孫恬 劉鳳松 馮沖

摘要：考察不同干燥方法（烘干、微波、真空干燥、陰干、曬干）對(duì)巴戟天藥材中寡糖類成分含量的影響。利用HPLC-ELSD法測(cè)定儲(chǔ)存過(guò)程中D-果糖、D（+）-無(wú)水葡萄糖、蔗糖、1-蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖的含量。色譜柱為Waters XBridgeTM Amide（4.6 mm×250 mm，3.5 μm），流動(dòng)相為0.2%三乙胺乙腈-0.2%三乙胺水溶液，梯度洗脫，體積流量0.8 mL/min，柱溫35 ℃;ELSD漂移管溫度75 ℃，氮?dú)饬髁?.5 L/min。結(jié)果表明，在不同溫度（45、60、75、90 ℃）烘干過(guò)程中，隨著溫度的升高，耐斯糖和1F-果呋喃糖基耐斯糖含量呈逐漸降低的趨勢(shì)，其中以60 ℃耐斯糖含量較高;其他干燥方法中，微波和真空干燥方法耐斯糖含量均降低，且成本較高，建議不采用;曬干和陰干雖成本低，但由于干燥過(guò)程的時(shí)間較長(zhǎng)，耐斯糖在干燥過(guò)程中會(huì)降解，含量明顯下降。因此，建議巴戟天藥材采用低溫鼓風(fēng)烘干，最佳適宜溫度為60 ℃。

關(guān)鍵詞：巴戟天;寡糖;干燥方法;化學(xué)成分;色譜分析

中圖分類號(hào)： R284.1? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2020）06-0180-04

巴戟天藥材來(lái)源于茜草科植物巴戟天（Morinda officinalis How）的干燥根，具有補(bǔ)腎陽(yáng)、祛風(fēng)濕、強(qiáng)筋骨的功效[1]。巴戟天為廣東省道地藥材，也是我國(guó)著名的“四大南藥”之一，作為滋補(bǔ)腎陽(yáng)的重要中藥材，在我國(guó)具有悠久的應(yīng)用歷史。現(xiàn)代的研究表明，巴戟天中主要含有寡糖、蒽醌、環(huán)烯醚萜等成分[2]，其中主要有效成分為寡糖類化合物，占生藥材的30%以上[3]，具有多方面的藥理作用，包括抗抑郁、改善生殖功能、神經(jīng)保護(hù)等[4-7]。巴戟天為多年生植物，采收后產(chǎn)地加工主要為曬干或陰干，這些方法雖然成本低，但都存在干燥周期較長(zhǎng)、易受天氣條件影響、干燥后藥材質(zhì)量不均勻等問(wèn)題。巴戟天中的寡糖為菊淀粉型（inulin），其結(jié)構(gòu)為若干個(gè)果糖單元以β-（2→1）-鍵連接，末端連接蔗糖殘基[8]。前期研究表明，巴戟天寡糖在提取加熱過(guò)程中存在化學(xué)不穩(wěn)定性[9]，在干燥過(guò)程中寡糖是否發(fā)生變化，尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究對(duì)不同干燥方法（烘干、微波、真空干燥、陰干、曬干）對(duì)巴戟天寡糖化學(xué)成分的影響進(jìn)行研究，為巴戟天初加工標(biāo)準(zhǔn)的制定和規(guī)范化研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

HITACHI Primaide高效液相色譜儀[日立（中國(guó)）有限公司生產(chǎn)]，UM5800蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（上海通微分析技術(shù)有限公司生產(chǎn)），SHIMADZU UX420H電子天平（精度=0.01 g，日本SHIMADZU公司生產(chǎn)），Sartorius電子分析天平（精度=0.1 mg，瑞士Sartorius公司生產(chǎn)），DFT-200高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（25 000 r/min，溫嶺市林大機(jī)械有限公司生產(chǎn)），CQ-200超聲波清洗器（功率200 W，頻率40 kHz，上海音波聲電科技公司生產(chǎn)），LD4-2A低速離心機(jī)（轉(zhuǎn)速3 000 r/min，北京醫(yī)用離心機(jī)廠生產(chǎn)）。

1.2 試劑

乙腈（色譜純，美國(guó)ACS化學(xué)試劑公司生產(chǎn)），三乙胺（色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)），乙醇為分析純，水為去離子水。

對(duì)照品：D-果糖（D-fructose，批號(hào)：J31M8R36916）、D（+）-無(wú)水葡萄糖[D（+）-glucose，批號(hào)：S08G6J1]、蔗糖（sucrose，批號(hào)：S02S6G1）、1-蔗果三糖（1-kestose，批號(hào)：C09D8Q50061）、耐斯糖（nystose，批號(hào)：Z17A9H59088）、1F-果呋喃糖基耐斯糖（1F-fructofuranosylnystose，批號(hào)：S09A8D41431）均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，純度均大于98%。

樣品：巴戟天藥材來(lái)源于廣東省德慶縣高良鎮(zhèn)，種植4年，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)丁平研究員鑒定為巴戟天（Morinda officinalis How）的干燥根，憑證標(biāo)本存放于廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源教研室。將巴戟天生品分別用45、60、75、90 ℃烘干（鼓風(fēng)干燥）以及微波干燥、真空干燥、陰干、曬干的方法進(jìn)行干燥，打粉（65目），供含量測(cè)定。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性考察

色譜柱為Waters XBridgeTM Amide（4.6 mm×250 mm，3.5 μm），流動(dòng)相為0.2%三乙胺乙腈 （A）-0.2%三乙胺水溶液（B），梯度洗脫（0～10 min，75%～70% A;10～20 min，70% A;20～45 min，70%～60% A;45～60 min，60% A;60～63 min，60%～75% A;63～75 min，75% A）;體積流量0.8 mL/min;進(jìn)樣量：20 μL;柱溫：35 ℃;蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）漂移管溫度：75 ℃;氮?dú)饬髁浚?.5 L/min。在此條件下，主峰保留時(shí)間適中，各色譜峰理論塔板數(shù)均不小于9 000，D-果糖、D（+）-無(wú)水葡萄糖、蔗糖、1-蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，符合《中國(guó)藥典》的要求?？瞻兹芤?、混合對(duì)照品、巴戟天寡糖供試品溶液HPLC-ELSD圖見(jiàn)圖1。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精確稱取對(duì)照品D-果糖、D（+）-無(wú)水葡萄糖、蔗糖、1-蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖適量，置于10 mL量瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)為60%的乙腈溶解并定容至刻度，搖勻，制成每1 mL含 D- 果糖1.378 mg、D（+）-無(wú)水葡萄糖 0.828 mg、蔗糖1.210 mg、1-蔗果三糖0.832 mg、耐斯糖1.280 mg、1F-果呋喃糖基耐斯糖1.658 mg的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.3 供試品溶液的制備

稱取巴戟天粉末（過(guò)6號(hào)篩）0.5 g，置于具塞錐形瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇50 mL，稱質(zhì)量，靜置30 min，流水超聲處理20 min，擦干，稱質(zhì)量，用50%乙醇補(bǔ)足損失質(zhì)量，搖勻，于2 000 r/min離心10 min，上清液以0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 分別精確吸取混合對(duì)照品貯備液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置于1 mL量瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液定容至刻度，搖勻，0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得不同濃度的混合對(duì)照品溶液。分別按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，取峰面積平均值，以各混合對(duì)照品進(jìn)樣質(zhì)量（μg）的對(duì)數(shù)值x為橫坐標(biāo)，以峰面積積分值的對(duì)數(shù)值y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表1，結(jié)果表明，耐斯糖等6種寡糖在相應(yīng)的線性范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系。

2.4.2 精密度試驗(yàn) 日內(nèi)精密度：取巴戟天，按照“2.3”節(jié)方法制備供試品溶液，于同一日內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算D-果糖、D（+）-無(wú)水葡萄糖、蔗糖、1-蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖的峰面積，上述6種成分峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD范圍在1.91%～4.73%。日間精密度：精確吸取同一供試品溶液，分別于3日內(nèi)每日連續(xù)進(jìn)樣3次，計(jì)算D-果糖、D（+）-無(wú)水葡萄糖、蔗糖、1-蔗果三糖、耐斯糖、1F- 果呋喃糖基耐斯糖的峰面積，上述6種成分峰面積的RSD范圍在2.29%～3.90%。結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取巴戟天，按照“2.3”節(jié)方法制備供試品溶液，在供試品溶液制備后0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、24.0、48.0、72.0 h分別進(jìn)樣 20 μL，計(jì)算D-果糖、D（+）-無(wú)水葡萄糖、蔗糖、1- 蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖的峰面積，上述6種成分峰面積的RSD范圍在1.77%～3.51%。結(jié)果表明，供試品溶液中的D-果糖等6種成分在72 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精確稱取同一批巴戟天6份，每份2.0 g，按照“2.3”節(jié)供試品溶液制備方法，平行制備6份供試品，進(jìn)樣，計(jì)算D-果糖、D（+）-無(wú)水葡萄糖、蔗糖、1-蔗果三糖、耐斯糖、1F- 果呋喃糖基耐斯糖的峰面積，并計(jì)算各成分的含量。上述6種成分含量RSD范圍在2.20%～2.68%。結(jié)果表明，該方法重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 精確稱取已知含量的巴戟天9份，每份1.0 g，分別加入每1 mL含D-果糖4.080 mg、D（+）-無(wú)水葡萄糖1.880 mg、蔗糖3980 mg、1-蔗果三糖2.520 mg、耐斯糖 6.220 mg、1F-果呋喃糖基耐斯糖7.650 mg的混合對(duì)照品溶液1、2、3 mL（各3份），按照“2.3”節(jié)方法平行制備供試品溶液，測(cè)得D-果糖、D（+）-無(wú)水葡萄糖、蔗糖、1-蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖的平均回收率（n=9）分別為97.28%、97.90%、101.00%、101.69%、99.79%、101.29%，RSD分別為2.25%、2.08%、2.01%、1.92%、2.36%、178%，表明該方法的準(zhǔn)確度較好。

2.5 不同干燥方法巴戟天寡糖含量測(cè)定

按“2.3”節(jié)方法制備供試品溶液，按“2.1”節(jié)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算巴戟天不同等級(jí)各樣品中D-果糖、D（+）-無(wú)水葡萄糖、蔗糖、1-蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖的含量（按干燥品計(jì)算），結(jié)果見(jiàn)表2。

從表2中可以看到，每一種干燥方法對(duì)巴戟天中的寡糖含量均有影響，綜合考慮操作簡(jiǎn)易度、所耗時(shí)長(zhǎng)與成本以及最終的寡糖含量，可得出60 ℃烘干條件較適合在企業(yè)生產(chǎn)中推廣，微波干燥次之，然后為曬干干燥、真空干燥、陰干干燥等。

3 討論

巴戟天中的寡糖類成分沒(méi)有紫外吸收，不適宜用傳統(tǒng)的紫外檢測(cè)器進(jìn)行定性定量分析，而蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）可以彌補(bǔ)這方面的不足。本試驗(yàn)考察了Waters XBridgeTM Amide、Thermo APS-2 HYPERSIL、Ecosil 120-5 Amino等色譜柱的分離效果，其中Waters XBridgeTM Amide色譜柱對(duì)D-果糖等6種待測(cè)成分的分離效果最好，各成分保留時(shí)間適中，基線平，噪音低，故選擇該色譜柱進(jìn)行含量測(cè)定。另外考察了乙腈-水和含不同濃度三乙胺的乙腈-水溶液作為流動(dòng)相的分離效果，結(jié)果表明，在乙腈和水中加入等量的三乙胺（0.2%）時(shí)，各成分的分離效果最好，且有利于有機(jī)相和水相的均勻混合及系統(tǒng)pH值的穩(wěn)定。

在不同溫度（45、60、75、90 ℃）烘干過(guò)程中，隨著溫度的升高，耐斯糖和1F-果呋喃糖基耐斯糖呈逐漸降低的趨勢(shì)，其中以60 ℃烘干過(guò)程中耐斯糖含量最高。其他干燥方法中，微波和真空干燥方法耐斯糖含量均降低，且成本較高，建議不采用;曬干和陰干雖成本低，但由于干燥的過(guò)程時(shí)間較長(zhǎng)，耐斯糖在干燥過(guò)程中會(huì)降解[9]，含量明顯下降，不宜采用。因此，建議巴戟天藥材采用低溫60 ℃鼓風(fēng)烘干。

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