何明靜，黃世杰，孫祥琳，韋 俊，周 茜，陳力嘉

(1.攀枝花學(xué)院醫(yī)學(xué)院解剖教研室，四川 攀枝花 617000；2.攀枝花學(xué)院康養(yǎng)學(xué)院，四川 攀枝花 617000)

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(coronary atherosclerotic cardiopathy)簡(jiǎn)稱冠心病，其常見(jiàn)癥狀是心肌缺血(myocardial ischemia)，極易造成死亡，威脅人類生命安全[1]。嚴(yán)重的缺血會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞死亡機(jī)制的激活，如壞死、細(xì)胞凋亡和自噬[2]。自噬和細(xì)胞凋亡在調(diào)節(jié)心血管疾病中起重要作用[3]。自噬與細(xì)胞凋亡的關(guān)系十分復(fù)雜，自噬的激活既可以抑制也可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡[4-5]。熊果酸是一種五環(huán)三萜類化合物，已有大量文獻(xiàn)報(bào)道其有抗腫瘤[6-8]、降血糖血脂[9]、抗菌[10]以及抗氧化[11-12]的功效。已有報(bào)道稱，熊果酸對(duì)缺血再灌注損傷的H9c2細(xì)胞具有保護(hù)作用[13]。在癌癥領(lǐng)域中，國(guó)內(nèi)外均有研究表明熊果酸促進(jìn)癌細(xì)胞的自噬以達(dá)到抗癌作用[14-17]。然而，熊果酸對(duì)心肌缺血后自噬的作用未見(jiàn)報(bào)道，故本研究采用血清剝奪的方法模擬心肌缺血，構(gòu)建心肌缺血體外模型，以自噬的角度探討熊果酸對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

大鼠H9c2心肌細(xì)胞購(gòu)自普諾賽生命科技有限公司(武漢，中國(guó))。

1.2 主要試劑

DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自HyClone公司(美國(guó))；青鏈霉素雙抗、PBS緩沖液購(gòu)自Gibco公司(美國(guó))；熊果酸(U6753)、3-甲基腺嘌呤(3-MA)(M9281)、雷帕霉素(R0395)購(gòu)自Sigma-Aldrich公司(美國(guó))；Annexin V-APC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒(ECK-A217)購(gòu)自伊萊瑞特生物科技股份有限公司(武漢，中國(guó))；ECL試劑盒購(gòu)自索萊寶科技有限公司(北京，中國(guó))；RIPA裂解液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司(上海，中國(guó))；蛋白質(zhì)定量(Bicinchoninic Acid，BCA)試劑盒購(gòu)自Thermo Fisher公司(美國(guó))；LC3兔多克隆抗體(ab48394)、Beclin1兔多克隆抗體(ab62557)、ATG5兔單克隆抗體(ab108327)、BcL-2兔多克隆抗體(ab59348)、Bax兔單克隆抗體(ab32503)、cleaved-caspase3兔多克隆抗體(ab49822)、β-actin兔多克隆抗體(ab5694)以及山羊抗兔IgG H＆L(HRP)二抗(ab205718)均購(gòu)自Abcam公司(英國(guó))。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

大鼠H9c2心肌細(xì)胞用DMEM/F12培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，并補(bǔ)充10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL的鏈霉素，培養(yǎng)箱條件為37℃，5% CO2。每2 d換液1次，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)傳代。分組情況如下:(a)對(duì)照組:繼續(xù)采用含10%胎牛血清、雙抗的培養(yǎng)基培養(yǎng)。(b)剝奪血清組:根據(jù)參考文獻(xiàn)[18]，用無(wú)血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。(c)熊果酸組:為了確定熊果酸的適合濃度，在含10%胎牛血清、雙抗的培養(yǎng)基的條件下，使用0、5、10、20、40μmol/L熊果酸預(yù)處理細(xì)胞，篩選出合適濃度后，再用含合適濃度熊果酸的無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。(d)熊果酸+3-MA處理組:根據(jù)參考文獻(xiàn)[19]使用10μmol/L 3-MA預(yù)處理細(xì)胞2 h，再用含合適濃度熊果酸的無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基處理細(xì)胞24 h。(e)熊果酸和雷帕霉素處理組:根據(jù)參考文獻(xiàn)[20]，使用100μmol/L雷帕霉素預(yù)處理細(xì)胞2 h，再用含合適濃度熊果酸的無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基處理細(xì)胞24 h。

1.3.2 蛋白免疫印跡分析

用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌細(xì)胞，用裂解液裂解30 min，在4℃以11 000 r/min離心10 min。隨后，參照說(shuō)明書使用BCA測(cè)定法測(cè)量蛋白質(zhì)濃度。通過(guò)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)樣品。隨后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在室溫下用5%脫脂乳封閉膜1 h，并用LC3、Belin、ATG5、BcL-2、Bax、cleaved-caspase3、β-actin一抗孵育，4℃過(guò)夜，再用山羊抗兔IgG H＆L(HRP)二抗在室溫下孵育1 h，洗膜后經(jīng)ECL試劑盒顯影，使條帶可視化，再使用Image-ProPlus 6.0軟件對(duì)條帶進(jìn)行定量分析。

1.3.3 Annexin V-APC/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

H9c2細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌后，用胰酶消化并離心，PBS重懸細(xì)胞，取1×105細(xì)胞重懸細(xì)胞，離心后棄上清，再用PBS洗滌細(xì)胞1次，離心棄上清后加入500 μL的1×Annexin V Binding Buffer重懸細(xì)胞。隨后分別加入5μL Annexin V-APC和5μL PI，4℃避光孵育15 min。反應(yīng)完成后，用1 mL PBS洗滌1次，使用FACSCaliburTM流式細(xì)胞儀(BD Biosciences，美國(guó))檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，統(tǒng)計(jì)采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度熊果酸處理對(duì)H9c2細(xì)胞的影響

實(shí)驗(yàn)采用0、5、10、20、40μmol/L熊果酸處理正常培養(yǎng)的H9c2細(xì)胞，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。與空白對(duì)照組相比，20、40μmol/L熊果酸處理組細(xì)胞凋亡率上升(P＜0.001)，10μmol/L處理組與空白對(duì)照組凋亡率差異不顯著，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用10μmol/L熊果酸處理H9c2細(xì)胞。

2.2 熊果酸減輕血清剝奪H9c2細(xì)胞造成的自噬

為研究熊果酸是否能影響H9c2細(xì)胞血清剝奪介導(dǎo)的自噬，用10μmol/L熊果酸預(yù)處理H9c2細(xì)胞1 h，再在血清剝奪的情況下培養(yǎng)24 h，然后檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)，結(jié)果如圖2。與對(duì)照組相比，血清剝奪自噬相關(guān)蛋白ATG5、Beclin1表達(dá)量極顯著上升(P＜0.001)，LC3II/I的比值顯著上升(P＜0.01)。而熊果酸處理組有效的降低了ATG5、Beclin1的表達(dá)(P＜0.001)以 及LC3II/I的 比值(P＜0.05)。

2.3 熊果酸通過(guò)抑制自噬減輕了血清剝奪誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡

注:與0μmol/L組相比，***P＜0.001。圖1 不同濃度熊果酸對(duì)H9c2細(xì)胞凋亡率的影響Note.Compared with 0μmol/L group，***P＜0.001.Figure 1 Effects of different concentrations of ursolic acid on the apoptosis rate of H9c2 cells

為了探討H9c2細(xì)胞血清剝奪后自噬與凋亡的關(guān)系，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)熊果酸處理血清剝奪的H9c2細(xì)胞的凋亡情況，并分別運(yùn)用自噬的抑制劑3-MA和自噬的激活劑雷帕霉素聯(lián)合熊果酸處理血清剝奪的H9c2細(xì)胞，觀察細(xì)胞凋亡的變化，結(jié)果如圖3所示。與對(duì)照組相比，血清剝奪組凋亡率極顯著上升(P＜0.001)，熊果酸處理組降低了凋亡率(P＜0.01)，熊果酸聯(lián)合3-MA組進(jìn)一步降低了凋亡率(P＜0.001)，而雷帕霉素的處理消除了熊果酸的抗凋亡作用。

注:A:ATG5、Beclin1、LC3I、LC3II的蛋白免疫印跡圖；B:ATG5的相對(duì)表達(dá)量；C:Beclin1的相對(duì)表達(dá)量；D:LC3 II/I的比值，***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05，下同。圖2 熊果酸處理后，H9c2細(xì)胞ATG5、Beclin1表達(dá)水平以及LC3II/I比值變化Note.A，Western blot assay of ATG5，Beclin1，LC3I，LC3II andβ-actin.B，Relative expression of ATG5.C，Relative expression of ATG5.D，Ratio of LC3II/I，***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05，the same as bellow.Figure 2 Changes of ATG5，Beclin1 expression levels and LC3II/I ratio in H9c2 cells after ursolic acid treatment

圖3 熊果酸對(duì)H9c2細(xì)胞血清剝奪后的抗凋亡作用以及自噬被抑制或增強(qiáng)后熊果酸抗凋亡作用的變化Figure 3 Anti-apoptotic effect of ursolic acid on serum deprivation of H9c2 cells，and changes of the anti-apoptotic effect of ursolic acid after autophagy is inhibited or enhanced

2.4 熊果酸通過(guò)增加BcL-2的表達(dá)，降低Bax、cleaved-caspase3的表達(dá)起抗凋亡作用

為了進(jìn)一步探討熊果酸抑制自噬后的抗凋亡機(jī)制，運(yùn)用蛋白免疫印跡試驗(yàn)(Western blot)檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白BcL-2、Bax、cleaved-caspase3的表達(dá)，結(jié)果如圖4所示。與對(duì)照組相比，剝奪血清組BcL-2表達(dá)量極顯著下降(P＜0.001)，cleaved-caspase3、Bax表達(dá)量以及Bax/BcL-2比值顯著上升(P＜0.001)；熊果酸處理使BcL-2表達(dá)量回升(P＜0.01)，cleaved-caspase3、Bax表達(dá)量以及Bax/BcL-2比值下降(P＜0.01)；熊果酸聯(lián)合3-MA進(jìn)一步使BcL-2表達(dá)量回升(P＜0.001)，使cleaved-caspase3表達(dá)量以及Bax/BcL-2比值下降(P＜0.001)；雷帕霉素干預(yù)后Bax/BcL-2的比值回升(P＜0.05)(圖4C～4F)。

3 討論

伴隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人們生活方式的改變以及老齡化人口的增加，冠心病發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[21]。冠心病容易引起心肌缺血，造成心肌能量代謝紊亂，可能造成心絞痛、心肌梗死、缺血性心肌病甚至猝死，嚴(yán)重威脅人類生命健康[22]。早期研究發(fā)現(xiàn)，心肌缺血會(huì)導(dǎo)致自噬[23]。本研究采用血清剝奪來(lái)模擬體外心肌缺血，該方法已被報(bào)道用于心肌缺血的機(jī)制研究[18，24-25]。在本研究中，再次證實(shí)了剝奪血清來(lái)模擬心肌缺血會(huì)造成H9c2細(xì)胞自噬程度增加。

越來(lái)越多的報(bào)道表明，干預(yù)自噬可以保護(hù)心肌缺血造成的損傷。一直以來(lái)，自噬對(duì)心肌缺血起保護(hù)作用還是損害作用存在爭(zhēng)議，自噬對(duì)心肌缺血的作用尚未完全闡明[26]。Kanamori等[27]運(yùn)用巴弗洛霉素A1抑制自噬，發(fā)現(xiàn)抑制自噬后增加了動(dòng)物模型心肌梗死面積，表明自噬是一種先天性和有效的過(guò)程，可以保護(hù)心肌細(xì)胞免于急性心肌梗死時(shí)的缺血性死亡。Li等[28]人發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀能夠激活A(yù)MPK/mTOR途徑誘導(dǎo)自噬并抑制細(xì)胞凋亡，從而改善了缺血心肌面積和功能。然而，在嚴(yán)重缺血的情況下，心臟的過(guò)度自噬可能促進(jìn)心肌細(xì)胞死亡并使心臟功能惡化[29]。Zhang等[30]提出，在心肌缺血或梗塞過(guò)程中，缺氧誘導(dǎo)的損傷通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和過(guò)度自噬過(guò)程成為心臟損傷的主要因素之一。Liu等[31]發(fā)現(xiàn)，外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)的miR-93-5p通過(guò)靶向ATG7抑制自噬和炎性因子的表達(dá)，在急性心肌梗塞的動(dòng)物模型和體外模型中對(duì)心肌細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。Jia等[2]指出，黃連素(小檗堿)可以抑制過(guò)度自噬，從而使缺氧的大鼠H9c2細(xì)胞存活。Pattingre等[32]早前提出，自噬是體內(nèi)平衡的必要條件，是對(duì)營(yíng)養(yǎng)缺乏和其他形式細(xì)胞應(yīng)激的適應(yīng)性反應(yīng)。然而，如果自噬水平被誘導(dǎo)超過(guò)生理范圍，自噬可能導(dǎo)致死亡執(zhí)行。

注:A:BcL-2、Bax、cleaved-caspase3蛋白免疫印跡條帶圖；B:BcL-2相對(duì)表達(dá)量；C:Bax相對(duì)表達(dá)量；D:BcL-2/Bax比值；E:cleaved-caspase3相對(duì)表達(dá)量。圖4 熊果酸處理對(duì)H9c2細(xì)胞血清剝奪后的凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)變化Note.A，Western blot assay of BcL-2，Bax and cleaved-caspase3.B，Relative expression of BcL-2.C，Relative expression of Bax.D，Ratio of Bax/BcL-2.E，Relative expression of cleaved-caspase3.Figure 4 Expressions of apoptosis-related proteins after serum deprivation of H9c2 cells by ursolic acid treatment

熊果酸是廣泛存在于各種天然植物中的五環(huán)三萜類化合物，已經(jīng)被證明具有抗腫瘤、降血糖血脂、抗感染、抗氧化等作用[6-12]。近幾年，已有研究表明熊果酸對(duì)心肌缺血以及心肌缺血再灌注造成的損傷具有保護(hù)作用。王佳等[33]發(fā)現(xiàn)熊果酸能抑制氧化應(yīng)激損傷和脂代謝紊亂，從而改善心肌免受心肌梗死損傷。趙瑞芳[34]則指出熊果酸同樣能改善心肌缺血再灌注造成的心肌損傷，其機(jī)制也與抑制氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。在熊果酸影響細(xì)胞自噬方面，大多集中在癌癥研究領(lǐng)域。盧文等[14]通過(guò)實(shí)驗(yàn)表明，熊果酸通過(guò)增強(qiáng)自噬抑制了宮頸癌細(xì)胞的增殖。羅敏等[15]則發(fā)現(xiàn)熊果酸處理人肺癌PC9細(xì)胞后，自噬相關(guān)蛋白ATG5表達(dá)升高，LC3II/I比值升高，說(shuō)明熊果酸增加了PC9細(xì)胞的自噬，并抑制了PC9細(xì)胞的增殖。然而，關(guān)于熊果酸在保護(hù)心肌細(xì)胞缺血損傷時(shí)，是否通過(guò)自噬產(chǎn)生作用還未見(jiàn)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，加入熊果酸后，自噬相關(guān)蛋白ATG5、Beclin1表達(dá)量降低，LC3II/I比值也降低，表明自噬被抑制。接下來(lái)檢測(cè)了H9c2細(xì)胞的凋亡情況，發(fā)現(xiàn)加入熊果酸后，H9c2細(xì)胞凋亡率降低，再次證明熊果酸對(duì)缺血心肌細(xì)胞有保護(hù)作用，且推測(cè)熊果酸對(duì)H9c2細(xì)胞的抗凋亡作用可能與自噬被抑制有關(guān)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證熊果酸對(duì)H9c2細(xì)胞的抗凋亡作用與自噬相關(guān)，本研究選用了自噬抑制劑3-MA和自噬激動(dòng)劑雷帕霉素分別聯(lián)合熊果酸處理H9c2細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)熊果酸聯(lián)用3-MA進(jìn)一步降低細(xì)胞凋亡率，而熊果酸聯(lián)用雷帕霉素使凋亡細(xì)胞增多，推測(cè)血清剝奪會(huì)造成H9c2細(xì)胞自噬，且超出其生理水平，引發(fā)細(xì)胞凋亡，熊果酸可以抑制這種過(guò)度自噬，保護(hù)H9c2細(xì)胞。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證熊果酸通過(guò)抑制自噬對(duì)H9c2細(xì)胞的抗凋亡機(jī)制，本研究檢測(cè)了BcL-2、Bax以及cleaved-caspase3的蛋白表達(dá)量。BcL-2家族是線粒體凋亡途徑的有效調(diào)節(jié)蛋白家族，該家族包括了抗凋亡蛋白BcL-2和促凋亡蛋白Bax。Bax和BcL-2的比例已被用作代表凋亡效應(yīng)的標(biāo)志[35]。Caspase3是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的caspase蛋白家族的成員之一，caspase3被剪切為cleaved-caspase3后激活并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[36]。本研究發(fā)現(xiàn)，與血清剝奪組相比，熊果酸處理和熊果酸聯(lián)用3-MA組Bax/BcL-2比值和cleaved-caspase3表達(dá)明顯降低。這表明熊果酸通過(guò)增加抗凋亡蛋白BcL-2和降低促凋亡蛋白Bax、cleaved-caspase3表達(dá)發(fā)揮抗凋亡作用，自噬進(jìn)一步被抑制后，抗凋亡作用進(jìn)一步增強(qiáng)。而用雷帕霉素激活自噬后，熊果酸的抗凋亡作用被削減。

Pattingre等[32]認(rèn)為BcL-2能與Beclin1結(jié)合從而抑制Beclin1介導(dǎo)的自噬，Beclin1和BcL-2家族蛋白的相對(duì)含量決定了從細(xì)胞存活到細(xì)胞死亡的轉(zhuǎn)變。Xu等[37]發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)BcL-2或敲低Beclin1表達(dá)可以限制自噬的過(guò)度激活，并在營(yíng)養(yǎng)剝奪脅迫下防止細(xì)胞凋亡。故本研究推測(cè)熊果酸的抑制自噬和抗凋亡作用可能與改變BcL-2和Beclin1的相對(duì)含量有關(guān)。

綜上，本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)探究了熊果酸在心肌缺血過(guò)程中凋亡與自噬的保護(hù)作用及其機(jī)制，并證實(shí)熊果酸對(duì)剝奪血清的心肌細(xì)胞的抗凋亡作用與抑制其過(guò)度自噬有關(guān)，后續(xù)還需要體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。