王麗虹，劉陽(yáng)，*，姜圓圓，劉梟，張志豪

（1.武昌理工學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，生物多肽糖尿病藥物湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北省生物多肽糖尿病藥物工程技術(shù)研究中心，湖北武漢430223；2.武漢工程大學(xué)環(huán)境生態(tài)與生物工程學(xué)院，湖北武漢430073）

為了延長(zhǎng)產(chǎn)品的有效期，食品、化妝品、醫(yī)藥等行業(yè)都會(huì)添加一定量的防腐劑，目前市場(chǎng)上使用的防腐劑大多數(shù)是人工合成。有研究發(fā)現(xiàn)，一些合成防腐劑有誘癌性[1]和致畸性[2]，同時(shí)有害微生物的泛濫還會(huì)引起人類(lèi)產(chǎn)生各種疾病，對(duì)人類(lèi)健康構(gòu)成巨大威脅[3]。有研究顯示天然植物中所含的黃酮類(lèi)物質(zhì)具有抗菌功能[4]，因此科研工作者致力于從天然植物中尋找既安全又有效的天然防腐劑。

辣木（Moringa oleifera Lam）又名鼓槌樹(shù)、洋椿樹(shù)，屬于辣木科（Moringaceae）辣木屬（Moringa Adans）多年生深根性落葉喬木[5]，為藥食兩用植物。現(xiàn)已有研究報(bào)道[6-8]辣木葉提取物對(duì)大腸埃希菌（Escherichia coli）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes）這4種供試菌具有均抗菌活性，且最小抑制濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）值都在2.0 mg/mL～4.0 mg/mL之間，研究還發(fā)現(xiàn)抗菌活性與其含有的單寧、黃酮類(lèi)化合物、酚類(lèi)化合物有關(guān)，辣木葉中含有的辣木素能夠分解成兩個(gè)異硫氰酸芐酯分子，而這種物質(zhì)被證明是有抗菌活性的，因而辣木葉具有開(kāi)發(fā)為天然防腐劑的潛力。樹(shù)脂天青是一種細(xì)胞繁殖與毒性定量檢測(cè)的常用試劑，因活細(xì)胞中含有多種還原酶（如乳酸脫氫酶），可將樹(shù)脂天青由藍(lán)色還原成粉紅色，而死細(xì)胞因沒(méi)有代謝能力，不能將樹(shù)脂天青還原而繼續(xù)保持藍(lán)色[9]。因此，樹(shù)脂天青可用來(lái)檢測(cè)有無(wú)活細(xì)菌，根據(jù)其顏色變化來(lái)判斷藥物的MIC。本文擬采用樹(shù)脂天青法，測(cè)定辣木葉醇提物不同極性部位的MIC，進(jìn)而測(cè)定各極性部位對(duì)供試菌的最小殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC），以篩選其抗菌活性較強(qiáng)的極性部位，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)辣木葉資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料試劑與儀器

1.1.1 材料與試劑

辣木葉：產(chǎn)地云南保山，云南大藥山商貿(mào)有限公司提供；鮑曼不動(dòng)桿菌（Acinetobacter baumannii）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、大腸埃希氏菌（Escherichia coli）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、糞腸球菌（Enterococcus faecalis）、蘇云金桿菌（Bacillus thuringiensis）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）：武昌理工學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院細(xì)胞室提供；96孔板：美國(guó)康寧公司；90 mm一次性無(wú)菌培養(yǎng)皿：海門(mén)市卡邁勒實(shí)驗(yàn)器材經(jīng)營(yíng)部；接種棒：姜堰區(qū)康達(dá)實(shí)驗(yàn)器材廠；纖維素酶（酶活力：10萬(wàn) U/g）/果膠酶（酶活力：5萬(wàn) U/g）：寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）：上海源葉生物科技有限公司；樹(shù)脂天青：上海阿拉丁生化科技有限公司；鏈霉素：合肥新恩源生物技術(shù)有限公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。試驗(yàn)用水為超純水。

1.1.2 主要儀器

紫外分光光度計(jì)（UV-1800）：日本島津公司；電子分析天平（BS 224S）：賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（SY-500）：上海亞榮生化儀器廠；高壓滅菌鍋（BMX-30R）：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；生化培養(yǎng)箱（OHG-9073BS-Ⅲ）：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；超凈工作臺(tái)（ME104E/02）：上海尚道儀器制造有限公司；超純水儀（UPT-11-10T）：成都超純科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 辣木葉不同極性部位的制備

稱(chēng)取干燥辣木葉粉，按照最佳工藝路線(xiàn)：1 g辣木葉粉對(duì)應(yīng)纖維素酶20 mg、果膠酶40 mg，加入濃度為88%的乙醇，料液比為 1∶22（g/mL），超聲 45 min后置于60℃的水浴鍋酶解25 min提取辣木葉總黃酮→總醇提液（M）→依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取→收集萃取液→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑→置60℃烘箱干燥、粉碎，分別制得辣木葉石油醚部位（M1），乙酸乙酯部位（M2），正丁醇部位（M3）和水溶性部位（M4）備用。

1.2.2 總黃酮含量的測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制：參考謝瓊等[10]的方法，配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液后于510 nm處測(cè)定吸光度A。以A為縱坐標(biāo)、蘆丁濃度c（mg/mL）為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，建立回歸線(xiàn)方程。

樣品總黃酮含量測(cè)定：精密稱(chēng)取適量樣品，依照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)相同的方法配制供試液、測(cè)定A值，并代入回歸方程計(jì)算各極性部位中總黃酮含量。每個(gè)樣品測(cè)定3次，取平均值。

1.2.3 抗菌活性的測(cè)定

采用樹(shù)脂天青法檢測(cè)辣木葉各極性部位對(duì)A.baumannii、P.aeruginosa、E.coli、K.pneumoniae、S.au －reus、E.faecalis、B.thuringiensis、B.subtilis 8 種供試菌的MIC，之后進(jìn)一步測(cè)定不同極性部位對(duì)8種供試菌的MBC。

1.2.3.1 菌種的活化及菌懸液的配制

將固體培養(yǎng)基加熱溶化并在培養(yǎng)皿中鋪好，待其凝固分別移取不同菌的菌液100 μL于表面，后用涂布棒使菌液涂布均勻，倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中24 h后，用無(wú)菌接種棒挑取單個(gè)菌落于裝有液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，于37℃恒溫?fù)u床中繼續(xù)培養(yǎng)過(guò)夜，轉(zhuǎn)速為100 r/min[11]。第2天，移取100 μL菌懸液于10 mL滅菌的離心管中，再加900 μL的液體培養(yǎng)基搖勻編號(hào)為1，利用十倍稀釋法從1號(hào)管中移取100 μL菌懸液，再加900 μL液體培養(yǎng)基編號(hào)為2，以此類(lèi)推，共稀釋10次。最后分別移取1～10號(hào)離心管中的菌液100 μL于固體培養(yǎng)基的上，每個(gè)濃度平行3組，涂布均勻，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后觀察菌落生長(zhǎng)情況并根據(jù)計(jì)菌落數(shù)判斷編號(hào)幾的離心管中菌懸液密度大約為1×108CFU/mL，確定稀釋倍數(shù)后配置好各供試菌的菌懸液（1×108CFU/mL），放于4℃冷藏。所有操作均在無(wú)菌條件下進(jìn)行。

1.2.3.2 MIC的測(cè)定

采用二倍稀釋法對(duì)20 mg/mL的樣品用無(wú)菌水進(jìn)行稀釋[12]，外加一個(gè) 15 mg/mL 的濃度，分別是：20、15、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5 mg/mL。使用 96 孔板進(jìn)行MIC的測(cè)定，第1～8列為樣品組，第9列、第10列分別為陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。先在96孔板上每孔加100 μL的液體培養(yǎng)基，樣品孔加50 μL的樣品液，陰性對(duì)照組加50 μL的溶劑，陽(yáng)性對(duì)照組加50 μL 0.1 mg/mL鏈霉素，最后每個(gè)孔添加 50 μL 的菌液（5×105CFU/mL）[13]，在搖床搖勻后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。然后每個(gè)孔加入40 μL 0.2 mg/mL樹(shù)脂天青，置于37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)2 h，樹(shù)脂天青由藍(lán)色變?yōu)榉奂t色的孔所對(duì)應(yīng)的濃度就是樣品的MIC。所有操作均在無(wú)菌條件下進(jìn)行。

1.2.3.3 MBC的測(cè)定

從1.2.3.3的96孔板藍(lán)色的孔中吸取50 μL于固體培養(yǎng)基上，涂布均勻后于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，以培養(yǎng)基表面出現(xiàn)的菌落小于5個(gè)的最低濃度判斷為MBC[14]。所有操作均在無(wú)菌條件下進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品含量的測(cè)定

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立

按照1.2.2的方法，得到蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖1所示。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.1 Calibration curve of rutin

回歸方程為：A=14.634c－0.0087，其中 R2為0.9998，說(shuō)明濃度與吸光度的線(xiàn)性關(guān)系較好，可用于黃酮含量的測(cè)定。

2.1.2 辣木葉醇提物不同極性部位總黃酮含量的測(cè)定結(jié)果

辣木葉醇提物不同極性部位總黃酮含量見(jiàn)表1。

表1 辣木葉醇提物不同極性部位總黃酮含量Table 1 Total flavonoids content in different different polar extracts of alcohol extract of Moringa oleifera leaves

在試驗(yàn)中，M1加入顯色劑與不加顯色劑的顏色一致，后經(jīng)檢測(cè)在510 nm附近沒(méi)有吸收峰。查閱相關(guān)文獻(xiàn)得知，黃酮類(lèi)物質(zhì)一般不溶于石油醚，且本試驗(yàn)中得到的石油醚部位為黑色油狀物，其中可能存在著大量的色素和油脂[15]，故將石油醚部位略去。

從表1可知，辣木葉醇提物中的總黃酮通過(guò)不同極性溶劑萃取得到了初步分離，乙酸乙酯中總黃酮含量最高，水相中最少。從M總黃酮含量100.56 mg/g到M2中的326.19 mg/g，總黃酮含量提高了3倍以上，實(shí)現(xiàn)了有效富集，說(shuō)明本試驗(yàn)提取物中的黃酮類(lèi)物質(zhì)較易溶于乙酸乙酯。

2.2 MIC的測(cè)定結(jié)果

辣木葉醇提物及不同極性部位對(duì)供試菌的MIC值如表2所示。

由表2可知，4個(gè)樣品除了M4對(duì)8種菌均沒(méi)有抑菌效果外，其余部位對(duì)8種菌都有抑菌效果，其中M2對(duì)8種菌的抑菌效果比M3、M要強(qiáng)的多，其對(duì)A.baumannii、E.coli的 MIC為1.25 mg/mL，對(duì)P.aeruginosa、B.subtilis的 MIC為2.5 mg/mL，對(duì)K.pneumoniae、S.aureus、E.faecalis、B.thuringiensis的MIC均為0.625 mg/mL，說(shuō)明這4種菌對(duì)M2更加敏感、更易受到M2抑制。

表2 辣木葉醇提物及不同極性部位部位對(duì)供試菌的MIC值Table 2 MIC values of ethanol extracts of Moringa oleifera leaves and different polar extracts to the tested bacteria

2.3 MBC的測(cè)定結(jié)果

辣木葉醇提物及不同極性部位對(duì)供試菌的MBC值如表3所示。

表3 辣木葉醇提物及不同極性部位對(duì)供試菌的MBC值Table 3 MBC values of ethanol extracts of Moringa oleifera leaves and different polar extracts to the tested bacteria

由表3可知，M2對(duì)8種菌的殺菌效果最強(qiáng)，其中M2 對(duì) K.pneumoniae、S.aureus、E.faecalis、B.thuringiensis的 MBC 均為 5 mg/mL，M3 對(duì) P.aeruginosa、E.coli、S.aureus的MBC均為20 mg/mL，M部位對(duì)A.baumannii、E.faecalis有較好的殺菌作用，MBC均為15 mg/mL，水溶性部位則對(duì)上述8種菌均沒(méi)有殺菌效果。

2.4 討論

本試驗(yàn)對(duì)辣木葉醇提物及不同極性部位進(jìn)行了抑菌活性研究。由表2、表3可知，除水溶性部位對(duì)各試驗(yàn)菌均無(wú)抑菌活性，其余部位都有不同程度的抑菌活性，與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致。郭研[16]的研究結(jié)果顯示，在試驗(yàn)范圍內(nèi)（5 μg/mL～500 μg/mL）辣木葉提取物對(duì)S.aureus有抗菌活性，并具有濃度依賴(lài)性，但對(duì)E.coli沒(méi)有抑制活性。Abalaka等[17]研究顯示，辣木葉氯仿粗提取物對(duì)P.aeruginosa、E.coli和傷寒沙門(mén)氏菌（Salmonella typhimurium）有顯著的抑制作用，MIC分別為 20、10、10 mg/mL；辣木葉水提物對(duì) P.aeruginosa沒(méi)有抑制作用，對(duì)E.coli和S.typhimurium的MIC均為10 mg/mL。Busani等[18]的結(jié)果顯示，當(dāng)辣木葉水提物濃度為5 mg/mL時(shí)，對(duì)各試驗(yàn)菌均無(wú)抑菌活性；而5 mg/mL 的丙酮提取物，對(duì) E.coli、S.aureus、陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）、克里斯汀微球菌（Micrococcus kristinae）和普通變形桿菌（Proteus vulgaris）有抑制作用，但對(duì) P.aeruginosa、K.pneumonia、S.faecalis、短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）和蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）則沒(méi)有抑制活性；研究還發(fā)現(xiàn)，辣木葉提取物對(duì)試驗(yàn)真菌均無(wú)抑制作用。王遠(yuǎn)[19]的研究結(jié)果顯示，辣木葉總黃酮純化后的抗菌活性顯著增強(qiáng)，對(duì)E.coli、B.subtilis、藤黃微球菌（Micrococcus luteus）、S.aureus均有顯著的抑制活性，MIC值分別為 1.25、0.625、1.25、2.5 mg/mL，但對(duì)P.aeruginosa則沒(méi)有抗菌效果。

本試驗(yàn)的總黃酮含量測(cè)定結(jié)果說(shuō)明，辣木葉醇提物經(jīng)乙酸乙酯萃取后，黃酮含量顯著增大；抗菌研究表明，M2的抑菌活性明顯優(yōu)于其它部位及文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果，其對(duì) K.pneumoniae、S.aureus、E.faecalis、B.thuringiensis的 MIC均為0.625 mg/mL，對(duì) A.baumannii、E.coli的 MIC 為 1.25 mg/mL，對(duì) P.aeruginosa、B.subtilis的MIC為2.5 mg/mL。綜合分析推斷，總黃酮可能是辣木葉抑菌活性的主要成分，后續(xù)將對(duì)其組成成分及結(jié)構(gòu)鑒定等方面進(jìn)行深入研究，以期揭示辣木葉抗菌活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

本文分析了辣木葉醇提物及不同極性部位中的總黃酮含量，結(jié)果表明，辣木葉乙酸乙酯部位（M2）、正丁醇部位（M3）總黃酮含量分別為（326.19±2.35）mg/mL和（209.39±1.16）mg/mL，顯著高于醇提物中的總黃酮含量（100.56±1.49）mg/mL。抗菌試驗(yàn)結(jié)果顯示，除M4無(wú)抑菌活性外，其余部位的抑菌活性順序?yàn)椋篗2＞M3＞M，其中，M2 對(duì) K.pneumoniae、S.aureus、E.faecalis、B.thuringiensis的MIC均為0.625 mg/mL，是辣木葉主要的抗菌活性部位。