劉永新，袁 旦，陳 沁，鈕 冰

(上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200444)

1 前 言

2004年Dirks和Pierce首次提出了一種體外恒溫擴增技術(shù)，即雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(HCR)[1]。HCR的反應(yīng)過程不需任何核酸工具酶的參與，且在室溫下便可進行，此外，這種信號擴增技術(shù)與各類檢測技術(shù)如熒光法、比色法和電化學(xué)法等都具有較高的兼容性，因而在生物傳感領(lǐng)域的DNA、miRNA、蛋白質(zhì)以及金屬離子的檢測[2-7]中得到了廣泛關(guān)注。

納米尺寸的材料會表現(xiàn)出一些獨特的性質(zhì)，例如表面效應(yīng)、體積效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)、介電限域效應(yīng)等。因此，將HCR與納米材料結(jié)合，極大程度地提高了靶標(biāo)DNA、miRNA、蛋白質(zhì)以及金屬離子的檢測靈敏度，使之甚至可以達(dá)到單分子檢測水平。尤其是在核酸檢測方面，與傳統(tǒng)核酸檢測方法(如：PCR、熒光RT-PCR)相比，這種將HCR與納米材料結(jié)合的方法不僅可以在常溫下進行，反應(yīng)過程不需要酶的參與，而且能夠?qū)崿F(xiàn)可視化檢測，檢測限低至飛摩爾水平，并能有效縮短檢測時間，適合于在現(xiàn)場和實驗條件較簡單的實驗室進行快捷檢測。本文將具體討論HCR與幾種常見的納米材料(銀納米顆粒、金納米顆粒、氧化石墨烯及其他幾種金屬納米材料)結(jié)合在核酸檢測方面的研究進展。

2 雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(HCR)的原理

HCR反應(yīng)系統(tǒng)包括兩個可雜交互補并帶有粘性末端的DNA發(fā)夾探針(H1和H2)，以及單鏈DNA(ssDNA)引發(fā)劑。在ssDNA(引發(fā)劑)誘發(fā)下，這兩個發(fā)夾探針會自組裝形成長的雙鏈DNA(dsDNA)產(chǎn)物。具體過程如圖1所示：亞穩(wěn)態(tài)的H1和H2在水溶液中共存時并不發(fā)生任何反應(yīng)，但當(dāng)引入引發(fā)劑時，引發(fā)劑會激活并打開第一個發(fā)夾探針H1的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，隨后，這個打開的H1會立即與第二個發(fā)夾探針H2雜交并打開H2的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，從而形成帶有ssDNA粘性末端的dsDNA，這又導(dǎo)致了另一個H1發(fā)夾探針的打開并且誘發(fā)HCR整個過程的延續(xù)，最終產(chǎn)生長的dsDNA產(chǎn)物。這個過程會持續(xù)進行直到這兩個發(fā)夾探針消耗殆盡或者形成的dsDNA產(chǎn)物的濃度達(dá)到閾值。

圖1 雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的原理示意圖Fig.1 Schematic diagram of hybrid chain reaction

3 HCR與納米材料結(jié)合的應(yīng)用

3.1 與銀納米顆粒(AgNPs)的結(jié)合

銀納米材料具有優(yōu)良的導(dǎo)電導(dǎo)熱性能和穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)，特別是銀納米顆粒(AgNPs)具有表面等離子體共振效應(yīng)，可以增強表面拉曼散射、表面熒光和催化活性。同時，由于AgNPs具有良好的生物活性和生物相容性，因而被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，如用作某些生物蛋白分子和藥物載體。由于介入的AgNPs還可以增強蛋白酶的催化能力，且其性質(zhì)接近天然生物組織，不會對人體產(chǎn)生毒副作用，所以細(xì)胞可以在其表面生長，從而修復(fù)病變組織。AgNPs還具有良好的抑菌效果，Bryaskova等的研究表明，當(dāng)使用AgNPs對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌以及銅綠假單胞菌進行抑菌檢測時，AgNPs的濃度顯著影響抑菌效果，而且濃度越高，抑菌效果越好，在0.4%時達(dá)到最好的抑菌效果[8]。

3.1.1 HCR與AgNPs結(jié)合的比色檢測法

近年來，基于金屬納米顆粒的比色測定方法由于其便于觀察以及制備過程簡單的優(yōu)點而備受關(guān)注[9]。在金屬納米粒子中，AgNPs常被用于比色檢測，相較于AuNPs，AgNPs表現(xiàn)出一定程度的優(yōu)勢：具有更高的摩爾吸光系數(shù)、具有優(yōu)異的光學(xué)性質(zhì)、易于觀察其分散狀態(tài)和聚集狀態(tài)之間的顏色轉(zhuǎn)換[10, 11]。近年來，不同的AgNPs合成和修飾方法被發(fā)展起來用于核酸的微量檢測。例如，Guo等[12]設(shè)計了等離子體比色法，在酶的誘導(dǎo)下，AgNPs會在等離子體金納米星(AuNS)上生長，導(dǎo)致AuNS的顏色從藍(lán)色變?yōu)樯钏{(lán)色，再變?yōu)樽仙?，最終達(dá)到橙色。當(dāng)以DNA為靶分子進行HCR后，可得DNA的檢測范圍從1×10-14到5×10-11mol/L，檢測限為2.6×10-15mol/L。

這種比色方法不僅可以用于檢測DNA，也可以實現(xiàn)對miRNA的檢測。Miao等[13]提出了一種基于HCR介導(dǎo)從而引起AgNPs局部表面等離子體共振(LSPR)發(fā)生改變的方法，用來檢測流感病毒H1N1的生物標(biāo)志物miRNA-29a-3p，并將這種新型比色分析方法用于臨床診斷，如圖2所示。在這項研究中，阻滯劑DNA被固定在金固體表面，并與另一個HP0探針部分雜交，之后將金固體表面浸入到含有兩個DNA探針HP1和HP2以及AgNPs的膠體系統(tǒng)中，該系統(tǒng)中的HP1和HP2可穩(wěn)定AgNPs的狀態(tài)，使其不受二價陽離子的誘導(dǎo)聚集。當(dāng)引入靶標(biāo)miRNA-29a-3p時，該miRNA引發(fā)鏈置換反應(yīng)，釋放HP0到溶液中，進而觸發(fā)HCR。此時，由于缺乏HP1和HP2，AgNPs發(fā)生聚集，并隨著miRNA濃度的增加，AgNPs膠體系統(tǒng)顏色由金黃色逐漸變淡。這種簡單設(shè)計的用于miRNA檢測的方法達(dá)到了1×10-12mol/L的檢測限。

圖2 基于HCR與AgNPs的用于miRNA分析的比色策略Fig.2 Colorimetric strategy for miRNA analysis based on HCR and AgNPs

3.1.2 HCR與AgNPs結(jié)合的電化學(xué)檢測法

為了制造便攜且價格合理的診斷裝置，全世界在開發(fā)和改進金屬生物檢測方面做出了大量努力?；谛滦图{米材料構(gòu)建的電化學(xué)生物傳感器，由于其制備方法簡單、靈敏度高、響應(yīng)速度快和成本低等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用于食品、制藥、環(huán)境監(jiān)測、生物醫(yī)藥等方面。AgNPs具有較強的電化學(xué)性質(zhì)，如低氧化還原電位、清晰的伏安峰和優(yōu)異的電子傳遞速率[14, 15]。因此，基于AgNPs的生物分析被認(rèn)為是檢測低濃度分析物的一種有效方法。Zhuang等[16]設(shè)計了一種新型無標(biāo)記金屬生物電化學(xué)法，并將其用于超敏感檢測人類免疫缺陷病毒(HIV)相關(guān)基因片段。這種方法是基于靶觸發(fā)的遠(yuǎn)程自組裝DNA納米結(jié)構(gòu)和DNA雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，首先在傳感器上固定捕獲探針，然后加入目標(biāo)DNA以及含有引發(fā)鏈的檢測探針，由于堿基互補配對作用，捕獲探針、目標(biāo)DNA以及檢測探針之間形成三明治式結(jié)構(gòu)，檢測探針中的引發(fā)鏈在兩個不同的DNA發(fā)夾之間觸發(fā)串級雜交事件，產(chǎn)生類似交變共聚物的刻痕雙螺旋。帶負(fù)電荷的DNA聚合物可以遠(yuǎn)距離吸附DNA結(jié)構(gòu)上帶正電荷的金屬銀納米標(biāo)簽，通過監(jiān)測電流的變化，從而間接得到該傳感器可檢測到的DNA的濃度范圍為1×10-15到1×10-14mol/L，檢測限為5×10-16mol/L。

電化學(xué)生物傳感器同樣適用于miRNA的快速、靈敏、選擇性檢測。Miao等[17]設(shè)計了具有識別發(fā)夾的四面體DNA，并將其固定在金電極上。四面體結(jié)構(gòu)可以增加可接近性和反應(yīng)性，并避免引入間隔分子。靶miRNA可以打開四面體DNA上的發(fā)夾，然后發(fā)夾上釋放的莖序列與AuNPs表面上的HCR-H0雜交并在電極上募集納米顆粒，游離的HCR-H0進一步與已被AgNPs標(biāo)記的HCR-H1和HCR-H2發(fā)生HCR。這樣，大量的AgNPs被連接到電極上，通過檢測和分析來自AgNPs的剝離電流峰值，大大提高miRNA的檢測靈敏度，線性范圍從1×10-16到1×10-10mol/L，且檢測限為2×10-18mol/L。另外，該研究還檢測了人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)、人宮頸癌細(xì)胞(HeLa)、人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)和人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)這幾種細(xì)胞的裂解物中的miRNA-21，進一步證明了該方法的準(zhǔn)確性與實用性。

3.2 與金納米顆粒(AuNPs)的結(jié)合

AuNPs是直徑為0.8～250 nm的締合膠體，膠體金顆粒一共分為3層，最外層離子使金溶液由于靜電作用而處于懸浮穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，形成帶負(fù)電的水溶膠。AuNPs具有毒性低、生物相容性強、獨特的光學(xué)性質(zhì)以及易于表面修飾等優(yōu)點，而且能夠精確控制其粒徑、形狀和表面性能[18]?；贏uNPs制備而成的多功能新型材料已被廣泛應(yīng)用于食品安全檢測、環(huán)境安全監(jiān)測和醫(yī)學(xué)檢測分析等領(lǐng)域。此外，使用AuNPs進行敏感性檢測的器件，可以開發(fā)出不同的生物傳感器，實現(xiàn)對金屬離子[19]、分子[20]、蛋白質(zhì)[21]、核酸[22, 23]等生物靶標(biāo)的高效檢測。

在納米材料中，AuNPs在20世紀(jì)70年代就已作為信號標(biāo)記分子應(yīng)用于生物學(xué)領(lǐng)域，其主要標(biāo)記對象是蛋白質(zhì)和核酸。Faulk等[24]于1971年建立了一種電鏡免疫技術(shù)，首次實現(xiàn)了AuNPs標(biāo)記技術(shù)與免疫技術(shù)的融合，該技術(shù)將蛋白質(zhì)與AuNPs結(jié)合，并通過免疫學(xué)反應(yīng)對細(xì)菌進行檢測。之后，Mirkin等[25]于1996年首次將AuNPs應(yīng)用于核酸檢測，將AuNPs與巰基修飾的寡核苷酸片段結(jié)合用于制備一種核酸比色探針，通過比色分析AuNPs溶液顏色的變化實現(xiàn)對特定核苷酸序列的檢測。

3.2.1 基于比色策略的核酸檢測

在比色生物傳感器中，AuNPs以其獨特的性質(zhì)，如光學(xué)、化學(xué)以及尺寸依賴的物理性質(zhì)而引起了極大的關(guān)注。由于溶液中AuNPs的聚集過程，使溶液顏色從酒紅色變?yōu)樗{(lán)色，而AuNPs的解聚過程又會使溶液從藍(lán)色變回酒紅色?；谶@種可逆的顏色變化[26]，將AuNPs與HCR進行耦合，大量的比色生物傳感器被設(shè)計出來用于檢測不同的生物分子，如核酸[27]、蛋白質(zhì)[28]、細(xì)胞表面的N-聚糖[29]等。Liu等[30]提出了一種將AuNPs的比色檢測法與DNA雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增相結(jié)合的檢測系統(tǒng)。如圖3所示，該檢測系統(tǒng)包括發(fā)夾探針H1和H2、帶負(fù)電的AuNPs、鹽溶液。當(dāng)引入靶標(biāo)ssDNA時，靶DNA與發(fā)夾探針雜交并誘發(fā)HCR，形成帶切口的雙鏈DNA聚合物。這個長dsDNA暴露出其帶負(fù)電的磷酸骨架，由于靜電排斥作用，不能與帶負(fù)電的AuNPs結(jié)合。此時，在檢測體系中鹽離子的誘導(dǎo)下，游離的AuNPs發(fā)生聚集，使得反應(yīng)液顏色從淺酒紅色變成藍(lán)色，且肉眼檢測的檢測限是1×10-10mol/L。該檢測系統(tǒng)具有一些突出的優(yōu)點，如避免了酶的引入、在完全匹配的靶寡核苷酸和具有單堿基對錯配的靶標(biāo)之間表現(xiàn)出高度區(qū)分等，重點是通過目視檢查或可見光吸收光譜法便可實現(xiàn)快速、半定量檢測。

基于AuNPs的比色生物傳感器也可用于miRNA的敏感性檢測。Miao等[31]首次開發(fā)了一種基于正電荷AuNPs((+)AuNPs)析出的多功能、靈敏、無標(biāo)簽的miRNA-21檢測傳感器。利用miRNA-21作為引發(fā)劑誘發(fā)HCR，形成長的dsDNA聚合物，(+)AuNPs可以通過靜電吸附作用結(jié)合到dsDNA表面，導(dǎo)致自身吸收光譜的下降并逐漸開始析出，然后可以直接利用UV-vis光譜法檢測上清液中(+)AuNPs的濃度。該方法對miRNA的檢測范圍為2×10-11到1×10-8mol/L，檢測限為6.8×10-12mol/L。此外，該實驗還證明，在包含有鹽、DNA、蛋白質(zhì)和金屬離子的混合系統(tǒng)中，(+)AuNPs比(-)AuNPs更穩(wěn)定。這一證明不僅完善了該團隊提出的上述檢測方法，而且擴大了基于miRNA的傳感檢測范圍，開發(fā)了(+)AuNPs的新應(yīng)用。以miRNA作為靶標(biāo)引起檢測系統(tǒng)顏色變化的方法也可用于miRNA的定量檢測，該團隊將這一檢測策略用于MCF-7、Hela和MCF-10A等細(xì)胞中miRNA-21濃度的檢測。Li等[32]將用羧基修飾的磁珠(MNP)與兩個彼此互補的DNA(DNA1和DNA2)連接，在加入miRNA-203后，DNA2釋放并作為引發(fā)劑誘發(fā)已與AuNPs相連接的發(fā)夾探針H1和H2，并發(fā)生HCR，從而使得AuNPs彼此靠近并發(fā)生顏色的改變。隨著miRNA-203濃度的增加，該系統(tǒng)由淺酒紅色變?yōu)樽仙?，最后變?yōu)闇\藍(lán)色。該方法對靶miRNA的檢測限為1×10-13mol/L，有效提高了miRNA的檢測靈敏度。該團隊還利用MCF-7作為實際樣品進行了檢測，發(fā)現(xiàn)這種策略對MCF-7表現(xiàn)出較高的有效性與實用性。Cao等[33]首次開發(fā)了一種基于自組裝HCR的光聲(PA)納米探針，用于在乳腺腫瘤發(fā)生和化療期間高度靈敏地原位檢測miRNA-155，PA納米探針實現(xiàn)了對miR-155的體外高靈敏度和選擇性定量檢測，檢測限為2.5×10-10mol/L。

圖3 基于HCR與AuNPs的比色核酸檢測法示意圖Fig.3 Schematic of colorimetric nucleic acid detection based on HCR and gold nanoparticles

3.2.2 基于熒光策略的核酸檢測

AuNPs具有大的比表面積、易于表面功能化、在近紅外到紅外區(qū)域具有強的表面等離子吸收等特性，因而被作為熒光猝滅劑的一種[34]，其在長波長范圍內(nèi)具有高的熒光猝滅效率并且可以同時猝滅多個熒光基團。利用AuNPs的熒光猝滅特性檢測核酸的方法主要有兩種：一種是納米火焰法，即在AuNPs表面修飾一種能與靶標(biāo)分子特異性識別的寡核苷酸(識別鏈)，并與修飾有熒光基團的短鏈DNA(報告鏈)進行雜交，由于該短鏈DNA靠近AuNPs表面，熒光發(fā)生猝滅。在引入靶標(biāo)核酸分子后，該核酸分子與識別鏈互補配對形成長而穩(wěn)定的雙鏈DNA，釋放報告鏈并遠(yuǎn)離AuNPs，熒光恢復(fù)。通過熒光強度的變化能夠檢測靶標(biāo)分子。另一種方法是將能特異性識別靶標(biāo)分子且兩端分別連接巰基與熒光基團的分子信標(biāo)組裝到AuNPs表面，此時，由于靠近AuNPs，熒光猝滅。當(dāng)靶標(biāo)分子存在時，它與分子信標(biāo)雜交并打開其莖環(huán)結(jié)構(gòu)，熒光基團遠(yuǎn)離AuNPs，出現(xiàn)熒光。

2015年，Zhan等[35]根據(jù)AuNPs的熒光猝滅特性，構(gòu)建了一種基于HCR的熒光生物傳感器用來靈敏性檢測活體細(xì)胞mRNA。首先開發(fā)了一種新的靜電組裝的核酸納米結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)包括AuNPs核心、陽離子肽中間層以及分別被熒光受體基團和熒光供體基團標(biāo)記的發(fā)夾DNA探針H1和H2組裝的靜電外層。由于AuNPs的有效猝滅，這兩種熒光團產(chǎn)生非常弱的熒光信號。當(dāng)該組裝結(jié)構(gòu)進入到細(xì)胞后，細(xì)胞中的mRNA作為引發(fā)劑誘發(fā)HCR，產(chǎn)生長的雙鏈DNA，并從構(gòu)建的納米組件結(jié)構(gòu)上解離下來。同時，在dsDNA形成過程中，熒光受體與熒光供體之間的距離拉近，發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生熒光。該實驗對mRNA的檢測限達(dá)到5×10-13mol/L。這種基于納米組件的HCR方法比標(biāo)準(zhǔn)HCR更快，有效提高了檢測速度。且這種納米組件具有優(yōu)異的生物相容性，比三甲基化肽對AuNPs修飾的策略更加簡單和低毒。

3.2.3 基于電化學(xué)策略的核酸檢測

Wang等[36]提出了一種基于HCR和AuNPs擴增用于DNA檢測的新型高靈敏度電化學(xué)發(fā)光生物傳感器。該傳感器靈敏度高、選擇性與重復(fù)性好，而且能夠達(dá)到5×10-15mol/L的檢出限。2019年，Bao等[37]通過金納米粒子/聚吡咯還原氧化石墨烯(Au/PPy-rGO)，成功開發(fā)了一種靈敏、有效的電化學(xué)miRNA傳感平臺。該方法將催化發(fā)夾組裝(CHA)和HCR組合起來，實現(xiàn)了靶向再循環(huán)以及信號的雙重放大。同樣對于檢測miRNA，Zhang等[38]則將具有優(yōu)異催化性能的ZnO納米棒用做 Luminol-O2共反應(yīng)促進劑，構(gòu)建了一種用于超靈敏檢測癌細(xì)胞中miRNA-21的生物傳感器，該方法為以Luminol為中心的電化學(xué)發(fā)光(ECL)生物分析提供了一種有前景的策略。該傳感器1×10-16至1×10-10mol/L表現(xiàn)出良好的線性，且檢測限低至1.86×10-17mol/L。

3.2.4 基于成像策略的核酸檢測

2015年，Jiang團隊[36]開發(fā)了一種新型靜電納米組裝結(jié)構(gòu)，通過HCR進行活細(xì)胞中的信號放大。該團隊使用暗場共振光散射成像對Hela細(xì)胞中的mRNA進行超靈敏熒光激活成像，實現(xiàn)了接近每個細(xì)胞的單個分子的檢測限。2018年，Li等[39]設(shè)計了一種將AuNPs與HCR擴增相結(jié)合的檢測體系，通過使用暗視野顯微鏡來實現(xiàn)超靈敏核酸比色測定。由于HCR擴增后形成的長而穩(wěn)定的dsDNA無法吸附到AuNPs上，因此在鹽離子的誘導(dǎo)下，游離的AuNPs發(fā)生聚集。通過測量暗場圖像上黃色和紅色點的強度變化，可以準(zhǔn)確量化靶DNA的濃度，檢測限為6.6×10-14mol/L。這種比色方法所得的檢測限和線性范圍要優(yōu)于現(xiàn)有方法，而且不需要耗時對AuNPs進行修飾。

3.3 與氧化石墨烯(GO)的結(jié)合

氧化石墨烯(graphene oxide,GO)是1859年Brodie用強酸處理石墨后得到的一種石墨烯衍生物[40]，它含有羧基、羥基、環(huán)氧基等含氧基團，具有電學(xué)性能優(yōu)良、導(dǎo)熱性好、力學(xué)強度高、比表面積大等特點[41-43]。近年來，GO由于制備成本低、易合成、以及良好的水溶性和生物相容性而被廣泛用于DNA檢測、重金屬離子檢測等方面，以及食品分析、生物成像、生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域[43, 44]。其中，生物活性分子的檢測引起了研究者的極大興趣，特別是利用GO-DNA的熒光傳感器進行的各種分子檢測。

在大多數(shù)熒光生物傳感中，熒光共振能量轉(zhuǎn)移起著重要的作用。熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)是指當(dāng)一個熒光基團(供體)的發(fā)射光譜與另一個熒光基團(受體)的吸收光譜具有一定的重疊，且距離比較近時，就會產(chǎn)生熒光能量從供體向受體轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象。GO在FRET過程中表現(xiàn)出優(yōu)異的猝滅能力，所以當(dāng)標(biāo)記有熒光基團的單鏈DNA、dsDNA或發(fā)夾型DNA等吸附到GO基底時，由于熒光基團與GO距離較近，熒光被猝滅。當(dāng)存在有靶標(biāo)分子時，它能特異性識別探針，使得熒光基團遠(yuǎn)離GO表面，熒光恢復(fù)。

基于GO的熒光核酸檢測法不僅操作簡單，而且選擇合適的熒光分子還能有效降低背景信號[45]，這些熒光分子主要包括有機熒光染料和熒光納米粒子兩種。Zhang等[46]開發(fā)了一種基于銀納米團簇(AgNCs)與GO結(jié)合的通過HCR進行DNA檢測的熒光生物傳感器。如圖4所示，首先在能夠部分互補的發(fā)夾探針H1和H2的末端分別標(biāo)記上AgNCs，在沒有靶標(biāo)分子(TDNA)時，由于H1與H2的穩(wěn)定性，不能觸發(fā)HCR。此時，由于發(fā)夾探針的另一游離端能夠通過π-π堆積緊密吸附到GO表面，使得AgNCs靠近GO表面，熒光猝滅。但是在引入TDNA后，TDNA會與H1與H2發(fā)生HCR，產(chǎn)生多條長的dsDNA。這種dsDNA與GO的結(jié)合力比較弱，很容易從GO表面分離下來，進而能夠產(chǎn)生較強的熒光信號。Zhang等在該實驗方案中以人類免疫缺陷病病毒DNA(HIV-DNA)作為靶標(biāo)分子，而且對HIV-DNA的檢測限達(dá)到1.18×10-9mol/L，可用于臨床樣品。Yuan等[47]也利用GO的熒光猝滅特性設(shè)計了一種在同一個GO紙芯片上檢測兩種DNA(花生和大豆)并能有效區(qū)分其他DNA的方法，達(dá)到了1×10-9mol/L的檢測限。這一檢測方法不需要酶的參與，且紙芯片廉價、容易制備，有效縮短了檢測時間，降低了檢測成本。最近，Tang等[48]對HCR與GO結(jié)合的檢測方案進行改進，提出了金黃色葡萄球菌的無酶熒光檢測方法。該團隊提出，協(xié)同使用FAM熒光基團和熒光染料SYBR Green I從而大幅增強擴增熒光信號，且在最佳條件下，對16SrRNA有更低的檢測限，達(dá)5×10-11mol/L。該方法成功應(yīng)用于牛奶中的金黃色葡萄球菌的檢測，檢出限為4×102CFU/mL。

圖4 基于HCR與GO的用于核酸的熒光檢測示意圖Fig.4 Schematic of fluorescence detection of nucleic acids based on HCR and GO

GO與HCR結(jié)合的傳感平臺也可用于miRNA的檢測。例如，F(xiàn)an等[49]提出了一種基于GO的熒光生物傳感器，將其用于miRNA的檢測。在該實驗中，利用let-7a這一miRNA作為靶標(biāo)分子，發(fā)夾探針H1和H2的粘性末端帶有熒光基團，而且H1和H2通過π-π堆積連接到GO表面，熒光被GO有效猝滅。在加入let-7a、解旋酶RecQE和腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)后，RecQE在ATP的驅(qū)動下與發(fā)夾探針結(jié)合并解開發(fā)夾探針的雙鏈部分，使得let-7a可以快速觸發(fā)HCR從而形成雙鏈DNA產(chǎn)物，并使熒光顯著增強。這一檢測策略對miRNA的檢測限達(dá)到4.2×10-15mol/L，同時，這種解旋酶輔助的HCR/GO傳感平臺的靈敏度比沒有酶的普通HCR/GO傳感平臺高2個數(shù)量級，并有效縮短了檢測時間。

3.4 與其它金屬納米材料的結(jié)合

除了以上論述的幾種應(yīng)用比較廣泛的納米材料，還有一些其他的納米材料與HCR結(jié)合用來檢測核酸，本文主要論述銅納米材料、鉑納米材料以及磁性納米珠。近年來，銅納米材料受到研究人員的廣泛關(guān)注，特別是具有出色的光穩(wěn)定性和生物相容性的低毒素或無毒素的銅納米團簇(CuNCs)[50]。Liao等[51]通過將原位生成的銅納米團簇作為電化學(xué)發(fā)光體和二氧化鈦(TiO2)作為核心加速器，成功構(gòu)建了用于檢測乳腺癌潛在生物標(biāo)志物miRNA-21的超靈敏生物傳感器。實驗表明，這一生物傳感器在1×10-16到1×10-10mol/L濃度范圍內(nèi)具有明顯的線性關(guān)系，檢測限為1.905×10-17mol/L，而且已成功應(yīng)用于人宮頸癌與人乳腺癌細(xì)胞裂解液的檢測。

2019年，Guo等[52]提出了基于HCR和酶誘導(dǎo)金屬化的雙信號放大策略，構(gòu)建了用于miRNA-21的超靈敏電化學(xué)傳感器，這種雙重擴增策略將電化學(xué)信號增強了約120倍，并將其檢測限有效降低至1.2×10-16mol/L。該方法靈敏度高、特異性強、線性動態(tài)范圍寬，在疾病的早期診斷中具有很大的潛力。

Chen等[53]則首次提出使用DNA與鉑納米顆粒(PtNPs)之間的納米組裝進行比色法核酸檢測。在室溫下簡單地將含有Pt前體(K2PtCl4)和DNA的溶液與NaBH4溶液混合來制備DNA-Pt雜化納米顆粒，這種雜化納米顆粒幾乎沒有過氧化物酶樣活性。將TMB/H2O2比色底物溶液以及DNA-Pt雜化納米顆粒溶液加到紙基上，該雜化溶液幾乎無催化效率，因而會在紙的表面產(chǎn)生可見的藍(lán)色沉淀。將靶標(biāo)DNA與生物素修飾的捕獲探針(S1)進行雜交以形成帶有生物素粘性末端的探針(P1)，然后P1通過生物素-鏈霉親和素相互作用與磁珠進行結(jié)合。磁選后收集上清液并用于合成DNA-Pt雜化納米顆粒。當(dāng)存在靶DNA時，發(fā)夾探針H1和H2組裝在一起并且在磁分離后可以有效地去除，合成的DNA-Pt雜化納米顆粒通過上述紙基法表現(xiàn)出一定的顏色變化。Chen等提出的這種DNA與PtNPs的非共價自組裝過程不僅快速方便，而且能夠有效測出靶DNA的濃度值。

4 結(jié) 語

從以上論述可以看出，AuNPs、AgNPs、GO以及文中涉及的其它金屬納米材料等都具有一些優(yōu)良的生物性質(zhì)?；贖CR的生物傳感器是一種無需酶的參與、在常溫下就可進行反應(yīng)的簡單、快速、高靈敏、低成本的生物傳感器。將這種基于HCR的生物傳感器與以上幾種納米材料結(jié)合，已經(jīng)成功用于核酸、蛋白質(zhì)等生物分子以及金屬離子的高靈敏甚至超靈敏檢測。然而，對于一些非核酸類的物質(zhì)如蛋白質(zhì)、細(xì)胞等，有時需要設(shè)計合適的適配體才能進行檢測，因此未來可以開發(fā)一些能夠與HCR結(jié)合的新材料、篩選一些更有親和力的核酸適配體，用于蛋白質(zhì)、細(xì)胞等物質(zhì)的現(xiàn)場、快速、高靈敏性檢測。