曹慧慧 王 磊 閆艷華 林 田 柯 濤 黃軍艷 程曉暉 劉勝毅

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所；農(nóng)業(yè)部油料作物生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室1，武漢 430062)(唐山市食品藥品綜合檢驗(yàn)檢測(cè)中心2，唐山 063000)(南陽(yáng)師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院3，南陽(yáng) 473061)

抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPS)是一類(lèi)對(duì)細(xì)菌、真菌等微生物有抑制或殺滅作用的天然小分子多肽，在自然界中分布廣泛，普遍存在于動(dòng)物、植物、微生物、昆蟲(chóng)和細(xì)菌中，是機(jī)體非特異性免疫的重要組成部分。抗菌肽因其抗菌機(jī)理獨(dú)特，具有高效、環(huán)保、抑制病原菌產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，在生物防治、養(yǎng)殖飼料、食品添加劑和醫(yī)學(xué)上具有良好的應(yīng)用，同時(shí)也是未來(lái)抗生素的理想替代品[1-3]。

植物源抗菌肽又稱(chēng)為植物防御素，是植物體內(nèi)合成的能夠防御外界微生物侵害的一類(lèi)小分子多肽，是植物防御系統(tǒng)的屏障。植物源抗菌肽的特點(diǎn)是其氨基酸序列中通常富含半胱氨酸，容易形成二硫鍵，因此植物抗菌肽也被稱(chēng)為半胱氨酸富集類(lèi)多肽。按照氨基酸序列及二級(jí)結(jié)構(gòu)，已發(fā)現(xiàn)的植物抗菌肽至少可以分為8個(gè)家族：植物防御素(Plant defensins)、脂轉(zhuǎn)移蛋白(Lipid Transfer Proteins，LTPs)、硫素(Thionins)、蛻皮素(Snakins)、橡膠蛋白類(lèi) (Hevein-like)、打結(jié)素類(lèi)(Knottin-likePeptides)、鳳仙花素(IbAMP)、MBP1等[4]，它們的分子質(zhì)量大小一般為2～9 ku，氨基酸序列中含有的半胱氨酸能夠形成2～6個(gè)二硫鍵起到穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)的功能。與動(dòng)物來(lái)源的抗菌肽相比，植物源抗菌肽由于其作用溫和、對(duì)動(dòng)植物細(xì)胞沒(méi)有毒性，易于在作物中表達(dá)和調(diào)控，不易被細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶降解等優(yōu)點(diǎn)，在各個(gè)領(lǐng)域中應(yīng)用更加廣泛，且由于植物源抗菌肽不會(huì)造成環(huán)境污染和藥物殘留等問(wèn)題，長(zhǎng)期使用也不會(huì)使病原菌產(chǎn)生耐藥性，具有開(kāi)發(fā)成為抗真菌生物制劑的潛力，可以作為抗生素和化學(xué)殺菌劑的最佳替代產(chǎn)品?？咕哪壳霸谥参锊『Ψ揽刂械膽?yīng)用，主要是利用基因工程手段將抗菌肽基因轉(zhuǎn)化植物中達(dá)到抗病的作用。植物源抗菌肽都具有廣譜抗真菌或細(xì)菌活性，在一種植物中發(fā)現(xiàn)的抗菌肽可以有效應(yīng)用到其他多種植物中。如將蘿卜中來(lái)源的抗菌肽Rs-AFPs通過(guò)轉(zhuǎn)基因的方法轉(zhuǎn)到馬鈴薯和小麥中分別達(dá)到抗馬鈴薯晚疫病和小麥鐮刀的效果[5-7]?？咕淖鳛樾屡d抗病基因資源，對(duì)改良水稻、大豆、棉花、油菜等作物對(duì)真菌病害的抗性有著重要意義。植物源抗菌肽具有相對(duì)于動(dòng)物源抗菌肽的諸多優(yōu)點(diǎn)，但是，目前植物來(lái)源的抗菌肽還很難真正應(yīng)用到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐中。主要原因是目前鑒定的有功能的植物來(lái)源抗菌肽數(shù)量很少，抗菌肽數(shù)據(jù)庫(kù)中經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的抗菌肽基因目前達(dá)到3 055個(gè)，而植物抗菌肽僅有345個(gè)[8]。因此高效地預(yù)測(cè)具有功能的新型植物抗菌肽，并實(shí)現(xiàn)其高水平表達(dá)成為獲得新型植物抗菌肽基因的主要技術(shù)難點(diǎn)，本研究充分利用生物信息學(xué)、分子生物學(xué)和微生物學(xué)等主要技術(shù)手段，利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)中油菜EST序列信息和本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)完成的甘藍(lán)型油菜親本種白菜和甘藍(lán)及甘藍(lán)型油菜全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)信息[9-11]，通過(guò)生物信息學(xué)分析手段，預(yù)測(cè)油菜中新的抗菌肽候選基因，獲得了一批與已知抗菌肽有類(lèi)似序列結(jié)構(gòu)的候選基因，從中篩選出感興趣的基因，利用特殊的表達(dá)純化標(biāo)簽體系進(jìn)行原核表達(dá)和體外抗菌活性檢測(cè)，獲得了一個(gè)新的對(duì)細(xì)菌、酵母和植物病原真菌核盤(pán)菌都具有明顯抑菌活性的轉(zhuǎn)脂蛋白抗菌肽基因BnCRP1，為高通量發(fā)掘和篩選植物抗菌肽基因提供了借鑒,為植物抗病遺傳改良提供新基因源。

1 材料和方法

1.1 材料

菌株：用于克隆和活性檢測(cè)的大腸桿菌(Escherichiacoli)XL-10-Gold ATCC2592、用于原核表達(dá)的大腸桿菌BL21(DE3)菌株均購(gòu)自Novagen公司；用于活性檢測(cè)的革蘭氏陽(yáng)性菌藤黃微球菌(MicrococoluteusACCC11001)，用于活性檢測(cè)的畢赤酵母(Pichiapastoris)GS1115、核盤(pán)菌(Sclerotiniasclerotiorum)為實(shí)驗(yàn)室所保存。載體pET30α-EDDIE-GFP[12]為本實(shí)驗(yàn)室所構(gòu)建、保存。

主要試劑：DNA聚合酶、DNA Marker、Tricine、Urea、DTT、IPTG；低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)Marker。質(zhì)粒抽提試劑盒、膠回收試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 抗菌肽基因的預(yù)測(cè)

本實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展了甘藍(lán)型油菜親本種白菜(Brassicarapa，AA, 2n=20)和甘藍(lán)(Brassicaoleracea，CC, 2n=18)以及甘藍(lán)型油菜(B.napus，AACC,2n=38)全基因組測(cè)序信息并建立了可供查詢(xún)的數(shù)據(jù)庫(kù)(http://brassicadb.org/brad，http://www.ocri-genomics.org/bolbase，http://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/BoulosChalhoub)[10,13,14]；此外，還進(jìn)行了油菜不同組織包括根、莖、葉、角果等的表達(dá)譜分析，獲得了大量的EST數(shù)據(jù)信息。根據(jù)油菜序列信息，與已有的抗菌肽數(shù)據(jù)庫(kù)(如ANTIMIC[15]、APD[8]、APPDB[16]和PhyAMP[17]等)收錄的抗菌肽序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，篩選出一些與已知抗菌肽具有類(lèi)似結(jié)構(gòu)的抗菌肽候選基因，并對(duì)這些篩選得到的候選抗菌肽基因進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和分類(lèi)，最終獲得潛在的新抗菌肽基因。

1.2.2 抗菌肽基因BnCRP1的合成和表達(dá)

pET30α-EDDIE-BnCRP1的構(gòu)建根據(jù)獲得的BnCRP1抗菌肽基因的DNA序列，利用DNA Works軟件[18]，對(duì)其進(jìn)行密碼子優(yōu)化(根據(jù)大腸桿菌密碼子進(jìn)化優(yōu)化)并設(shè)計(jì)引物，通過(guò)Overlap-PCR的方法合成目標(biāo)基因序列[19]。合成Overlap-PCR引物序列4條(表1)。載體線性化引物為Backbone-F:TGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCC和Backbone-R：GCAGCTGGTCACCCACAGCG。

根據(jù)Ke等[12]報(bào)道的方法，將BnCRP1基因連接到融合表達(dá)載體pET30α-EDDIE-GFP上。先將pET30α-EDDIE-GFP載體利用Backbone-F: TGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCC和Backbone-R：GCAGCTGGTCACCCACAGCG引物通過(guò)PCR擴(kuò)增進(jìn)行載體線性化，采用50 μL體系：10×Taq buffer(含MgCl2)5 μL，1.5 mmol/L dNTP(10 mmol/L)5 μL，5′引物(10 μmol/L)2 μL，3′引物(10 μmol/L)2 μL，Taq(5 U/μL)1 μL，DNA 模板5 μL，ddH2O 31 μL。反應(yīng)條件為94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 min，60 ℃ 30 s，72 ℃ 6 min，25個(gè)循環(huán)；72 ℃后延伸10 min。

表1 Overlap-PCR引物序列

注：下劃線的序列與載體PET30α-EDDIE-GFP同源，其余為目標(biāo)基因的特異性引物。

1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)大小正確后，電泳后切膠回收6 kb線性化載體片段。

采用Overlap-PCR技術(shù)獲得BnCRP1基因全長(zhǎng)。PCR反應(yīng)體系如下：總的反應(yīng)體系為50 μL，內(nèi)含：10×Taq buffer (含MgCl2)10 μL，1.5 mmol/L dNTP(10 mmol/L)4 μL，引物back bone F和backbone R各加入1 μL(濃度為10 mmol / L)，引物BnCRP_1、BnCRP_2、BnCRP_3和BnCRP_4各加入1 μL(濃度為2 mmol/L)，Taq(5 U/μL)1 μL，ddH2O 33 μL。反應(yīng)條件為94 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min，58 ℃1 min，72 ℃ 2 min 30 s，25個(gè)循環(huán)，72 ℃后延伸10 min，擴(kuò)增大小為102 bp。采用反向PCR技術(shù)，將BnCRP1基因連接到表達(dá)載體pET30a/His-EDDIE-GFP上。具體為利用30α backbone-F和30α backbone-R引物，通過(guò)反向PCR擴(kuò)增，將pET30a/His-EDDIE-GFP載體線性化。將回收到pET30a/His-EDDIE-GFP線性化載體片段與通過(guò)Overlap-PCR擴(kuò)增回收得到的BnCRP1全長(zhǎng)DNA片段，同時(shí)轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL10-Gold菌株，通過(guò)體內(nèi)定點(diǎn)同源重組，將BnCRP1基因連接到表達(dá)載體pET30a/His-EDDIE-GFP上，獲得目的基因融合表達(dá)載EDDIE-BnCRP1。

1.2.3 抗菌肽基因BnCRP1的體外誘導(dǎo)表達(dá)和分離純化

為解決抗菌肽異源表達(dá)的諸多問(wèn)題，本研究采用一種新的融合表達(dá)抗菌肽的方法，采用豬瘟病毒蛋白突變體EDDIE為融合蛋白，以包涵體形式在大腸桿菌BL21中高效表達(dá)抗菌肽，以減少抗菌肽對(duì)宿主的毒性作用。在包涵體蛋白純化、復(fù)性后，EDDIE重新正確折疊，恢復(fù)其自剪切能力，在特異位點(diǎn)Cys168和Cys169處把C端融合的抗菌肽剪切下來(lái)，從而獲得不增加任何多余氨基酸的抗菌肽產(chǎn)物。該方法不需要添加任何化學(xué)物質(zhì)和酶來(lái)去掉融合標(biāo)簽，對(duì)宿主無(wú)毒性，純化過(guò)程簡(jiǎn)單，剪切后可直接用來(lái)檢測(cè)對(duì)病原菌的抗菌活性，最高目標(biāo)產(chǎn)量可以達(dá)到12 g/L。

將測(cè)序正確的表達(dá)載體pET30α-EDDIE-BnCRP1質(zhì)粒，用熱激法轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，在加有卡那霉素的LB平板上劃線挑取單菌落，并接種于含有終濃度為50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩過(guò)夜，然后以100∶1的比例接種至LB液體培養(yǎng)基中，同樣條件下培養(yǎng)3 h至OD600=0.6左右時(shí)，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)6 h，用破菌緩沖液(20 mmol/L Tris-HCL，2 mmol/L EDTA, pH 8.0)冰浴條件超聲破碎5 min，4 ℃條件下5 000 r/min 離心15 min收集包涵體沉淀，將收集到的沉淀用緩沖液(1% TritonX-100，1 mol/L NaCL)清洗2次，再次收集菌體。以體積比10∶1的比例將包涵體溶于尿素變性緩沖液(8 mol/L Urea, 50 mmol/L Tris pH 7.5, 25 mmol/L DTT)中，室溫條件下振蕩2 h，4 ℃條件下2 000r/min離心20 min，取上清液，然后按照1∶50的比例快速稀釋到復(fù)性緩沖液(500 mmol/L NaCL, 20 mmol/L Tris，2 mmol/L EDTA，5% Glycerol , 0.2 mmol/L Arginine，10 mmol/L DTT，0.01% Tween-20，pH 8.5～9.5)中，室溫放置6 h復(fù)性。復(fù)性的過(guò)程即是EDDIE蛋白發(fā)生自剪切的過(guò)程，利用Tricine-SDS-PAGE 電泳檢測(cè)剪切結(jié)果，并利用NanoDrop-2000測(cè)定復(fù)性后抗菌肽的蛋白濃度。

1.2.4 抗菌肽BnCRP1的體外活性測(cè)定

抗菌肽BnCRP1對(duì)細(xì)菌抑菌活性的測(cè)定分別以藤黃微球菌為革蘭氏陽(yáng)性菌代表，大腸桿菌為革蘭氏陰性菌代表，用牛津杯法[20]在每個(gè)牛津杯中加入濃度為3 mg/mL的人工表達(dá)純化的抗菌肽溶液200 μL，并以相同濃度的委托生物公司化學(xué)合成抗菌肽作為對(duì)照，37 ℃環(huán)境下(酵母培養(yǎng)溫度為22～25 ℃)培養(yǎng)12～16 h(酵母培養(yǎng)時(shí)間為48 h)，通過(guò)測(cè)定抑菌圈的大小來(lái)確定抗菌肽的活性，共進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)，每次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3個(gè)技術(shù)重復(fù)。

抗菌肽BnCRP1對(duì)植物病原菌核盤(pán)菌的抑菌活性的鑒定方法：1)菌核與菌絲塊的處理：選擇完好的核盤(pán)菌菌核，用10 mL左右的75%酒精浸泡1 min，然后在10 mL 0.1%的HgCl2中浸泡消毒8～10 min，隨后用無(wú)菌水沖洗3～5次，把滅菌菌核切掉兩端，中間部分切成綠豆大小的顆粒，接種于PDA平板上，切面朝下放置。通常每粒菌核接種1板，1次接種8～9板。當(dāng)菌絲即將鋪滿(mǎn)平板時(shí)，用直徑為2 mm的打孔器沿菌絲外緣打孔，取菌絲塊，用于再次接種；2)菌絲培養(yǎng)：將用打孔器去除的菌絲塊置于新的PDA平板的正中間位置，使含有菌絲的一面接觸PDA平面，放置于22 ℃條件下靜置培養(yǎng)3～4 d；3)抑菌活性的檢測(cè)：PDA平板上培養(yǎng)好的菌絲用打孔器取最外圈生長(zhǎng)良好的菌絲塊置于新的PDA平板上，在菌絲塊的上下左右的位置各放置1個(gè)牛津杯，分別加入人工合成純化的抗菌肽和化學(xué)合成的抗菌肽，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，觀察抑菌情況。細(xì)菌抑菌率的計(jì)算可通過(guò)直接測(cè)量抑菌圈的大小來(lái)完成，真菌抑菌率的計(jì)算方法按照：抑菌率=[空白對(duì)照菌絲半徑(a)-抗菌肽作用后菌絲半徑(b)]/空白對(duì)照菌絲半徑(a)×100%，菌絲半徑的計(jì)量單位為cm。

為了檢測(cè)抗菌肽BnCRP1作為生防制劑用于植物對(duì)真菌性病害的抗性潛力，通過(guò)在植物葉片表面進(jìn)行噴施一定濃度的人工純化抗菌肽溶液，然后在噴施過(guò)抗菌肽的植物葉片上接種病原真菌，36 h后測(cè)定病斑的大小，同一條件下未噴施的植物葉片作為對(duì)照。具體實(shí)驗(yàn)方法是：選取生長(zhǎng)5周左右的擬南芥葉片，在葉片表面均勻涂抹一層濃度為5 ng/μL人工表達(dá)純化后的抗菌肽BnCRP1，同時(shí)在PDA平板上培養(yǎng)核盤(pán)菌，當(dāng)菌絲即將鋪滿(mǎn)整個(gè)平板時(shí)，用直徑為1 mm的打孔器沿菌絲邊緣打孔，取菌絲塊，用于擬南芥的接種。用注射器針頭將打孔器取出的菌絲塊置于擬南芥的葉片正中央的位置，使含有菌絲的一面接觸葉片表面，同時(shí)在未涂抹抗菌肽的擬南芥葉片上按照同樣的方法進(jìn)行接種核盤(pán)菌菌絲塊作為對(duì)照，22 ℃條件下，濕度保持在90%培養(yǎng)36 h后觀察感病情況，并測(cè)量各個(gè)葉片上的病斑的大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗菌肽基因的預(yù)測(cè)和序列結(jié)構(gòu)分析

與已知的抗菌肽數(shù)據(jù)庫(kù)中抗菌肽進(jìn)行氨基酸序列的同源性比對(duì)，從基因組水平上高通量篩選出一批與已知抗菌肽有類(lèi)似序列結(jié)構(gòu)特征的候選抗菌肽基因。將BnCRP1的氨基酸序列與已知的抗菌肽數(shù)據(jù)庫(kù)中的抗菌肽進(jìn)行同源序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，與APD數(shù)據(jù)庫(kù)中編號(hào)為AP01582來(lái)源于黃星桑天牛(Psacotheahilaris)中的一類(lèi)3D結(jié)構(gòu)為Bridge類(lèi)隸屬于Knottin～Type打結(jié)素類(lèi)抗菌肽的相似性最高，相似度達(dá)到36.36%，這種由黃星桑天牛中分離到的bridge類(lèi)抗菌肽具有較強(qiáng)的抗革蘭氏陽(yáng)性菌、抗革蘭氏陰性菌和抗真菌活性[21]。

通過(guò)蛋白結(jié)構(gòu)分析網(wǎng)站，對(duì)BnCRP1的蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)抗菌肽BnCRP1主要表現(xiàn)為螺旋結(jié)構(gòu)，其序列組成中的9個(gè)半胱氨酸能夠形成4對(duì)二硫鍵，起到穩(wěn)定抗菌肽結(jié)構(gòu)的作用。蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示BnCRP1的二級(jí)結(jié)構(gòu)中由50%的α螺旋和50%的無(wú)規(guī)卷曲組成。這種蛋白結(jié)構(gòu)決定了它所發(fā)生的抗細(xì)菌和抗真菌的作用模式為通過(guò)破壞細(xì)胞膜的機(jī)制來(lái)達(dá)到抑菌的作用[22]。蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的結(jié)果也支持該結(jié)果，從N端形成一個(gè)大的α螺旋，其余部分形成無(wú)規(guī)卷曲的結(jié)構(gòu)(圖1)。

圖1 抗菌肽BnCRP1的二級(jí)結(jié)構(gòu)

2.2 抗菌肽基因BnCRP1的合成和原核表達(dá)載體的構(gòu)建

Overlap-PCR合成目標(biāo)基因，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后檢測(cè)，條帶大小為102 bp，符合預(yù)期(圖2)，以構(gòu)建的BnCRP1原核表達(dá)載體pET30α-EDDIE-BnCRP1為模板，用基因特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，重組子的條帶大小與合成目標(biāo)基因條帶大小一致，通過(guò)測(cè)序證明本研究構(gòu)建的pET30α-EDDIE-BnCRP1正確。

注：M為2 000 bp DNA ladder；1為表達(dá)載體重組子；2為陰性對(duì)照；3～6為BnCRP1人工合成基因。圖2 Overlap PCR合成BnCRP1基因的瓊脂糖凝膠電泳

2.3 抗菌肽BnCRP1的體外誘導(dǎo)表達(dá)和分離純化

按照1.2.3所描述的方法，重組蛋白pET30α-EDDIE-BnCRP1誘導(dǎo)表達(dá)后，將上清液和沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果如圖3a所示，泳道1～6在21 ku處有一條表達(dá)量明顯增大的條帶(圖3a中箭頭所示)，且大小符合EDDIE-BnCRP1融合蛋白的預(yù)期，說(shuō)明EDDIE-BnCRP1融合蛋白主要存在于沉淀中，并且是以包涵體的形式進(jìn)行表達(dá)。融合蛋白包涵體復(fù)性后，通過(guò)Tricine-SDS-PAGE電泳檢測(cè)融合蛋白EDDIE-BnCRP1的自剪切效果，結(jié)果如圖3b中所示，泳道1和2在3.6 ku處有一條抗菌肽BnCRP1的目的條帶，說(shuō)明EDDIE在復(fù)性后能夠?qū)⒖咕腂nCRP1目的蛋白進(jìn)行高效自剪切。

注：0為EDDIE-BnCRP1上清；1～6為EDDIE-BnCRP1沉淀；7～8為復(fù)性后6 h的融合蛋白EDDIE-BnCRP1; M為小分子量蛋白標(biāo)記。圖3 表達(dá)蛋白EDDIE-BnCRP1(a)和EDDIE-BnCRP1復(fù)性后(b)的SDS-PAGE圖

2.4 抗菌肽BnCRP1的抗菌活性測(cè)定

分別以大腸桿菌為革蘭氏陰性菌代表，藤黃八疊球菌為革蘭氏陽(yáng)性菌代表，酵母菌為真菌代表，以復(fù)性液作為對(duì)照，對(duì)復(fù)性后的BnCRP1進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。結(jié)果如圖4所示，同時(shí)檢測(cè)了抗菌肽BnCRP1對(duì)植物病原菌核盤(pán)菌的抑菌活性。結(jié)果顯示，人工合純化抗菌肽BnCRP1和化學(xué)合成抗菌肽BnCRP1具有明顯的抑菌效果。而以復(fù)性液為對(duì)照的牛津杯周?chē)⑽闯霈F(xiàn)明顯的抑菌圈，經(jīng)過(guò)3次生物學(xué)重復(fù)測(cè)量得到抗菌肽BnCRP1對(duì)大腸桿菌、藤黃八疊球菌和酵母菌的平均抑菌直徑分別為1.53、1.11和1.67，對(duì)核盤(pán)菌的抑菌率達(dá)到了70%。

注：0為復(fù)性緩沖液；1為體外表達(dá)純化抗菌肽BnCRP1; 2為化學(xué)合成抗菌肽。圖4 抗菌肽BnCRP1 抗細(xì)菌和真菌活性檢測(cè)

2.5 抗菌肽BnCRP1在植物抗病中的應(yīng)用

為了研究抗菌肽BnCRP1作為生防制劑在植物真菌性病害防治中的作用，通過(guò)在擬南芥葉片涂抹或噴施抗菌肽BnCRP1并接種核盤(pán)菌的方法，檢驗(yàn)抗菌肽對(duì)植物真菌性病害的抗病潛力，結(jié)果如圖5所示，涂抹抗菌肽的擬南芥葉片與未涂抹抗菌肽的擬南芥葉片相比，接種核盤(pán)菌36 h后的病斑面積顯著減小。這說(shuō)明在植物葉片噴施抗菌肽BnCRP1有顯著抑制核盤(pán)菌侵染擴(kuò)散的作用，有效提高了植物對(duì)植物病原真菌核盤(pán)菌的抗性。

注：a為表面涂抹抗菌肽BnCRP1的擬南芥葉片；b為表面未涂抹抗菌肽BnCRP1的擬南芥葉片。圖5 擬南芥離體葉片接種核盤(pán)菌抗病鑒定

3 討論

植物病原真菌是植物的重要病原菌，可引起80%以上的植物病害，造成世界糧食作物減產(chǎn)約20%。許多重要植物病害都是真菌造成的，如馬鈴薯晚疫病、稻瘟病、小麥白粉病、玉米大小斑病菌、大豆灰斑病、油菜菌核病等，每年都造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。另外，真菌在侵染植物的過(guò)程中，釋放出來(lái)的代謝產(chǎn)物—真菌毒素(mycotoxin)，對(duì)農(nóng)作物以及人類(lèi)的健康也造成極大的危害，如黃曲霉毒素(aflatoxin)等。核盤(pán)菌(Sclerotiniasclerotiorum)屬于子囊菌亞門(mén)、盤(pán)菌綱、柔膜菌目、核盤(pán)菌科、核盤(pán)菌屬。是一種危害作物和蔬菜的世界性的重要的植物病原菌。核盤(pán)菌可以廣泛地侵染很多單子葉和雙子葉植物。核盤(pán)菌引起的菌核病是一種類(lèi)似于灰霉的腐生營(yíng)養(yǎng)型真菌，這種破壞性病源侵染超過(guò)400種植物，分布廣泛。油菜是世界上重要的油料作物之一，菌核病造成油菜的根、莖和角果的腐爛，導(dǎo)致了巨大的產(chǎn)量損失。盡管菌核病嚴(yán)重威脅了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，植物對(duì)核盤(pán)菌的寄主抗性的分子機(jī)制依然不清楚。迄今為止還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)完全免疫或者高抗的油菜栽培品種，因此，探究植物對(duì)這種病源的抗性機(jī)制，發(fā)現(xiàn)新的抗性基因具有深遠(yuǎn)意義。

目前常用的植物病害防治措施，主要依靠化學(xué)農(nóng)藥，然而化學(xué)防治不僅成本高、污染環(huán)境，而且防效也不理想，食品的安全性也受到嚴(yán)重影響。隨著社會(huì)的進(jìn)步，人們?cè)絹?lái)越深刻地認(rèn)識(shí)到長(zhǎng)期大量使用化學(xué)農(nóng)藥對(duì)生態(tài)環(huán)境和人類(lèi)健康的危害。生物防治可以有效地克服這些弊端，因而生物農(nóng)藥越來(lái)越受到人們的重視?？咕?antimicrobial peptides，AMPs)因其高效、環(huán)保、不使病原菌產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)使其在生物防治和醫(yī)學(xué)上具有良好的應(yīng)用前景。

對(duì)抗菌肽的研究雖然取得了較大的進(jìn)展，但抗菌肽在大規(guī)模的生產(chǎn)應(yīng)用中還存在很多問(wèn)題：一是抗菌肽的來(lái)源及提純問(wèn)題，天然的抗菌肽資源有限，而且天然抗菌肽含量很低，提取純化難度較大，化學(xué)合成成本昂貴，這些現(xiàn)有的困難不利于抗菌肽的大規(guī)模應(yīng)用，另外通過(guò)基因工程方法獲得抗菌肽容易被蛋白酶消解；二是活性問(wèn)題，抗菌肽氨基酸序列短，其活性與其空間結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，通過(guò)化學(xué)合成或者基因工程獲得的抗菌肽空間結(jié)構(gòu)上無(wú)法與天然抗菌肽保持一致，因此無(wú)法保證與天然抗菌肽具有一樣的活性?？咕难芯棵媾R的挑戰(zhàn)一方面要不斷提高和改善抗菌肽的抗菌活性和穩(wěn)定性，另一方面由于抗菌肽具有先天免疫調(diào)節(jié)作用，可以增加其先天防御調(diào)節(jié)中的應(yīng)用，隨著對(duì)抗菌肽作用機(jī)理及轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷深入研究與應(yīng)用，光譜、高效、低毒的抗菌肽將在農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)藥領(lǐng)域發(fā)揮更加重要的作用，為人類(lèi)創(chuàng)造更大的價(jià)值。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)生物信息學(xué)手段，利用已有的油菜全基因組測(cè)序信息和抗菌肽數(shù)據(jù)庫(kù)信息，獲得抗菌肽新基因BnCRP1,并實(shí)現(xiàn)了BnCRP1在大腸桿菌中的融合表達(dá)、復(fù)性、自剪切和純化，獲得了具有生物活性的BnCRP1蛋白產(chǎn)物。本研究為利用生物信息手段和基因工程技術(shù)大規(guī)模鑒定新植物來(lái)源抗菌肽奠定了基礎(chǔ)，提供了一種新的途徑。BnCRP1可作為生物試劑噴施于植物表面提高植物對(duì)真菌病害的抗性，同時(shí)，還可以作為一個(gè)新分子標(biāo)記用于輔助抗病育種，還可以作為一個(gè)新基因用于植物基因工程，以培育抗病轉(zhuǎn)基因植物。