靳曉飛，張彐寧，周曉紅，高維娟

(河北中醫(yī)學(xué)院，河北省心腦血管病中醫(yī)藥防治研究重點實驗室，石家莊 050091)

腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemiareperfusion injury，CIRI)歸屬于中醫(yī)“中風”范疇，“氣虛血瘀、經(jīng)脈不通”是其主要病機，使用補氣活血藥可達到良好的治療效果[1]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究顯示，腦缺血再灌注損傷的發(fā)生機制至今仍未完全闡明，而再灌注期間大量炎癥因子的釋放，引發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)，被認為是腦缺血后再灌注引起損傷的重要機制之一[2-3]。中藥黃芪是臨床常用補氣要藥，被譽為補氣藥中的“耆長”。大量文獻記載和臨床研究證實，黃芪不僅具有補氣的作用，還兼具活血化瘀、通經(jīng)活絡(luò)之功，在防治腦缺血再灌注損傷方面效果顯著[4-5]。黃芪甲苷(astragaloside IV，AST)是黃芪的重要活性單體成分，是黃芪補氣行血、通經(jīng)活絡(luò)的物質(zhì)基礎(chǔ)，常作為檢測黃芪質(zhì)量優(yōu)劣的參考指標。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷可有效減輕腦缺血再灌注損傷，發(fā)揮神經(jīng)保護作用[6]，但是其具體作用機制以及對腦組織超微結(jié)構(gòu)的影響，尚不明確。本研究重點探討黃芪甲苷對腦缺血再灌注大鼠炎癥因子及超微結(jié)構(gòu)的影響，為黃芪甲苷拮抗腦缺血再灌注損傷提供新的研究依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SD大鼠(雄性，健康清潔級，40只，體重260～280 g，鼠齡7～8周)，購買于北京維通利華實驗動物公司[SCXK(京)2016-0011]，飼養(yǎng)在河北中醫(yī)學(xué)院實驗動物中心[SYXK(冀)2017-005]。飼養(yǎng)環(huán)境:溫度為22℃～25℃，相對濕度為50%～60%，進食自由。動物實驗通過河北中醫(yī)學(xué)院動物倫理委員會批準(DWLL2018032)。實驗嚴格遵循3R原則。

1.2 主要試劑與儀器

黃芪甲苷購買于上海士峰生物科技公司，規(guī)格∶每瓶20 mg，純度≥98%，生產(chǎn)批號∶15082136；尼莫地平注射液、TTC染液、磷酸鹽緩沖溶液(PBS)、戊巴比妥鈉、大鼠模型制作線栓(型號∶2838A3)、甲苯胺藍水溶液均購買于北京索萊寶生物公司；其他試劑均是國產(chǎn)分析純。

腦切片模具(型號∶BS-300C)購置于北京西濃科技公司；組織包埋機(型號∶EG11508)、全自動切片機(型號∶RM2255)、倒置光學(xué)顯微鏡(型號∶DMI3000B)均購置于Leica公司；透射電子顯微鏡(型號∶H-7650)購置于HITACHI公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組、給藥和模型建立

應(yīng)用隨機單位組設(shè)計分組法，將40只SD雄性大鼠隨機分為4組∶假手術(shù)組(Sham)、模型組(腦缺血再灌注損傷組，Model)、黃芪甲苷組(AST)和尼莫地平組(陽性藥物組，NIM)。采用大腦中動脈閉塞(MCAO)法建立大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型[7]:大鼠適應(yīng)飼養(yǎng)1周，手術(shù)前4 h禁止給水、12 h禁止喂食；用2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，將大鼠固定在小動物手術(shù)臺上，小心備皮，酒精棉球消毒；從大鼠頸部正中切開一小口，逐層分離組織，找到左側(cè)頸總動脈、頸外動脈、頸內(nèi)動脈，將頸外動脈結(jié)扎、阻斷，選用特定線栓通過頸外動脈殘端插入，后經(jīng)頸內(nèi)動脈抵達大鼠大腦中動脈，實現(xiàn)大腦中動脈缺血閉塞；線栓阻塞大腦中動脈(缺血)2 h后拔出，再灌注24 h；選取造模成功大鼠，處死，取材，檢測相關(guān)指標。其中，黃芪甲苷組(給藥濃度為20 mg/kg)、尼莫地平組(給藥濃度為10 mg/kg)于造模前一周腹腔注射給藥，每24 h追加給藥一次；假手術(shù)組僅分離暴露頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈，不做線栓插入處理；假手術(shù)組和模型組均給予等量生理鹽水腹腔注射處理。需說明的是，動物造模有死亡現(xiàn)象，本研究僅將造模成功的大鼠列為實驗對象，造模成功率在80%以上。

1.3.2 Zea Longa評分法檢測大鼠神經(jīng)功能

評分標準∶0分，沒有任何神經(jīng)功能缺損，大鼠正常；1分，對側(cè)前爪不能伸展完全；2分，向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈行走；3分，向?qū)?cè)行走傾倒；4分，意識不清，不能站立行走。每組大鼠于再灌注24 h后立即做Zea Longa評分，得1、2或3分者視為造模成功。

1.3.3 TTC染色檢測腦梗死體積

大鼠做完神經(jīng)功能評分后，用2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，斷頭取腦。將完好的腦組織放在-20℃冰箱，速凍15 min，應(yīng)用腦切片模具對大腦行冠狀位切片(2 mm)。將腦切片置于2% TTC染液，放在切片盒，37℃避光反應(yīng)30 min。其間，每隔10 min用鑷子翻動腦切片，保證染色均勻。隨后，吸取TTC染液，4%多聚甲醛固定腦切片1 h，拍照。正常腦組織呈現(xiàn)紅色，腦梗死組織呈現(xiàn)白色。用Image Pro Plus 6.0軟件對拍照結(jié)果進行分析，計算腦梗死體積。

1.3.4 ELISA法檢測TNF-α、IL-6、IL-1β含量

各組取同質(zhì)量(100 mg)缺血區(qū)腦皮質(zhì)組織，生理鹽水清洗3遍，濾紙吸干組織表面水分，天平稱重，用預(yù)冷生理鹽水將組織制成組織勻漿(腦組織g∶生理鹽水mL＝1∶9)，低溫高速離心10 min，取上清液。參照ELISA試劑盒說明書步驟操作，酶標儀檢測各孔樣本OD值，利用標準品濃度和OD值制作標準曲線，參照標準曲線，依據(jù)樣本OD值，計算TNF-α、IL-6、IL-1β的相應(yīng)含量。

1.3.5 尼氏染色觀察神經(jīng)細胞形態(tài)學(xué)變化

制缺血區(qū)腦皮質(zhì)石蠟切片，二甲苯常規(guī)脫蠟，100%、95%、90%、80%、70%、50%梯度酒精脫水，1%甲苯胺藍溶液染色，置于60℃恒溫箱反應(yīng)40 min，蒸餾水沖洗3次(每次3 min)，95%酒精分色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片，倒置顯微鏡400倍鏡下觀察、拍照。正常神經(jīng)元中尼氏體數(shù)量豐富；當神經(jīng)元受損時，尼氏體可減少、解體或消失。

1.3.6 透射電鏡觀察神經(jīng)細胞超微結(jié)構(gòu)變化

制作缺血區(qū)腦皮質(zhì)1 mm3組織塊，PBS浸洗組織3遍，4%戊二醛固定組織2 h，PBS浸洗組織3遍，1%鋨酸固定組織2 h，50%、70%、80%、90%、100%梯度丙酮脫水，純包埋劑處理，37℃、60℃恒溫箱聚合，超薄切片機切片(厚度50 nm左右)，醋酸鈾、酸鉛雙染，透射電子顯微鏡觀察細胞超微結(jié)構(gòu)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗結(jié)果用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計，數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標準差(±s)表示，各組數(shù)據(jù)之間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃芪甲苷對大鼠神經(jīng)功能評分的影響

假手術(shù)組大鼠神經(jīng)功能評分為0，無神經(jīng)功能缺損癥狀；與假手術(shù)組相比，模型組神經(jīng)功能評分明顯升高(P＜0.05)，大鼠出現(xiàn)對側(cè)前爪不能伸展完全、向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈行走、向?qū)?cè)行走傾倒等不同程度的神經(jīng)功能缺損癥狀；與模型組相比，黃芪甲苷組和尼莫地平組神經(jīng)功能評分有所降低(P＜0.05)，神經(jīng)功能缺損有所改善，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(見表1)。

表1 黃芪甲苷對大鼠神經(jīng)功能評分的影響(±s)Table 1 Effects of astragaloside IV on nerve function score in rats

表1 黃芪甲苷對大鼠神經(jīng)功能評分的影響(±s)Table 1 Effects of astragaloside IV on nerve function score in rats

注:與假手術(shù)組相比，*P＜0.05；與模型組相比，＃P＜0.05。Note.Compared with the sham group，*P＜0.05.Compared with the model group，＃P＜0.05.

組別Groups劑量(mg/kg)Doses評分Scores假手術(shù)組Sham — 0模型組Model — 2.50±0.55*黃芪甲苷組AST 20 1.67±0.82＃尼莫地平組NIM 10 1.83±0.75＃

2.2 黃芪甲苷對大鼠腦梗死體積的影響

假手術(shù)組未見腦梗死病灶；與假手術(shù)組相比，模型組腦梗死體積明顯增加(P＜0.05)；與模型組相比，黃芪甲苷組和尼莫地平組腦梗死體積均減少(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(見圖1)。

注:A:假手術(shù)組；B:模型組；C:黃芪甲苷組；D:尼莫地平組。與假手術(shù)組相比，*P＜0.05；與模型組相比，＃P＜0.05。圖1 黃芪甲苷對大鼠腦梗死體積的影響Note.A，Sham group.B，Model group.C，AST group.D，NIM group.Compared with the sham group，*P＜0.05.Compared with the model group，＃P＜0.05.Figure 1 Effects of astragaloside IV on the volume of cerebral infarction in rats

2.3 黃芪甲苷對炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β含量的影響

與假手術(shù)組相比，模型組炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β含量均升高(P＜0.05)，提示炎性損傷顯著；與模型組相比，黃芪甲苷組和尼莫地平組TNFα、IL-6、IL-1β含量均下降(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(見表2)。

表2 黃芪甲苷對TNF-α、IL-6、IL-1β含量的影響(±s，pg/mL)Table 2 Effects of astragaloside IV on the contents of TNF-α、IL-6 and IL-1β

表2 黃芪甲苷對TNF-α、IL-6、IL-1β含量的影響(±s，pg/mL)Table 2 Effects of astragaloside IV on the contents of TNF-α、IL-6 and IL-1β

注:與假手術(shù)組相比，*P＜0.05；與模型組相比，＃P＜0.05。Note.Compared with the sham group，*P＜0.05.Compared with the model group，＃P＜0.05.

組別Groups 劑量(mg/kg)Doses TNF-α IL-6 IL-1β假手術(shù)組Sham — 30.46±4.78 12.62±2.88 6.11±0.89模型組Model — 45.09±6.34* 23.42±4.01* 10.60±1.73*黃芪甲苷組AST 20 36.47±6.02＃ 16.47±3.86＃ 7.25±1.44＃尼莫地平組NIM 10 33.92±5.57＃ 14.94±3.28＃ 6.84±1.06＃

2.4 黃芪甲苷對神經(jīng)細胞形態(tài)學(xué)變化的影響

假手術(shù)組神經(jīng)細胞和尼氏體數(shù)量豐富，細胞規(guī)整、排列整齊，未見壞死細胞；與假手術(shù)組相比，模型組神經(jīng)細胞出現(xiàn)變形，細胞排列混亂，尼氏體數(shù)量明顯減少(P＜0.05)；與模型組相比，黃芪甲苷組和尼莫地平組細胞狀態(tài)得到改善，尼氏體數(shù)量增多(P＜0.05)，細胞排列較為整齊，細胞形狀趨于規(guī)整(見圖2)。

2.5 黃芪甲苷對神經(jīng)細胞超微結(jié)構(gòu)變化的影響

假手術(shù)組神經(jīng)細胞超微結(jié)構(gòu)清晰正常，細胞膜完好，細胞核規(guī)整，染色質(zhì)分布均勻；與假手術(shù)組相比，模型組細胞核變形，核出現(xiàn)固縮，染色質(zhì)分布不均勻，少量細胞可見細胞膜破損、線粒體腫脹且數(shù)量減少、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張等細胞壞死表現(xiàn)；與模型組相比，黃芪甲苷組和尼莫地平組細胞超微結(jié)構(gòu)較為清晰，細胞核較為規(guī)整，核固縮減輕，染色質(zhì)分布較為均勻，線粒體腫脹減輕且數(shù)量增多，壞死細胞減少(見圖3)。

3 討論

腦血管疾病(cerebrovascular disease，CVD)與腫瘤、心臟病已并列成為導(dǎo)致人類死亡的三大疾病，嚴重影響著人類生活和健康，危害巨大[8]。腦血管疾病根據(jù)其病因可分為出血性腦血管病和缺血性腦血管病兩大類，其中缺血性腦血管病更為多見，其發(fā)病率和死亡率不斷攀升，危害巨大。腦缺血再灌注損傷是缺血性腦血管病治療和恢復(fù)過程中的一個重要病理過程，目前仍然是阻礙缺血性腦血管病臨床治療效果的一大難題。腦缺血再灌注損傷的產(chǎn)生機制涉及多方面因素，炎癥反應(yīng)在其中扮演著重要角色[2，9]。研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注可產(chǎn)生大量氧自由基，繼而激活炎性細胞，釋放大量炎癥因子，包括腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)和白細胞介素-1β(IL-1β)等，其中TNF-α是大多數(shù)炎癥因子的啟動因子，TNF-α、IL-6的產(chǎn)生可激活星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞分泌IL-1β，促使NOS生成增加，引發(fā)炎癥反應(yīng)。與此同時，大量炎癥因子的釋放可導(dǎo)致更多的炎性細胞集聚和浸潤，形成一種相互作用、相互增強的炎癥級聯(lián)反應(yīng)，引起惡性循環(huán)，最終造成再灌注損傷[10]。

注:A:假手術(shù)組；B:模型組；C:黃芪甲苷組；D:尼莫地平組。與假手術(shù)組相比，*P＜0.05；與模型組相比，＃P＜0.05。圖2 黃芪甲苷對神經(jīng)細胞形態(tài)學(xué)變化的影響(尼氏染色)Note.A，Sham group.B，Model group.C，AST group.D，NIM group.Compared with the sham group，*P＜0.05.Compared with the model group，＃P＜0.05.Figure 2 Effects of astragaloside IV on the morphological changes of nerve cells(Nissl staining)

注:A:假手術(shù)組；B:模型組；C:黃芪甲苷組；D:尼莫地平組。圖3 黃芪甲苷對神經(jīng)細胞超微結(jié)構(gòu)變化的影響Note.A，Sham group.B，Model group.C，AST group.D，NIM group.Figure 3 Effects of astragaloside IV on the ultrastructural changes of nerve cells

黃芪是一味臨床常用補氣要藥，收錄在《中華人民共和國藥典》，素有“補氣藥之耆長”、“補氣升陽之要藥”、“瘡家圣藥”等美譽[11]。大量醫(yī)籍記載，黃芪補氣兼活血，具有良好的活血化瘀的作用?！睹t(yī)別錄》首載其能“逐五臟間惡血”，《藥類法象》指出黃芪善冶“血脈不行”，《本草綱目》言其“生血活血”；《金匱要略》中黃芪桂枝五物湯以黃芪為君藥，治療血痹、中風后遺癥，取得良好效果；《醫(yī)林改錯》中補陽還五湯重用黃芪，意在補益元氣，使氣盛則血行，瘀去而絡(luò)脈通暢，廣泛用于治療缺血性中風及腦缺血后遺癥[4，12]。黃芪的主要化學(xué)成分包括黃芪皂苷類、黃芪黃酮類和黃芪多糖類，其中黃芪甲苷是黃芪皂苷類的活性單體成分，被認為是黃芪補氣、活血、通絡(luò)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[13-14]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷具有抗炎、抗衰老、抗凋亡、抗氧化、調(diào)節(jié)能量代謝、調(diào)控自噬等生物活性[15-17]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷可有效降低腦缺血再灌注大鼠腦梗死體積，改善神經(jīng)功能障礙，抑制缺血再灌注損傷，發(fā)揮腦保護作用，但是其具體作用機制以及對神經(jīng)細胞超微結(jié)構(gòu)的影響，尚不明確，亟待探究。

本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，以SD大鼠為實驗對象，通過MCAO法建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型，在動物水平，從炎癥反應(yīng)角度，探討黃芪甲苷對腦缺血再灌注大鼠炎癥因子及超微結(jié)構(gòu)的影響。實驗結(jié)果顯示，腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀明顯，腦梗死體積明顯增加，神經(jīng)細胞超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯病變，細胞核變形、固縮，染色質(zhì)分布不均勻，炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β含量均上升；當分別給予黃芪甲苷和尼莫地平處理后，大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀減輕，腦梗死體積減少，神經(jīng)細胞超微結(jié)構(gòu)得到改善，炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β含量均下降，表明黃芪甲苷減輕大鼠腦缺血再灌注損傷、改善神經(jīng)細胞超微結(jié)構(gòu)，與抑制炎癥反應(yīng)、降低炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β的表達密切相關(guān)。該研究結(jié)果為黃芪甲苷抑制腦缺血再灌注損傷的抗炎作用機制提供了一定理論依據(jù)。然而，黃芪甲苷發(fā)揮抗炎作用的具體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路如何?其抗炎作用與黃芪甲苷其他生物活性是否存在相互聯(lián)系?尚需進一步探究，這也將是我們課題組下一步研究的重點。