全梅芳，彭金莉，何昊城, 夏立秋, 丁學(xué)知*

(1.湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 長沙 410013； 2.微生物分子生物學(xué)湖南省重點(diǎn)實驗室， 淡水魚類發(fā)育生物學(xué)國家重點(diǎn)實驗室， 湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 長沙 410081)

蘇云金芽胞桿菌(Bacillusthuringiensis, Bt)是一種自然界廣泛分布的革蘭陽性細(xì)菌，其主要特征是在菌體形成芽胞的同時，伴隨有大量殺蟲晶體蛋白(insecticidal crystal proteins，ICPs)產(chǎn)生[1]。這種ICPs的高效表達(dá)源于它特殊的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式,且與芽胞形成過程緊密偶聯(lián)。芽胞形成主要通過順序激活6個RNA聚合酶 σ 因子，分別為：σA、σH、σF、σE、σG和σK。這些因子在菌體生長的不同階段分別發(fā)揮調(diào)控功能，指導(dǎo)芽胞形成相關(guān)基因有序而準(zhǔn)確的表達(dá)[2]。

Bt的芽胞形成過程與枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)極為相似，大致分為以下7個階段。第一階段(Stage Ⅰ)，與營養(yǎng)體細(xì)胞在形態(tài)上沒有明顯差別；第二階段(Stage Ⅱ)，軸絲和芽胞隔膜開始形成；第三階段(Stage Ⅲ)，前芽胞內(nèi)卷，游離在母細(xì)胞的胞質(zhì)里，可觀察到伴胞晶體；第四階段(Stage Ⅳ)，芽胞外壁逐漸形成；第五階段(Stage Ⅴ)，芽胞內(nèi)衣沉積形成；第六、七階段(Stage Ⅵ&Ⅶ)，皮層形成，芽胞逐漸成熟，隨后，芽胞和伴胞晶體從裂解的母細(xì)胞中釋放。其中cry基因的表達(dá)調(diào)控主要是由σE和σK因子控制，ICPs出現(xiàn)最初始于Stage Ⅲ早期，在Stage Ⅳ至Ⅴ階段完成其形成過程[3,4]。

Bt 4.0718 菌株為本室選育的一株庫斯塔克亞種高毒力菌株，能產(chǎn)生橢圓形芽胞和典型的菱形與方形晶體，對棉鈴蟲、小菜蛾和甜菜夜蛾等農(nóng)業(yè)害蟲表現(xiàn)出很強(qiáng)的毒殺活性[5,6]。Bt ΔleuB是以Bt 4.0718為出發(fā)菌株，對其3-異丙基蘋果酸脫氫酶(3-isopropylmalate dehydrogenase)基因leuB實現(xiàn)無痕敲除得到的一株工程菌。Bt ΔleuB在液體LB培養(yǎng)基中生長時無芽胞出現(xiàn)，只產(chǎn)生晶體，這種特殊表型打破了現(xiàn)有認(rèn)識，即認(rèn)為Bt的晶體必須伴隨芽胞而出現(xiàn)。

FM4-64染料是親脂性苯乙烯基化合物，能與質(zhì)膜及細(xì)胞器膜結(jié)構(gòu)特異結(jié)合后發(fā)出紅色熒光，可被應(yīng)用于芽胞桿菌中芽胞形成及母細(xì)胞凋亡過程的研究[7-9]。本研究以Bt 4.0718 和Bt ΔleuB菌株為研究對象，采用FM4-64染料對不同生長階段的菌體進(jìn)行染色，在激光共聚焦掃描顯微鏡(confocal laser scanning microscope，CLSM)下對比觀察兩株菌芽胞發(fā)育與晶體形成的過程，以期從細(xì)胞水平上為理解這一類特殊表型發(fā)生的機(jī)制提供線索。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

Bt 4.0718菌株(BacillusthuringiensisCCTCC No.M200016)為本室選育，屬于庫斯塔克亞種。Bt ΔleuB(CCTCC No.M2019112)是以Bt 4.0718為出發(fā)菌株，leuB基因無痕敲除的工程菌。Bt菌株的培養(yǎng)采用LB培養(yǎng)基(NaCl 10 g，tryptone 10 g，yeast extract 5 g，pH7.0，加超純水定容至1 L，121 ℃滅菌20 min)。

1.2 主要試劑與儀器

FM4-64(T3166)購自Invitrogen公司?；蚪MDNA去除以及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒HiScript?II Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)購自Vazyme公司。實時熒光定量PCR反應(yīng)(qRT-PCR)試劑盒PowerUPTM SYBRTM Green Master Mix購自ABI公司。正置顯微鏡購自德國卡爾-蔡司公司，型號為AXIO SCOPE A1；激光共聚焦掃描顯微鏡購自卡爾-蔡司，型號為LSM 710。

1.3 生長情況分析

將各菌株接種于10 mL LB 液體培養(yǎng)基過夜活化后，按照1%比例分別轉(zhuǎn)接于50 mL LB培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每組設(shè)置3個平行。每2 h取樣，以新鮮LB作為空白對照，利用分光光度計測定OD600值，確定各菌株的生長曲線。

1.4 染色液配置

1 mg FM4-64 染料溶解于0.5 mL DMSO中配備成母液，再用Hank’s平衡鹽溶液(8 g/L NaCl，0.4 g/L KCl，1 g/L Glucose，0.06 g/L KH2PO4，0.126 g/L Na2HPO4·12H2O，0.35 g/L NaHCO3)稀釋成工作液(25 μg/mL)。

1.5 染色與顯微鏡觀察

染色：收集100 μL菌液，水洗3遍后重懸于200 μL無菌水中；取上述待染菌懸液10 μL，加入FM4-64工作液100 μL混勻，冰上染色1 min。

顯微鏡制樣：取染色后的菌懸液(或未染菌懸液)6 μL滴于潔凈載玻片上，蓋上蓋玻片、壓片，激光共聚焦掃描顯微鏡(或倒置顯微鏡)觀察。

1.6 總RNA提取與目的基因轉(zhuǎn)錄水平分析

活化過夜的Bt菌液按1%的接種量接種于30 mL液體LB培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)30 h，12 000 r/min離心3 min，收集0.1 g菌體；總RNA提取使用Trizol試劑；基因組DNA去除、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及qRT-PCR反應(yīng)按試劑盒說明書進(jìn)行；引物序列及名稱見表1；各基因的mRNA相對表達(dá)水平以16s rRNA為內(nèi)參進(jìn)行歸一化處理；基因相對表達(dá)量計算按照2-ΔΔCT標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。

表1 本研究所用引物Tab.1 Primers used in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 Bt 4.0718與Bt ΔleuB的生長情況分析

生長曲線測定結(jié)果顯示，在延滯期、對數(shù)生長期和穩(wěn)定期前、中期，Bt 4.0718與Bt ΔleuB兩株菌的生長曲線沒有顯著差異，但從 26 h 開始(穩(wěn)定期后期)，Bt 4.0718由于菌體的迅速裂解，導(dǎo)致培養(yǎng)物的OD600值急劇下降，然而Bt ΔleuB的OD600值始終維持在比較平穩(wěn)的狀態(tài)(圖1)。

圖1 Bt 4.0718和Bt ΔleuB在LB培養(yǎng)基中的生長曲線比較Fig.1 Growth curves of Bt 4.0718 and Bt ΔleuB in LB medium

2.2 相差顯微鏡觀察

相差顯微鏡觀察結(jié)果顯示：在培養(yǎng)至24 h時(穩(wěn)定期后期)，Bt 4.0718 細(xì)胞內(nèi)可見典型的卵圓形芽胞和菱形晶體；同時期的 Bt ΔleuB無芽胞，大部分菌體內(nèi)可見規(guī)則的菱形晶體。Bt 4.0718菌體細(xì)胞在48 h 時已完全裂解，芽胞和晶體隨之釋放；而Bt ΔleuB培養(yǎng)至96 h 時仍未裂解，菌體內(nèi)包裹的菱形晶體體積進(jìn)一步增大，有的甚至占據(jù)母細(xì)胞體積的1/3(圖2)。

圖2 Bt 4.0718和Bt ΔleuB在LB培養(yǎng)基中相差顯微鏡觀察Fig.2 Observation of Bt 4.0718 and Bt ΔleuB cells in LB medium by phase-contrast microscopyS：芽胞；C：伴胞晶體S:Spores;C:Parasporal crystals

2.3 激光共聚焦掃描顯微鏡觀察

為了探索Bt ΔleuB特殊表型背后的生物學(xué)機(jī)制，分別將菌株Bt 4.0718和Bt ΔleuB培養(yǎng)至芽胞期，取不同生長時間點(diǎn)的樣品，用FM4-64染料對菌體染色，CLSM觀察對比分析兩株菌的芽胞發(fā)育過程。結(jié)果表明：當(dāng)Bt 4.0718菌株生長到10 h時，少部分細(xì)胞開始形成不對稱隔膜；14 h時，大部分細(xì)胞進(jìn)入前芽胞內(nèi)吞階段；17 h時，芽胞內(nèi)吞已完成，此時芽胞未能標(biāo)記上FM4-64，只能觀察到活細(xì)胞的外部膜狀輪廓，相差模式下可見明顯的芽胞和晶體；24 h時，進(jìn)入凋亡階段，母細(xì)胞膜破裂，F(xiàn)M4-64進(jìn)入母細(xì)胞胞質(zhì)溶膠，與聚集的膜碎片結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞的外部輪廓不規(guī)則(圖3)。

樣品Bt ΔleuB的觀察結(jié)果顯示，14～17 h時，菌體逐漸形成不對稱隔膜，相差模式下17 h時細(xì)胞內(nèi)已可見明顯的菱形晶體；24 h時,部分細(xì)胞進(jìn)入胞吞階段，隔膜形成期細(xì)胞仍然可見，晶體體積進(jìn)一步增大；31 h時的芽胞發(fā)育狀態(tài)與24 h無明顯差別(結(jié)果未顯示)；40 h時，晶體體積達(dá)到最大，但仍無芽胞，母細(xì)胞尚無裂解跡象。然而CLSM觀察發(fā)現(xiàn)：紅色熒光在細(xì)胞內(nèi)聚集，且顯示的細(xì)胞外部輪廓不規(guī)則，表明大部分母細(xì)胞的質(zhì)膜可能已破裂(圖4)。

圖3 激光共聚焦掃描顯微鏡分析Bt 4.0718菌株的芽胞發(fā)育過程以及母細(xì)胞裂解情況Fig.3 Analysis of the spore development process and mother cell lysis in Bt 4.0718 by CLSM箭頭1：不對稱隔膜；箭頭2：前芽胞內(nèi)吞；箭頭3：伴胞晶體；箭頭4：芽胞Arrow 1:The asymmetric septum;Arrow 2:The process of spore engulfment;Arrow 3:Parasporal crystal;Arrow 4:Spore

圖4 激光共聚焦掃描顯微鏡分析Bt ΔleuB菌株的芽胞發(fā)育過程以及母細(xì)胞裂解情況Fig.4 Analysis of the spore development process and mother cell lysis in Bt ΔleuB by CLSM箭頭1：不對稱隔膜；箭頭2：前芽胞內(nèi)吞；箭頭3：伴胞晶體Arrow 1:The asymmetric septum;Arrow 2:The process of spore engulfment;Arrow 3:Parasporal crystal

2.4 σE、spoIIR和spoIIGA的轉(zhuǎn)錄水平分析

晶體蛋白形成依賴于芽胞形成，因為cry基因的表達(dá)調(diào)控主要受σE和σK因子控制，它們分別在芽胞形成早期和晚期的母細(xì)胞中表達(dá)。鑒于Bt ΔleuB菌株的特殊表型，推測其細(xì)胞內(nèi)維持ICPs正常表達(dá)的主要為σE。qRT-PCR結(jié)果顯示，相對于Bt 4.0718，Bt ΔleuB中σE和上游信號分子spoIIR以及負(fù)責(zé)pro-σE切割活化的蛋白酶spoIIGA的轉(zhuǎn)錄水平均上升。

圖5 兩株Bt菌株中spoIIGA、spoIIR和σE基因的相對轉(zhuǎn)錄水平分析。** :P≤0.01 vs Bt 4.0718Fig.5 The relative transcriptional levels of the spoIIGA,spoIIR and σE genes in the two Bt strains. ** :P≤0.01 vs Bt 4.0718

3 討論

在生長穩(wěn)定期后期，Bt細(xì)胞會逐漸區(qū)室化形成一個卵圓形的芽胞，同時在母細(xì)胞內(nèi)會形成伴胞晶體，這也是Bt區(qū)別于蠟狀芽胞桿菌(Bacilluscereus)和炭疽芽胞桿菌(Bucilusanthracis)的顯著特征，而只產(chǎn)生芽胞或晶體的突變菌株是研究Bt芽胞與晶體關(guān)系的重要遺傳材料。無晶體突變株的構(gòu)建方法已非常成熟，編碼晶體蛋白的基因大多數(shù)位于Bt質(zhì)粒上，因此多采用質(zhì)粒消除的方法得到無晶體突變株[10]。只產(chǎn)生晶體的無芽胞突變菌株的構(gòu)建原理則相對較復(fù)雜，這一類工程菌基本上是芽胞形成關(guān)鍵調(diào)控因子如spo0A、σE、spoIIID或σK因子的基因缺陷型突變株。其中spo0A或σE因子突變將嚴(yán)重影響芽胞形成依賴型cry基因的轉(zhuǎn)錄。Lereclus等[11]將cry3A或受cry3A啟動子控制的cry1基因轉(zhuǎn)入spo0A突變株后，能過量表達(dá)晶體蛋白且母細(xì)胞不裂解，晶體被包裹在細(xì)胞內(nèi)，對解決晶體蛋白的紫外穩(wěn)定性差等問題具有潛在應(yīng)用價值[11]。spoIIID或σk基因缺失突變株基本喪失芽胞形成能力，但依然形成晶體[12,13]。與之相似的是，本研究中的Bt ΔleuB菌株也不能正常產(chǎn)生芽胞，但能形成伴胞晶體。已知Bt ΔleuB中的晶體蛋白編碼基因為典型的芽胞依賴型cry基因，因此推斷Bt ΔleuB菌株在生長過程中應(yīng)該能夠進(jìn)入芽胞期，但沒能順利完成芽胞發(fā)育過程，而是被阻斷于中間某一階段。

芽胞形成以不對稱細(xì)胞分裂開始，原來的細(xì)胞被雙層膜結(jié)構(gòu)的隔膜分成了大小不等的兩個區(qū)室，即前芽胞(較小的區(qū)室)和母細(xì)胞。在不對稱分裂之后，芽胞形成的下一個形態(tài)學(xué)階段是母細(xì)胞吞噬前芽胞，使前芽胞成為其細(xì)胞質(zhì)中的游離原生質(zhì)體。接下來位于芽胞核心周圍的一系列保護(hù)結(jié)構(gòu)被逐漸組裝，如皮質(zhì)層、芽胞衣結(jié)構(gòu)等[2,14,15]，最后母細(xì)胞經(jīng)由程序性細(xì)胞死亡機(jī)制裂解后，成熟的芽胞得以釋放，其中前芽胞內(nèi)吞的完成是控制芽胞后期發(fā)育成熟的關(guān)鍵事件。CLSM觀察結(jié)果顯示：Bt 4.0718和Bt ΔleuB分別于10 h、14 h左右時開始形成不對稱隔膜(Stage Ⅱ)；并分別于14 h、24 h左右時開始進(jìn)入前芽胞內(nèi)吞階段(Stage Ⅲ)，這表明突變株能順利進(jìn)入芽胞形成期，然而相比野生菌Bt 4.0718能完成芽胞發(fā)育的整個過程，Bt ΔleuB的芽胞發(fā)育可能被阻斷于內(nèi)吞階段，因此導(dǎo)致該菌株無芽胞產(chǎn)生，但伴胞晶的體形成從細(xì)胞不對稱分裂期就已開始，且晶體體積較大。

Bt在芽胞發(fā)育過程中通過先后激活6個不同的σ因子，使調(diào)控芽胞形成基因準(zhǔn)確無誤地表達(dá)。其中σF和σE分別在芽胞形成早期的前芽胞和母細(xì)胞中表達(dá)，σG和σK分別在芽胞形成晚期的前芽胞和母細(xì)胞中表達(dá)。細(xì)胞完成不對稱分裂后不久，激活的σF致使前芽胞分泌信號蛋白spoIIR進(jìn)入母細(xì)胞，一旦接收到來自前芽胞的信號，定位于膜上的pro-σE即被天冬氨酸蛋白酶spoIIGA切割為活化的σE，活化的σE啟動母細(xì)胞中cry基因的轉(zhuǎn)錄[16,17]。qRT-PCR結(jié)果顯示，Bt ΔleuB中σE、spoIIR和spoIIGA的轉(zhuǎn)錄水平均顯著上調(diào)。因此，雖然Bt ΔleuB菌株芽胞發(fā)育缺陷(被阻滯于胞吞階段)，但晶體蛋白積累并未受到影響，這再次印證了Bravo等[12]的研究結(jié)論，單獨(dú)的σE因子就足以支撐σE、σK依賴型雙重疊啟動子(Bt Ⅰ+ Bt Ⅱ)cry基因的高水平表達(dá)。另一方面，Bt ΔleuB菌株母細(xì)胞不裂解的表型與其芽胞發(fā)育缺陷密切相關(guān)，中國農(nóng)科院張杰研究員等[18]研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞壁水解酶基因cwlC的轉(zhuǎn)錄受σK控制，并且cwlC缺失可完全阻斷Bt母細(xì)胞的裂解。因此我們推測，Bt ΔleuB菌株中晚期sigma因子σK活性降低或缺失是其母細(xì)胞裂解受阻的關(guān)鍵因素。比較有趣的是，與Hosoya等[7]的結(jié)果一致，CLSM觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，24 h時，Bt 4.0718細(xì)胞在相差模式下還有完整的細(xì)胞形態(tài)，但FM4-64染色結(jié)果顯示細(xì)胞膜已破裂，這表明在Bt細(xì)胞程序性死亡過程中，細(xì)胞膜破裂是早于細(xì)胞壁裂解的生物學(xué)事件。并且在Bt ΔleuB菌株中，雖然細(xì)胞壁裂解受阻斷，但在40 h時，細(xì)胞已開啟死亡程序(膜破裂)。

選擇一株具有特殊表型的Bt突變株及其出發(fā)菌株作為研究對象，利用熒光染料進(jìn)行細(xì)胞發(fā)育過程的形態(tài)學(xué)觀察，為研究芽胞發(fā)育、晶體形成以及母細(xì)胞裂解三者之間的關(guān)系提供了一些線索，但具體的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。