朱文豪，王治方，張青嫻，許峰，方劍玉，徐引弟,李海利，王克領(lǐng)，焦文強(qiáng)

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，河南 鄭州 450002；2.河南省畜禽繁育與營養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002)

豬鏈球菌病是由豬鏈球菌引起的一類急性、熱性傳染性疾病，屬于國家規(guī)定的二類動(dòng)物傳染病，臨床上主要引起豬的敗血癥、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎等病癥，是世界范圍內(nèi)養(yǎng)豬業(yè)最常見的細(xì)菌性疾病之一[1]。

近年來，隨著我國養(yǎng)豬業(yè)集約化、規(guī)?；陌l(fā)展，豬鏈球菌病的發(fā)生呈現(xiàn)上升趨勢，同時(shí)，在發(fā)病過程中主要繼發(fā)豬繁殖與呼吸障礙綜合征、豬圓環(huán)病毒病、豬偽狂犬病等病，不單一發(fā)病，給豬場疾病診斷帶來困難，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失。豬鏈球菌血清型比較多，有29個(gè)血清型，其中豬鏈球菌2型是毒力最強(qiáng)、流行最廣的毒株。本試驗(yàn)通過對河南省豫東某規(guī)?；i場疑似豬鏈球菌病發(fā)病采集相關(guān)病料，通過實(shí)驗(yàn)室PCR診斷，鑒定為2型豬鏈球菌，為2型豬鏈球菌的診斷與治療提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 病料

2019年5月河南省豫東某規(guī)?；i場發(fā)生疾病，癥狀為育肥豬只呼吸困難、關(guān)節(jié)腫大，還有部分豬只出現(xiàn)神經(jīng)癥狀。剖檢采集病豬關(guān)節(jié)液、腦、肺臟、淋巴結(jié)和血液等病料。

1.2 主要試劑

購自美國Difco公司的胰蛋白大豆瓊脂(TSA)和胰蛋白大豆肉湯(TSB)；購自鄭州益康生物工程有限公司的新生牛血清；購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司的革蘭氏染液試劑盒；抗生素藥敏紙片和微生物微量生化鑒定管均購自杭州天和微生物試劑有限公司；DNA提取試劑盒以及PCR相關(guān)試劑均購自寶生物(大連)工程有限公司；相關(guān)引物以及測序?qū)嶒?yàn)均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

2 方法

2.1 病原分離純化

將無菌采集的肺臟、腦、血液和關(guān)節(jié)液等病料分別劃線接種于TSA平板(含5%的新生牛血清)，放置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24h，觀察菌落生長情況，挑選可疑菌落進(jìn)行分離純化、革蘭氏染色鏡檢。

2.2 PCR檢測、血清型鑒定

2.2.1引物設(shè)計(jì)

通過參照文獻(xiàn)[2-4]設(shè)計(jì)合成豬鏈球菌通用引物和33種血清型引物(見表1)，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)將分離純化的可疑菌株進(jìn)行鑒定和血清型分型鑒定。

表1 豬鏈球菌PCR分型引物序列及相關(guān)信息

續(xù)表1

2.2.2PCR鑒定

按照DNA提取試劑盒說明書提取菌體DNA：取上述TSB液體培養(yǎng)物1mL于1.5mL離心管中，10000r/min離心5min后，棄上清收集沉淀；將收集到的沉淀物作為可疑菌落的DNA模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。

PCR反應(yīng)體系(50μL)：2×Taq Master Mix 26μL,上下游引物各2μL，ddH2O 16μL，模板DNA 4 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃ 5min；95℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 30s，40個(gè)循環(huán)；72℃ 5min；4℃保存。

電泳：取10μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠電泳。陽性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，將測序結(jié)果進(jìn)行BLAST軟件比對。

2.3 藥物敏感性試驗(yàn)

參照其他文獻(xiàn)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，采用瓊脂擴(kuò)散法(K-B法)[5-7]。在無菌操作下，將分離純化后的TSA平板單個(gè)菌落挑選出來若干個(gè)，用0.9%滅菌生理鹽水制成濃度為0.5麥?zhǔn)蠁挝?比色儀比色)的菌懸液，取200μL菌懸液用滅菌棉拭子均勻涂抹于TSA平板(含5%的新生牛血清)上，涂抹制作4個(gè)平板。使用臨床常用的抗生素藥敏片，均勻貼在上述4個(gè)平板上，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，取出觀察，記錄藥敏片抑菌圈直徑，判斷標(biāo)準(zhǔn)參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(NCCLS)2005版。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)純化

在接種腦組織病料的TSA平板(含5%的新生牛血清)上，發(fā)現(xiàn)有表面光滑濕潤、圓形、邊緣整齊的半透明、略帶有藍(lán)色光澤的小菌落。挑取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，結(jié)果為革蘭氏陽性，視野內(nèi)可見菌體呈球形或卵圓形，單個(gè)、成對、短鏈或者長鏈狀存在(見圖1)。

圖1 豬鏈球菌菌體形態(tài)(1 000×)

3.2 菌株鑒定和血清型檢測

用豬鏈球菌通用引物對分離純化菌株進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果在500～750出現(xiàn)目的條帶689bp(圖2)，與標(biāo)準(zhǔn)條帶片段一致。

M.DL 2 000 DNA Marker；1.陽性對照；2.陰性對照；3.分離菌株。

用33對豬鏈球菌血清型引物對分離菌株進(jìn)行血清型分型鑒定，結(jié)果豬鏈球菌2型引物擴(kuò)增陽性，出現(xiàn)557bp的目的條帶(圖3、圖4)。測序結(jié)果與豬鏈球菌LSM102株(GenBank No.: CP016175.1)對比顯示99%同源，表明所分離菌株為血清型2型豬鏈球菌。

M.DL 2 000 DNA Marker；1.血清型1/2型；2～32.血清型1～31；33.血清型33型。

M.DL 2000 DNA Marker；1.陽性對照；2.陰性對照；3.分離菌株。

3.3 藥敏結(jié)果

采用常用5類18種抗生素對分離純化的該株鏈球菌菌株進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，結(jié)果見表2。藥敏結(jié)果顯示，該株鏈球菌對β內(nèi)酰胺類(頭孢他啶、頭孢噻呋、阿莫西林、青霉素、氨芐西林)、喹諾酮類(氧氟沙星、左氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星)和磺胺類(復(fù)方新諾明)敏感；對氨基糖苷類(卡那霉素、阿米卡星)、四環(huán)素類(強(qiáng)力霉素、四環(huán)素、土霉素)和大環(huán)內(nèi)酯類(阿奇霉素、替米考星)耐藥。

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 單位：mm

4 治療

通過藥敏試驗(yàn)結(jié)果，使用敏感性藥物進(jìn)行治療，用復(fù)方新諾明肌肉注射，同時(shí)用阿莫西林拌料飼喂，連用7d。該豬場疫情得到有效控制，發(fā)病豬只好轉(zhuǎn)，不再有健康豬只發(fā)病，豬場穩(wěn)定下來。

5 討論

眾所周知，豬鏈球菌病在養(yǎng)豬業(yè)存在很久，是豬病中最常見的細(xì)菌性疾病之一，在臨床上經(jīng)常單獨(dú)發(fā)生或者作為病毒病發(fā)病的繼發(fā)病癥發(fā)生，給養(yǎng)豬業(yè)造成不小的經(jīng)濟(jì)損失。豬鏈球菌血清型較多，其中血清型1型、2型、7型、9型公認(rèn)致病性較強(qiáng)[2,8]。豬鏈球菌病在臨床主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)炎型、敗血癥型、腦膜炎型三種，因此在治療上，可以根據(jù)不同的表現(xiàn)癥狀使用敏感性藥物對癥治療。

在本試驗(yàn)中是從腦組織病料中分離出一株豬鏈球菌，通過PCR血清型分型鑒定以及測序比對，證實(shí)得到的該菌株為2型豬鏈球菌菌株。再通過體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，該株2型豬鏈球菌對β內(nèi)酰胺類、喹諾酮類和磺胺類藥物敏感；而對氨基糖苷類、四環(huán)素類和大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥。這個(gè)結(jié)果與國內(nèi)的有關(guān)研究報(bào)道[9,10]有一定不同，這可能與不同地區(qū)獸醫(yī)工作人員用藥習(xí)慣不同有關(guān)。

同時(shí)，鏈球菌病是一種危害性很大的人畜共患病，在疾病防控上獸醫(yī)工作者不可掉以輕心。豬鏈球菌病的發(fā)生是一種對養(yǎng)豬業(yè)危害極大的傳染性疾病，該病近年來在國內(nèi)一直不斷發(fā)生，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。在養(yǎng)殖過程中豬場應(yīng)采取綜合防治措施，嚴(yán)格科學(xué)管理；搞好豬舍環(huán)境衛(wèi)生，確保豬場養(yǎng)殖安全；交替使用消毒藥品，防止耐藥性菌株的產(chǎn)生；嚴(yán)格無害化處理病死豬，以免帶菌、散菌現(xiàn)象發(fā)生，從而減少該病的發(fā)生與致死，促進(jìn)生豬養(yǎng)殖業(yè)健康、持續(xù)發(fā)展。