磷菌、COD降解菌等復合菌包埋固定，在模擬裝置中考察污染物的去除效果，反應72 h時對氨氮、總氮和總磷的去除率分別為97%、60%和58%，固定化復合菌、粉狀菌和液態(tài)菌3種菌劑相比較，固定化復合菌的效果最好，且整體成本最低。反硝化聚磷菌的發(fā)現(xiàn)使脫氮和除磷同步進行成為可能。慕慶峰等［74］以海藻酸鈣作為壁材，用微囊包埋法固定反硝化聚磷菌——惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)并應用于濕地水體中，6 h時氨氮質(zhì)量濃度由5.38 mg·L-1降至檢測限以下，硝態(tài)氮去除率達98.4%，磷去除率達97.46%，同步脫氮除磷的效果非常顯著。

5 固定化微生物技術在富營養(yǎng)化水體修復過程中面臨的挑戰(zhàn)

5.1 缺乏性能優(yōu)良的固定化載體

載體是固定化技術規(guī)?；瘧玫年P鍵因素，固定化技術在實際應用中2個瓶頸:一是當前所用的載體價格普遍較高，運行成本較高;二是目前研發(fā)的固定化載體半衰期較短，水修復過程中需要頻繁更換載體，給運行管理帶來不便。因此盡快研發(fā)低廉高效、制備簡單、壽命長、傳質(zhì)阻力小、生物相容性好的載體材料，是該技術面臨的亟待解決的挑戰(zhàn)之一。目前研究資料顯示，基于納米材料的新型載體，如磁鐵礦(Fe3O4)納米粒子及其復合磁性納米材料［75］、氧化石墨烯及其衍生物［76］，由于具有成本低、穩(wěn)定性強、重復利用率高等優(yōu)勢，成為水處理工業(yè)化應用中極具前景的載體材料，需要深入探究其在富營養(yǎng)化水體凈化中的應用效果。

5.2 缺乏對固定化微生物的系統(tǒng)研究

富營養(yǎng)化水體是一個復雜的混合體系，污染物成分多種多樣，因此需要建立高效的固定化微生物體系，這種體系是使用復合菌劑，還是使用單一高效菌分級處理?固定化材料、固定化方式、固定化條件等對微生物的活性、穩(wěn)定性、負載量、氧和底物的傳質(zhì)速度等都會產(chǎn)生影響，固定化前后這些指標會發(fā)生多大程度的變化?在富營養(yǎng)化水體凈化實際應用過程中，如何解決固定化微生物的不穩(wěn)定性和高敏感性?這一系列問題目前尚缺乏系統(tǒng)研究，也是固定化微生物技術未來需要攻克的重點。

5.3 缺乏適用于富營養(yǎng)化水體修復的固定化反應器

當前，研究者們將固定化微生物技術和污(廢)水處理工藝相結(jié)合，研發(fā)了多種固定化反應器，如填充床反應器用于處理紡織工業(yè)廢水［77］，生物膜反應器用于處理制藥廢水［78］和生活污水［79］，流化床反應器用于處理印染廢水［80］等，都表現(xiàn)出顯著的污水處理優(yōu)勢，得到越來越廣泛的應用，但應用于修復富營養(yǎng)化天然水體的固定化反應器研究進展緩慢，因此盡快開發(fā)出適合原位修復的高效生化反應器，也是該技術的重要研究方向。

總之，雖然固定化微生物技術在實際應用中還存在一定的不足，但只要確定好方向，通過不斷改善和創(chuàng)新，許多不足會逐步解決，該技術必將會在工業(yè)化、規(guī)?；幚眍I域廣泛推廣應用。