劉小琳，柯志勇，宋千成，梁康檐

(南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教研室，廣東 廣州 510515)

炎癥，是一個(gè)基本的生物學(xué)過程，其功能主要是使宿主免受病原體的侵害，同時(shí)調(diào)節(jié)已發(fā)生損傷細(xì)胞的修復(fù)和愈合。巨噬細(xì)胞在炎癥的發(fā)生中起著關(guān)鍵作用，它們通過響應(yīng)其局部細(xì)胞因子環(huán)境，活化成促炎表型(M1)或抗炎表型(M2)，從而引發(fā)對(duì)病原體的炎癥反應(yīng)并修復(fù)受損組織[1]。研究顯示，M1型巨噬細(xì)胞可發(fā)生類似于癌細(xì)胞的糖代謝重編程，表現(xiàn)為糖酵解和乳酸釋放增強(qiáng)等特征[2]。在氧氣存在與否的條件下，癌細(xì)胞主要依賴糖酵解進(jìn)行代謝，稱為Warburg效應(yīng)，即有氧糖酵解[3]。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一種極其保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，它可以整合各種信號(hào)，包括能量、生長(zhǎng)因子、營(yíng)養(yǎng)和應(yīng)激等，以調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、存活和代謝[4-6]。mTOR主要有兩種蛋白復(fù)合物組成，mTOR復(fù)合物1(mTORC1)和mTOR復(fù)合物2(mTORC2)。mTORC1主要調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)和能量代謝等信號(hào)的調(diào)節(jié)。結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合物1(TSC1)是mTORC1信號(hào)通路的上游負(fù)調(diào)節(jié)因子，對(duì)mTOR的活性有一定的抑制作用[7-8]。糖酵解代謝過程中涉及3個(gè)限速酶，其中一個(gè)是6-磷酸果糖激酶-1(PFK1)。作為PFK1的變構(gòu)激活劑的果糖-2,6-二磷酸的產(chǎn)生就是由6-磷酸果糖激酶-2/果糖-2,6-磷酸酶-3(PFKFB3)催化[9]。 因此PFKFB3可以作為糖酵解過程中的一個(gè)重要的信號(hào)酶。巨噬細(xì)胞mTOR信號(hào)通路在小鼠有氧糖酵解的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著什么樣的作用卻不清楚。本文致力于探討巨噬細(xì)胞mTOR活性在有氧糖酵解中的調(diào)節(jié)作用。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物巨噬細(xì)胞特異性敲除TSC1小鼠(Lysm-Cre TSC1flox/flox)和對(duì)照小鼠(TSC1flox/flox)均來(lái)自南方醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)教研室。

1.1.2試劑高脂飼料和普通飼料(參照美國(guó)Research Diets公司配方)；葡萄糖(上海麥克林生化科技有限公司)；ELISA試劑盒(Alpco公司，USA)；胰島素(Eli Lilly公司, USA)；雷帕霉素(Santa Cruz公司，USA)；PFKFB3抗體(Abcam公司，USA)；其他常用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1小鼠的飼養(yǎng)與分組在SPF級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)小鼠，溫度控制在22 ℃，濕度保持在60%左右，12 h光照與12 h黑暗，晝夜交替。我們使用Lysm-Cre TSC1flox/flox小鼠和TSC1flox/flox小鼠分別作為巨噬細(xì)胞特異性敲除TSC1小鼠和對(duì)照小鼠，并分別命名為KO小鼠和WT小鼠。

1.2.2胰島素抵抗模型的構(gòu)建選用4周齡的KO小鼠和WT小鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)后，高脂飲食12周，作為造模組(HFD)，對(duì)照組給予正常飼料(CD)，四組分別命名為CD-KO、CD-WT、HFD-KO和HFD-WT，每周測(cè)量并記錄小鼠體重。隨后對(duì)四組小鼠進(jìn)行葡萄糖糖耐量實(shí)驗(yàn)(IPGTT)和胰島素耐受實(shí)驗(yàn)(ITT)。

1.2.2.1IPGTT小鼠禁食不進(jìn)水16 h后，腹腔注射2 mg·g-1的葡萄糖溶液(生理鹽水稀釋，400 mg·mL-1)，0、15、30、60及120 min后，小鼠尾靜脈取血，用血糖儀測(cè)定小鼠的血糖值。注射葡萄糖0、15、30、60及120 min后，同時(shí)用ELISA方法測(cè)定血清胰島素水平。

1.2.2.2ITT小鼠非空腹，腹腔注射0.8 mU·g-1胰島素溶液(生理鹽水稀釋，0.8 U·mL-1)，測(cè)定注射0、20、40、60及80 min后小鼠的血糖值。

1.2.3驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1體外驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)分別取KO小鼠和WT小鼠的原代巨噬細(xì)胞，培養(yǎng)至最佳生長(zhǎng)期，以5×104濃度的細(xì)胞濃度接種于12孔板，細(xì)胞貼壁后每孔換成1 mL新鮮培養(yǎng)基或含有雷帕霉素(50 nM)的培養(yǎng)基，每組實(shí)驗(yàn)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)4、8和12 h后，用生化分析儀檢測(cè)葡萄糖消耗和乳酸生成。

1.2.3.2體內(nèi)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)按照2 mg·g-1對(duì)小鼠進(jìn)行雷帕霉素灌胃，連續(xù)2周，之后按照之前的方法再進(jìn)行一次葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)。

1.2.4免疫熒光染色取KO小鼠和WT小鼠的肝臟組織，利用免疫熒光染色檢測(cè)PFKFB3的表達(dá)情況。

1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA法)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1巨噬細(xì)胞mTOR活化加劇小鼠的胰島素抵抗為了研究巨噬細(xì)胞mTOR在調(diào)節(jié)機(jī)體胰島素敏感性中的功能，我們給予WT小鼠和KO小鼠高脂飲食或正常飼料喂養(yǎng)12周。結(jié)果顯示，與CD-KO和CD-WT小鼠相比，HFD-KO和HFD-WT小鼠的體重均有所增加，但HFD-KO和HFD-WT小鼠之間沒有明顯差異(圖1A)。此外，我們進(jìn)行了IPGTT和ITT以評(píng)估巨噬細(xì)胞TSC1缺失在胰島素抵抗中的作用。在IPGTT中，四組小鼠血糖值均在30 min時(shí)達(dá)到峰值，HFD-WT小鼠血糖值及血糖升高幅度明顯高于HFD-KO小鼠(P<0.05)，CD-WT小鼠血糖值及血糖升高幅度同樣明顯高于CD-KO小鼠(P<0.05)，HFD-KO小鼠和CD-KO小鼠血糖值無(wú)明顯差異(圖1B)。HFD- KO小鼠血清胰島素水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于HFD-WT小鼠(P<0.05，圖1C)。在ITT中，注射胰島素后，HFD組小鼠血糖值明顯高于CD組小鼠(P<0.05)，同時(shí)HFD-WT小鼠血糖值及血糖降低幅度明顯小于HFD-KO小鼠(P<0.05，圖1D)。以上結(jié)果顯示高脂飲食造模后，小鼠體重明顯增加，并出現(xiàn)了胰島素抵抗。與WT小鼠比較，KO小鼠出現(xiàn)更加嚴(yán)重的胰島素抵抗，胰島素分泌的量也增多。但正常飲食組卻沒有發(fā)現(xiàn)KO小鼠出現(xiàn)胰島素抵抗。

圖1 胰島素抵抗模型的構(gòu)建

2.2巨噬細(xì)胞mTOR活性對(duì)糖酵解的影響結(jié)果顯示，與WT小鼠相比，KO小鼠的原代腹腔巨噬細(xì)胞葡萄糖消耗量明顯升高；經(jīng)雷帕霉素處理后， KO小鼠的原代腹腔巨噬細(xì)胞葡萄糖消耗量明顯降低(P<0.05，圖2A)，乳酸生成同樣明顯降低(P<0.05，圖2B)。對(duì)小鼠進(jìn)行雷帕霉素灌胃后，KO小鼠血糖值明顯升高(P<0.05，圖2C)。葡萄糖負(fù)荷30 min時(shí)血糖值達(dá)到最高，為21.85 mmol·L-1。結(jié)果表明巨噬細(xì)胞可通過mTOR信號(hào)通路促進(jìn)糖酵解并產(chǎn)生乳酸，mTOR活性受到抑制后，糖酵解也受到抑制。

2.3PFKFB3在小鼠肝組織的分布免疫熒光染色結(jié)果顯示，與WT小鼠相比，KO小鼠的肝組織PFKFB3蛋白表達(dá)量明顯增強(qiáng)(圖3)。

3 討 論

過去數(shù)十年，人們發(fā)現(xiàn)炎癥與糖酵解有一定的相關(guān)性，巨噬細(xì)胞作為炎癥的重要參與成員對(duì)糖酵解的調(diào)節(jié)也有一定的影響，而且與臨床上大多數(shù)疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[10]。

在本研究中，我們闡述了巨噬細(xì)胞mTOR在葡萄糖代謝中的功能。我們發(fā)現(xiàn)，KO小鼠消耗血糖的能力與mTOR活化有關(guān)。為了確認(rèn)巨噬細(xì)胞mTOR活性參與糖酵解途徑的調(diào)節(jié)，我們用雷帕霉素抑制mTOR活性，巨噬細(xì)胞的有氧糖酵解作用受到抑制。同時(shí)，體外實(shí)驗(yàn)得到類似的結(jié)果，雷帕霉素抑制mTOR活性后，小鼠機(jī)體的血糖值明顯升高，有氧糖酵解作用受到抑制。為了探討巨噬細(xì)胞mTOR活性如何調(diào)節(jié)糖酵解，我們?nèi)⌒∈蟮母谓M織進(jìn)行熒光染色，發(fā)現(xiàn)KO小鼠的肝組織有大量的PFKFB3蛋白表達(dá)，該蛋白可以影響2，6-二磷酸果糖水平，進(jìn)而影響有氧糖酵解通路。因此巨噬細(xì)胞可能通過mTOR信號(hào)通路調(diào)節(jié)PFKFB3影響有氧糖酵解途徑。

圖2 巨噬細(xì)胞mTOR活性對(duì)糖酵解的影響

圖3 免疫熒光染色檢測(cè)PFKFB3的表達(dá)

mTOR信號(hào)通路可調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的亞型(M1/M2)：mTOR活化促進(jìn)M1型巨噬細(xì)胞的極化[11-12]，而M1型巨噬細(xì)胞可發(fā)生類似于癌細(xì)胞的糖代謝重編程。糖代謝重編程是調(diào)控M1型巨噬細(xì)胞炎癥啟動(dòng)的核心事件[10]。研究證實(shí)，mTOR信號(hào)激活增強(qiáng)HIF-1α基因的表達(dá)，M1型巨噬細(xì)胞可通過缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)蛋白促進(jìn)有氧糖酵解[13-14]。有研究發(fā)現(xiàn)，mTOR信號(hào)通路調(diào)節(jié)PKM2影響食管鱗癌細(xì)胞有氧糖酵解[15]，PKM2和本研究中PFKFB3都是糖酵解代謝中的關(guān)鍵酶。通過小鼠胚胎成纖維細(xì)胞進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)mTOR是通過HIF-1α上調(diào)PFKFB3的表達(dá)[16]， 在人急性髓細(xì)胞性白血病細(xì)胞中，mTORC1依賴于HIF-1α上調(diào)PFKFB3的表達(dá)，可以正向調(diào)節(jié)有氧糖酵解代謝[17]，以上研究結(jié)果與本研究結(jié)果有異曲同工之處，不同之處在于，本研究是動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，且本研究不僅在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)得到驗(yàn)證，小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也得到了相似的結(jié)果。PFKFB3在多種腫瘤組織和細(xì)胞中普遍表達(dá)，在調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的糖酵解過程中其重要作用，通過沉默或者抑制腫瘤細(xì)胞中的PFKFB3，可以降低癌細(xì)胞的糖酵解代謝[18-20]。以往研究和本研究都證實(shí)了PFKFB3與糖酵解的相關(guān)性。且本研究證實(shí)了在小鼠巨噬細(xì)胞中，mTOR通過上調(diào)PFKFB3的表達(dá)，可以正向調(diào)節(jié)有氧糖酵解代謝。那么小鼠體內(nèi)巨噬細(xì)胞是否通過mTOR活性改變自身極化狀態(tài)調(diào)節(jié)HIF-1α的表達(dá)，進(jìn)一步調(diào)節(jié)PFKFB3的表達(dá)，從而影響有氧糖酵解呢？我們需要更進(jìn)一步的研究。