鄭明霞，譚俊龍，劉湘寧，2，張永彪，王曉剛

細胞作為絕大多數(shù)生物體的基本單位，擁有一套復雜而精細的生命操作系統(tǒng)，既具有普遍的統(tǒng)一性，也具有獨特的異質(zhì)性。對于多細胞生物體如人體而言，從單個受精卵到構(gòu)成機體各個組織器官和系統(tǒng)的數(shù)億個細胞的胚胎發(fā)育機制以及機體從正常生理情況發(fā)展到疾病狀態(tài)經(jīng)歷了什么樣的細胞變化歷程等問題，受到了研究人員的普遍關注。但由于技術障礙，先前的研究僅基于常規(guī)大體測序(bulk sequencing)，使得對細胞的研究處于群體細胞測序水平。自2009年湯富酬團隊首次報道單細胞mRNA測序(single cell mRNA sequencing，sc-mRNA-Seq)以來[1]，對單細胞的研究迅速進入火熱階段。近年來，各種單細胞測序技術不斷涌現(xiàn)，分析工具日益完善，單細胞的神秘面紗逐漸被揭開，生命科學研究得到了迅猛發(fā)展。

1 單細胞測序

1.1 單細胞測序的技術流程

單細胞測序(single-cell sequencing，SCS)的流程包括：(1)單細胞分離：用于分離多個細胞以進行后續(xù)分析。目前單細胞分離技術主要包括熒光激活細胞分選(fluorescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS)[2]、顯微操作(micromanipulation)以及微流體技術(microfluidics)[3-4]。微流體技術根據(jù)基本原理又可細分為閥門(valves)、液滴(droplets)、納米孔(nanowells)三種技術。其中，閥門技術易于操控；液滴技術以高吞吐量著稱；納米孔技術勝在操作上的簡便[5]。(2)測序：包括先擴增序列再測序的第二代測序(second generation sequencing，SGS)即下一代測序(next generation sequencing，NGS)和直接測序的第三代測序(third generation sequencing，TGS)即單分子測序(single-molecule sequencing)[6-7]。第二代測序擴增序列的目的是增加用于檢測的序列樣本總量。全基因組擴增(whole-genome amplification，WGA)的方法包括多重退火和基于環(huán)路的擴增循環(huán)(multiple annealing and looping-based amplification cycles，MALBAC)[8]、基于等溫反應的多重置換擴增(multiple displacement amplification，MDA)和基于熱循環(huán)的簡并寡核苷酸引物聚合酶鏈式反應(degenerate oligonucleotide primed-polymerase chain reaction，DOP-PCR)[9-14]。其中，MDA的單核苷酸變異體檢出率更高而MALBAC和DOP-PCR在測量拷貝數(shù)變異方面較佳[15-16]。全轉(zhuǎn)錄組擴增(whole-transcriptome amplification，WTA)的方法主要有基于PCR的方法(PCR-based amplification methods)如多重(multiplexing)擴增方法和基于體外轉(zhuǎn)錄的全轉(zhuǎn)錄組方法(invitrotranscription based WTA-methods)如使用條形碼的多重線性擴增(multiplexed linear amplification)[17-19]。單分子測序可以消除擴增偏差，但單分子測序存在錯誤率高、吞吐量低及測序效率低等不足[20]。(3)數(shù)據(jù)分析：用于移除干擾信息如接頭序列(adapter)、連接序列(linker)和標簽序列(barcodes)等，對剩余的序列信息進行分析。常見的分析流程是通過基礎流程Cell Ranger將原始數(shù)據(jù)(raw base call，BCL)拆分為FASTQ文件[21-22]，并生成基因表達矩陣。在下游分析中，細胞聚類常利用Seurat軟件[23]；偽時間(pseudotime)分析則多采用monocle軟件[24]。在細胞聚類中，可以通過主成分分析(principal component analysis，PCA)進行線性降維[25]，再使用tSNE執(zhí)行非線性降維[26]，將結(jié)果可視化。隨后尋找每個聚類中顯著表達的基因以鑒定高度變化基因。

1.2 單細胞測序的內(nèi)容

如圖1所示，單細胞測序涉及基因組、表觀組(包括DNA甲基化、染色體可及性和染色質(zhì)拓撲學等)、轉(zhuǎn)錄組以及空間組等內(nèi)容。

1.2.1 單細胞基因組測序 人類生物學和醫(yī)學的中心問題是關于人類細胞譜系樹(human cell lineage tree)的問題，即其在發(fā)育、生長、更新、衰老以及疾病過程中的結(jié)構(gòu)、 動力學和變異性如何的問

圖1 單細胞測序

題。由于細胞分裂期間DNA的非絕對精確復制，細胞便被賦予了獨特的基因組特征[27]。單細胞基因組測序既可檢測單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)或單核苷酸變異(single nucleotide variations，SNVs)，也可檢測拷貝數(shù)變異(copy number variations，CNVs)或拷貝數(shù)畸變(copy number aberrations，CNAs)以及堿基的插入和缺失(insertions and deletions，Indels)等[28]，成為剖析腫瘤、神經(jīng)生物學以及發(fā)育過程中基因組異質(zhì)性的有力工具[29]。如Wang等[30]將單細胞全基因組測序(single-cell whole genome sequencing，scWGS)用于描繪精子減數(shù)分裂重組活動的綜合景觀，揭示了精子的基因組多樣性對個體基因組編輯的影響；Navin等[31]利用單核測序(single-nucleus sequencing，SNS)對乳腺癌進行腫瘤群體結(jié)構(gòu)和進化研究，發(fā)現(xiàn)單克隆擴增是原發(fā)性腫瘤的形成模式，推翻了腫瘤進展的漸進模型。

1.2.2 單細胞外顯子組測序 外顯子組雖然只構(gòu)成基因組的一小部分，卻有絕大多數(shù)的致病性變異發(fā)生在該區(qū)域[32]，加上單細胞全外顯子組測序(single-cell whole-exome sequencing，scWES)可以降低全基因組擴增(whole genome amplification，WGA)引起的基因座間偏差和提高堿基覆蓋率[33]，因此常用于編碼序列的SNVs分析。如Hou等利用scWES進行SNVs分析，揭示了原發(fā)性血小板增多癥和腎透明細胞癌的腫瘤內(nèi)部遺傳結(jié)構(gòu)，為進一步探索腫瘤的克隆進化奠定了基礎[34-35]。

1.2.3 單細胞表觀組測序 性狀的改變除了受DNA序列改變的控制外，還受遺傳物質(zhì)修飾如DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA調(diào)節(jié)等過程的影響。即遺傳物質(zhì)修飾也可以記載遺傳信息，用于解釋基因型與表型兩者的關系[36]。單細胞表觀組研究涉及的內(nèi)容見圖1。

一般來講，基因組DNA甲基化抑制基因的表達；而非甲基化促進基因的表達。單細胞DNA甲基化測序主要用于檢測基因組DNA中的胞嘧啶特別是CpG二聯(lián)核苷酸位點是否被甲基化修飾[37]，可用于胚胎發(fā)育學研究，如通過對生殖細胞系進行分析可以了解印記基因在胚胎和胎盤組織轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的關鍵作用[38]，有助于理解無性生殖失敗的原因。新近的單細胞DNA甲基化測序方法有單細胞亞硫酸氫鹽測序(single-cell bisulfite sequencing，scBS-seq)[39-40]、單核甲基胞嘧啶測序(single-nucleus methylcytosine sequencing，snmC-seq)以及單細胞組合索引甲基化分析(single-cell combinatorial indexing for methylation analysis，sci-MET)等[41-42]。

不同狀態(tài)下的細胞擁有不同的順式作用元件活性位點如啟動子、絕緣子和基因座控制區(qū)等，這些位點具有轉(zhuǎn)錄因子可及性，是染色體調(diào)控的基礎。染色質(zhì)對DNase I高度敏感的活性區(qū)域稱為DNase I高敏位點(DNase I Hypersensitive Sites，DHS)，DNase I 高敏性常用作染色體可及性的測量指標。哺乳動物細胞的DHS定位，能夠提供轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件和染色質(zhì)狀態(tài)的重要信息，有助于研究順式作用元件可及性差異的轉(zhuǎn)錄因子驅(qū)動機制。如Denny等[43]通過比較原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移灶腫瘤細胞的全基因組染色質(zhì)可及性特征，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子Nfib可通過廣泛提高染色質(zhì)可及性來促進小細胞肺癌的轉(zhuǎn)移。單細胞DHS分析的主要研究方法包括單細胞轉(zhuǎn)座酶可及染色質(zhì)測序(single-cell assay for transposase accessible chromatin using sequencing，scATAC-seq)[44]、單細胞DNA酶測序(single-cell DNase sequencing，scDNase-seq)和低輸入 DNA酶I測序(low-input DNase I sequencing，liDNase-seq)等[45-46]。

染色質(zhì)的幾何結(jié)構(gòu)與基因表達的調(diào)控、細胞核的組織(nuclear organization)、腫瘤的拷貝數(shù)變異以及腫瘤轉(zhuǎn)移有關[47-48]。拓撲關聯(lián)域(topologically associating domains，TAD)被認為是基因組的基本調(diào)控單位。TAD及其邊界區(qū)域?qū)τ诰S持基因的正常功能至關重要，其破壞可引起功能異常。故對TAD的研究有利于更深入地理解異常發(fā)生的機制[49]。如Lupiáez等[50]發(fā)現(xiàn)罕見的手指合并ACRPV綜合征(acropectorovertebral syndrome)是WNT6前方因倒位增加了鄰近TAD中的一組肢體增強子所致的疾病。目前單細胞染色質(zhì)拓撲學的研究技術有單細胞Hi-C(single-cell Hi-C，scHi-C)[51]、單細胞組合索引Hi-C(single-cell combinatorial indexed Hi-C，sciHi-C)以及單核Hi-C(single-nucleus Hi-C，snHi-C)等[52-53]。

1.2.4 單細胞轉(zhuǎn)錄組測序 單細胞RNA測序(single cell RNA sequencing，scRNA-seq)可以用于生物學和醫(yī)學研究的多個方面，包括揭示胚胎的遺傳程序、組織的細胞組成、基因表達的動力學和轉(zhuǎn)錄水平的差異性以及腫瘤的發(fā)展機制等[54]。如Xue等[55]通過scRNA-seq鑒定了人和小鼠早期胚胎中多態(tài)基因的階段特異性單等位基因表達模式，擴展了對早期胚胎發(fā)育的基因激活順序、轉(zhuǎn)錄特征以及遺傳編程認識；Mahata等[56]利用Th2細胞的單細胞轉(zhuǎn)錄組學數(shù)據(jù)，鑒定了可作為生成類固醇的細胞亞群的生物標記Ly6c1/2；Shalek等[57]通過scRNA-seq分析經(jīng)LPS處理的骨髓樹突細胞，發(fā)現(xiàn)了某些基因表達和剪接的雙峰模式(bimodal pattern)；Tirosh等[58]通過scRNA-seq分析早期少突膠質(zhì)細胞瘤細胞的拷貝數(shù)變異，重建了未分化癌細胞的發(fā)育程序，首次在人類腦瘤樣本中鑒定了腫瘤干細胞(cancer stem cells，CSC)，證實了腫瘤干細胞模型。新近的單細胞RNA測序技術有索引液滴RNA測序(indexing droplets RNA sequencing，inDrop-seq)[59]、單細胞組合索引RNA測序(single-cell combinatorial indexing RNA sequencing，sci-RNA-seq)和基于分裂池連接的轉(zhuǎn)錄組測序(split-pool ligation-based transcriptome sequencing，SPLiT-seq)等[60-61]。

1.2.5 單細胞空間組測序 細胞的空間位置信息在譜系發(fā)育和一些腫瘤的相關研究中至關重要。如利用組織中的細胞位置信息可以跟蹤胚胎發(fā)育過程中譜系分配和分化的空間模式；對于一些腫瘤如導管原位癌(ductal carcinoma in situ，DCIS)和浸潤性導管癌(invasive ductal carcinoma，IDC)，其組織病理的空間位置信息則是其分類的依據(jù)。雖然在某些情況下可以從scRNA-seq數(shù)據(jù)推斷出空間參數(shù)，但這種計算推理有許多局限性，如Seurat方法依賴于原位雜交(insituhybridization，ISH)所確定的空間界標[23]，因而受ISH圖譜低分辨特性的限制。因此，諸如Tomo-seq、Geo-seq、TSCS、FISSEQ等的直接空間轉(zhuǎn)錄組研究方法被相繼研發(fā)[62-65]。如Casasent等[66]通過拓撲單細胞測序(topographic single cell sequencing，TSCS)，結(jié)合激光捕獲顯微切割(LCM)、激光彈射(laser catapulting)、全基因組擴增(WGA)和scDNA-seq，保留單個腫瘤細胞的空間信息的同時分析拷貝數(shù)畸變(copy number aberrations，CNAs)，推出了繼獨立譜系模型(independent lineage model)和進化瓶頸模型(evolutionary bottleneck model)之后的多克隆侵襲模型(multiclonal invasion model)。

2 多組學單細胞測序

2.1 多組學單細胞測序的定義

如圖2所示，多組學單細胞測序是指將不同的組學測序聯(lián)合起來或?qū)⑼唤M學的不同層次測序聯(lián)合起來進行分析。一方面，由于技術噪音(technical noise)和固有噪音(intrinsic noise)的存在，單一組學測序方法具有效用限制性，因此一次性測量多種細胞特性的多組學單細胞測序可以更全面地表征細胞類型及其驅(qū)動因子[5]。另一方面，基因表達受到多個方面的調(diào)控，各個層次之間的相關性如何，是否存在起中樞作用的關鍵環(huán)節(jié)，疾病相關的變化發(fā)生在哪個時期等都是亟待解決的科研瓶頸。只有找到原因，才可為臨床提供切實可靠的治療指導。因此，對細胞的研究就需要從單組學拓展到多個組學的聯(lián)合。

圖2 多組學單細胞測序

2.2 多組學單細胞測序在生命科學研究領域的應用

目前多組學單細胞測序已經(jīng)被用于神經(jīng)科學、腫瘤研究以及免疫學等生命科學研究的多個領域。

DNA甲基化和核小體占據(jù)(nucleosome occupancy)屬于表觀修飾范疇，研究其深入機制至關重要。單細胞核小體占據(jù)和甲基化組測序(single cell nucleosome occupancy and methylome sequencing，scNOMe-Seq)可用于評估多能基因如OCT4和NANOG的核小體占據(jù)和DNA甲基化狀態(tài)，You等[67]由此揭示了核小體缺失區(qū)域(NDR)在DNA從頭甲基化和轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的關鍵作用。

通過聯(lián)合全基因組亞硫酸鹽測序(whole genome bisulfite sequencing，WGBS)和scRNA-seq對人類單個原始生殖細胞(primordial germ cells，PGCs)和誘導多能干細胞進行分析[68-69]，可研究細胞全能性和表觀遺傳重編程對可變剪接異質(zhì)性調(diào)節(jié)的影響。整合scCOOL-seq和scRNA-seq對小鼠單個卵母細胞進行轉(zhuǎn)錄組[70]，DNA甲基化和染色質(zhì)可及性分析可鑒定參與卵母細胞成熟的表觀修飾和轉(zhuǎn)錄因子，剖析卵母細胞在發(fā)育和全能性建立中的表觀遺傳改變。將單細胞的基因組拷貝數(shù)變異、染色體狀態(tài)/核小體定位、DNA甲基化、染色體倍性分析聯(lián)合起來，通過染色質(zhì)全組學景觀測序(chromatin overall omic-scale landscape sequencing，COOL-seq)可鑒定小鼠受精卵著床前表觀基因組重編程的關鍵特征和探索染色體狀態(tài)與DNA甲基化兩者的互動關系[71]，深入理解細胞多能性的表觀遺傳調(diào)控機制和異常胚胎的發(fā)育機制，為體細胞克隆效率的提高以及早期胚胎發(fā)育異常的診斷與治療提供新思路。

大腦作為人體最復雜的器官，可通過聯(lián)合snDrop-seq(single-nucleus droplet-based sequencing)和scTHS-seq(single-cell transposome hypersensitive site sequencing)獲取其單個細胞核的轉(zhuǎn)錄組和DNA可及性圖譜，用于研究如髓鞘再生等復雜的大腦生理遺傳程序[72]。

惡性腫瘤作為常見的死因之一，對人類健康構(gòu)成了嚴重威脅。腫瘤是體內(nèi)外多種因素引起的細胞失控性增殖疾病。對腫瘤的單細胞測序探索現(xiàn)已涉及外顯子組與基因組、轉(zhuǎn)錄組與基因組、表觀組與轉(zhuǎn)錄組、轉(zhuǎn)錄組與蛋白組、蛋白組與代謝組、基因組與轉(zhuǎn)錄組及表觀組等多種交叉組學。

通過全基因組和外顯子組單細胞測序方法(whole-genome and exome single cell sequencing)對單個正常細胞、雌激素受體(ER)陽性細胞和三陰性細胞進行單核拷貝數(shù)分析[73]，可發(fā)現(xiàn)ER+腫瘤細胞在生長過程中高度保守，而三陰性腫瘤細胞的點突變率逐漸增加，從而演變形成腫瘤的克隆多樣性，這對乳腺腫瘤的演變、化學耐藥性的診療具有重大意義。

Reuter等[74]利用Simul-seq(simultaneous DNA and RNA sequencing)同時獲取食道腺癌組織的全基因組和轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞中的基因組呈現(xiàn)出高度的非整倍性和局部的等位基因純合性，且特異等位基因的表達增加，由此鑒定了與治療反應相關的基因多態(tài)性。

通過基于索引的單細胞染色質(zhì)可及性與mRNA共測序(single-cell indexing-based coassay of chromatin accessibility and mRNA，sci-CAR)重建RNA譜定義的單個肺癌細胞的染色質(zhì)可及性譜[75]，深入揭示順式作用元件與染色體可及性之間的聯(lián)系，對細胞之間調(diào)節(jié)異質(zhì)性的探索提出了一個新的特征維度。

Darmanis等[76]和Genshaft等[77]聯(lián)合mRNA的逆轉(zhuǎn)錄測序和PEA技術，分別對單個早期膠質(zhì)母細胞瘤細胞和人類單個乳腺癌細胞進行干擾狀態(tài)下的mRNA和蛋白質(zhì)定量分析，逐步證實了異質(zhì)mRNA和蛋白質(zhì)表達的協(xié)同性。Younglee等[78]利用微孔技術量化原癌基因cMET在轉(zhuǎn)錄和翻譯抑制劑調(diào)節(jié)作用下的mRNA和蛋白質(zhì)表達情況，發(fā)現(xiàn)了非小細胞肺癌(NSCLC)的不同轉(zhuǎn)錄物-蛋白質(zhì)相關模式，促進了與動態(tài)基因表達和蛋白質(zhì)表達相關的研究從生命科學向更微觀的細胞調(diào)節(jié)機制深入發(fā)展。

代謝物是特定細胞過程遺留下的特殊化學指紋。當其他組學數(shù)據(jù)分析無法解釋細胞體內(nèi)的生理活動時，對代謝物組的表征是個非常重要的補充。Xue等[79]利用代謝物的表面競爭性結(jié)合熒光讀數(shù)原理將代謝物的檢測整合到蛋白質(zhì)測定的單細胞條形碼芯片(single-cell barcode chip，SCBC)中，通過分析人單個膠母細胞瘤細胞對表皮生長因子受體拮抗劑的反應，首次揭示了細胞間代謝物的異質(zhì)性和藥物誘導的代謝物——磷蛋白相關網(wǎng)絡的變化情況。

在表觀組和基因組的基礎上綜合轉(zhuǎn)錄組，通過scTrio-seq(single-cell triple omics sequencing)可發(fā)現(xiàn)大規(guī)?？截悢?shù)變異對基因組某些區(qū)域的DNA甲基化和RNA表達比例的影響[80]，用于鑒定人肝癌組織中的癌細胞新亞群，深入研究基因組和表觀基因組異質(zhì)性對細胞群內(nèi)轉(zhuǎn)錄組異質(zhì)性的影響。

人體依賴免疫系統(tǒng)識別“異己”，清除入侵的各種抗原或自身的異常細胞。George等[81]聯(lián)合微流體和RNA測序?qū)蝹€免疫細胞進行全轉(zhuǎn)錄組和分泌的蛋白并行檢測，在小鼠的巨噬細胞中發(fā)現(xiàn)了與TNF-α分泌高度相關的基因亞組，促進了免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)機制的深入研究，以發(fā)掘藥靶用于疾病的治療。利用DNA條形碼技術，轉(zhuǎn)錄組與表位細胞索引測序(cellular indexing of transcriptomes and epitopes by sequencing，CITE-seq)以及RNA表達與蛋白質(zhì)測序(RNA expression and protein sequencing，REAP-seq)對外周血單核細胞和CD8+T細胞進行研究[82-83]，鑒定了僅轉(zhuǎn)錄組學無法區(qū)分的亞群以及異常細胞群與正常細胞差異表達的蛋白質(zhì)，提示CITE-seq和REAP-seq未來可用于檢測多種不同的免疫細胞，推動新型腫瘤免疫療法的開發(fā)。Geiger等[84]通過高分辨率質(zhì)譜技術(high-resolution mass spectrometry)獲取人幼稚T細胞的動態(tài)代謝組和蛋白組圖譜，發(fā)現(xiàn)了3種感受L-精氨酸水平的轉(zhuǎn)錄因子(BAZ1B、 PSIP1和TSN)及L-精氨酸水平對T細胞存活和抗腫瘤活性的影響，為研究細胞的代謝與功能之間復雜的相互作用開辟了新道路。

3 單細胞測序在口腔醫(yī)學中的應用

環(huán)境中的生物膜被認為是致病生物的儲存庫。單細胞基因組學是捕獲新基因組的方法之一，使用單細胞方法從環(huán)境中捕獲基因組可用于病原體基因型和流行的相關研究。如Mclean等[85]利用單細胞基因組測序，首先通過FACS將從醫(yī)院水槽的生物膜中獲取的單個細菌細胞遞送到微量滴定孔中，接著使用自動化平臺裂解細胞并進行DNA擴增以創(chuàng)建單細胞基因組DNA文庫，隨后對16S rRNA基因進行循環(huán)測序以分析文庫的多樣性，然后挑選出目標基因組進行全基因組測序；最后使用專門的組裝工具對所選基因組進行組裝，獲得了牙周病原體新的牙齦卟啉單胞菌株的完整基因組，為最終揭示它們在宿主和環(huán)境之間的傳播模式提供了可借鑒的研究方向。

牙周炎是導致牙齒脫落的主要原因，且與許多系統(tǒng)性疾病包括糖尿病、心血管疾病以及骨質(zhì)疏松癥等有關[86-88], 但與其相關的微生物在疾病中的作用機制還未十分清楚?？谇恢懈缓⑸?，但許多菌群至今還未被培養(yǎng)出來，其相關研究也因此受限。如硫酸鹽還原菌(sulfate-reducing bacteria，SRB)就是一類未培養(yǎng)的口腔微生物，許多研究發(fā)現(xiàn)其與牙周炎尤其是重癥牙周炎相關[89-91]。利用單細胞基因組測序，可以研究未培養(yǎng)菌群的功能，探索其與牙周組織疾病及全身疾病的關系。如Campbell等[92]采用熒光原位雜交(FISH)和流式細胞分選相結(jié)合的方法，首先從樣品中分離出δ變形菌屬(Deltaproteobacteria)；然后利用MDA擴增單細胞基因組DNA；接著通過16S rRNA或SSU rRNA基因測序?qū)渭毎麛U增基因組(single cell amplified genomes，SAGs)進行分類以獲得目標SRB菌屬中脫硫葉菌(Desulfobulbus)和脫硫弧菌(Desulfovibrio)的基因組；最后將獲得的基因組數(shù)據(jù)與其他δ變形菌的基因組進行比較，發(fā)現(xiàn)前兩者存在與粘附、抗應激以及防御相關的特異基因，揭示了它們在牙周病病因?qū)W中的可能作用。

此外，利用單細胞基因組測序還可以揭示不同口腔微生物中疾病相關基因的進化過程，進而研究細菌與宿主間相互作用的深層機制。如坦納菌福賽斯(Tannerellaforsythia)被認為與牙周炎、牙齦卟啉單胞菌及樹突狀螺旋體有關[93-94]，而與其親緣關系最近的坦納菌BU063(Tannerella BU063)本身卻并不致病，被發(fā)現(xiàn)在健康的牙周環(huán)境中比在患病的牙周袋中更普遍。Beall等[95]對健康相關的坦納菌BU063進行單細胞基因組測序：首先利用流式細胞術從健康受試者的齦下菌斑中分離出單個細胞；隨后對其基因組進行擴增；接著對16S rRNA基因測序，然后在核心口腔16S基因數(shù)據(jù)庫(CORE oral 16S gene database)中進行BLAST搜索以鑒定出所需的BU063，最后利用試劑盒制備其基因組文庫，分析發(fā)現(xiàn)其與牙周病致病坦納菌福賽斯之間存在基因組成上的差異，即在BU063中未發(fā)現(xiàn)福賽斯中已知的包括karilysin、prtH和bspA在內(nèi)的毒力基因，故提出病原體的毒性可能源自致病性基因簇的存在的觀點，為解釋高度相似的口腔微生物間具有不同致病潛能的現(xiàn)象提供了新的研究思路。

腫瘤內(nèi)的細胞異質(zhì)性對腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移以及腫瘤對治療的反應等腫瘤生物學的多個方面具有重要影響[96]。單細胞轉(zhuǎn)錄組測序(scRNA-seq)可以用于鑒定腫瘤的組成和癌癥干細胞以及為腫瘤的耐藥性提供新的見解。因此，口腔頜面部的腫瘤亦可利用scRNA-seq進行相關研究。如Puram等[97]對不同口腔鱗狀細胞癌患者的腫瘤細胞、基質(zhì)細胞和免疫細胞進行scRNA-seq分析，發(fā)現(xiàn)后兩者在不同患者中的表達程序具有一致性，而腫瘤細胞在腫瘤之間及腫瘤內(nèi)部則存在多方面的差異表達。在差異表達的程序中，研究人員結(jié)合上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymal transition ，EMT)的特點，提出了腫瘤細胞的部分上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(partial EMT，p-EMT)概念，通過將scRNA-seq數(shù)據(jù)與頭頸部鱗癌(head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC)的常規(guī)大體測序數(shù)據(jù)進行整合比較，根據(jù)p-EMT細胞的特點重新把HNSCC亞型分為三類，并通過實驗證明p-EMT可以作為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)分期的獨立預測因子，即p-EMT評分可以幫助預測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，從而避免不必要的頸部淋巴結(jié)清掃術，為更好地了解上皮性腫瘤的內(nèi)部異質(zhì)性與其侵襲性和轉(zhuǎn)移的關系提供了實驗支持以用于指導臨床實踐。

4 展 望

近十年來，單細胞測序技術方興未艾，從細胞鑒定、譜系分析到偽時分析，隨著單細胞技術的不斷發(fā)展和成熟，單細胞測序在生理病理研究方面扮演越來越重要的角色。如口腔醫(yī)學領域利用單細胞測序技術，打開了口腔微生物暗物質(zhì)(microbial dark matter，MDM)研究的大門[98]，使口腔疾病的病因?qū)W研究向前邁出了重要的一步；將單細胞測序與腫瘤研究相關的方法引進口腔頜面部腫瘤的機制探索實驗中，推動其迅猛發(fā)展。未來單細胞測序?qū)⒊掷m(xù)由單組學向多組學延伸，通過整合數(shù)據(jù)，建立一個全面的人類細胞圖譜[99]，揭示細胞功能的潛在機制并推斷細胞之間的因果關系，最終解答諸如“什么是細胞類型”等重要的生物學問題。