張雷 卡比努爾·克依木 周曉輝

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830000)

動(dòng)脈粥樣硬化是引起血管性癡呆和阿爾茨海默病(AD)的因素之一〔1，2〕。研究表明，除其他血管危險(xiǎn)因素外，血漿同型半胱氨酸(HCY)水平升高與AD易感性顯著相關(guān)〔3〕。此外，在非癡呆老年人群中，HCY血漿水平與總體認(rèn)知能力和特定認(rèn)知技能呈負(fù)相關(guān)〔4〕。

HCY來源于S-腺苷甲硫氨酸的去甲基化，此過程包括兩個(gè)循環(huán)，其中一個(gè)循環(huán)是HCY和甲硫氨酸之間轉(zhuǎn)換的代謝過程，其限速酶是亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)和甜菜堿HCY甲基轉(zhuǎn)移酶。HCY可以通過胱硫醚β合酶代謝合成HCY。MTHFR需要葉酸和維生素B12，而胱硫醚β合酶需要維生素B6作為輔助因子〔5〕。HCY血漿水平在普通人群中差異很大，可能受多種因素影響，包括葉酸和維生素B12〔6〕。血漿HCY也可能受到MTHFR基因多態(tài)性的影響，其特征是堿基在677位點(diǎn)上由C替換為T。35%的高加索人群中出現(xiàn)了T677等位基因，其中包括高達(dá)10%～20%的TT純合子。MTHFR基因TT677基因型的攜帶者經(jīng)常表現(xiàn)出血漿HCY水平的升高，因此，TT677基因型攜帶者被認(rèn)為患血管疾病和AD的風(fēng)險(xiǎn)更高〔6〕。英國的一項(xiàng)研究結(jié)果顯示健康受試者血漿HCY與頸動(dòng)脈內(nèi)膜中層厚度(IMT)呈正相關(guān)，而TT677 MTHFR基因型沒有任何影響〔7〕。研究還表明IMT增加與AD患病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，提示動(dòng)脈壁增厚可能是腦血管功能障礙的標(biāo)志〔1〕。最近的研究結(jié)果展示了頸動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展，即IMT增加與認(rèn)知能力下降之間的聯(lián)系〔2〕。目前高同型半胱氨酸血癥(HHcy)在動(dòng)脈粥樣硬化和AD中的作用機(jī)制尚不完全清楚。

本研究旨在研究認(rèn)知功能減退〔AD或失憶性輕度認(rèn)知障礙(MCI)〕患者HCY血漿水平是否與IMT值相關(guān)及HHCY的遺傳風(fēng)險(xiǎn)因素對動(dòng)脈粥樣硬化過程和認(rèn)知能力下降的可能影響。

1 對象和方法

1.1研究對象 根據(jù)納入和排除選擇標(biāo)準(zhǔn)招募新疆維吾爾族63例認(rèn)知障礙患者(45例AD患者，18例MCI患者)進(jìn)行本研究，根據(jù)美國神經(jīng)病學(xué)、語言障礙及腦卒中-AD和相關(guān)疾病學(xué)會(huì)(NINCDS-ADRDA)標(biāo)準(zhǔn)診斷AD，MCI根據(jù)美國精神病學(xué)會(huì)的精神障礙診斷和統(tǒng)計(jì)手冊的第四次修訂版(DSM-Ⅳ)診斷〔8，9〕。最終64例認(rèn)知障礙患者(病例組)參加了這項(xiàng)研究，他們在神經(jīng)疾病方面無臨床癥狀，且年齡和性別符合要求。選取年齡及性別匹配的健康體檢者為對照組研究對象，并進(jìn)行認(rèn)知缺陷篩查?；颊呔蓛晌簧窠?jīng)內(nèi)科醫(yī)師做出診斷。病例組和對照組的篩查標(biāo)準(zhǔn)為：(1)主要血管疾病(即腦卒中、冠狀動(dòng)脈缺血性疾病、靜脈血栓形成);(2)慢性酒精攝入或吸煙；(3)使用藥物增加血漿HCY(即苯妥英鈉、左旋多巴、甲氨蝶呤)；(4)維生素補(bǔ)充劑攝入量。受試者均接受神經(jīng)心理評估、頸部血管彩色雙聯(lián)檢查、生化分析、MTHFR C677T基因分型。研究方案得到了當(dāng)?shù)貍惱砦瘑T會(huì)的批準(zhǔn)。從護(hù)理者和非護(hù)理參與者處獲得簽署的知情同意書。

1.2神經(jīng)心理評估 研究對象進(jìn)行簡易精神狀態(tài)量表(MMSE)、日常活動(dòng)量表(ADL)、臨床癡呆評定量表(CDR)的評定及精神退化電流的測試。

1.3IMT評估 受試者接受了頸動(dòng)脈彩色多普勒超聲檢查。IMT在離分流器近1.5 cm處的頸總動(dòng)脈(CCA)上進(jìn)行評估。IMT為頸總動(dòng)脈后壁表現(xiàn)為相對較低回聲分割平行線間距離。

1.4生化指標(biāo)測量 每天早晨采集空腹血標(biāo)本，按HCY測定標(biāo)準(zhǔn)程序分離血漿，并連同血清樣本一起立即在-80℃冷凍。血漿HCY采用高效液相色譜-熒光法測定。以DL-HCY為外標(biāo)，N-乙酰半胱氨酸為內(nèi)標(biāo)，用放射免疫法測定血漿葉酸和維生素B12(美國Beckman公司)。使用試劑盒(Horiba ABX，MontPellier，F(xiàn)rance)對總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、三酰甘油、肌酐和促甲狀腺激素(TSH)水平進(jìn)行檢測。

1.5MT6FR C677T基因分型

1.5.1MTHFR基因PCR擴(kuò)增及純化 PCR引物：C677T上游引物序列：5′-GCCTCAAAGAAAAGCTGCGTGAT-3′；C677T下游引物序列：5′-CCCAGTCCCTGTGGTCTCTTCA-3′。PCR擴(kuò)增：PCR總反應(yīng)體系為20 μl，包含1×GC緩沖液，3.0 mmol Mg2+，0.3 mmol脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)，1 U高保真Taq聚合酶(Qiagen，北京)，1 μl樣本DNA和2 μl多重PCR引物。PCR循環(huán)程序：95℃預(yù)變性2 min； 94℃ 20 s、60℃循環(huán)40 s、72℃ 90 s，共11個(gè)循環(huán)；94℃ 20 s，59℃ 30 s，72℃ 90 s，共24個(gè)循環(huán)；72℃延伸2 min；4℃恒溫。

1.5.2多重堿基延伸SNP分型技術(shù)(SNaPshot) C677T延伸引物：5′-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-TTTTGCTGCGTGATGATGAAATYG-3′。延伸反應(yīng)體系(10 μl)包括5 μl SNaPshot多重反應(yīng)試劑盒(ABI)，2 μl純化后多重PCR產(chǎn)物，1 μl延伸引物混合物，2 μl超純水。

1.6統(tǒng)計(jì)分析 采用Statistica6.0進(jìn)行t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)、協(xié)方差分析(ANCOVA)。在ANCOVA分析中，通過shaPiro-wilks檢驗(yàn)得出殘差服從正態(tài)分布。通過單因素方差分析評價(jià)患者和對照組血漿HCY和IMT的差異(根據(jù)MTHFR基因型或臨床診斷分組)。采用Bonferroni校正法對各ANCOVA和單向方差分析進(jìn)行事后分析。通過Pearson積矩系數(shù)的計(jì)算，對患者及對照組進(jìn)行了生化參數(shù)、年齡、IMT和MMSE的相關(guān)分析。線性回歸分析，根據(jù)常規(guī)血管危險(xiǎn)因素、TT677MTHFR和血漿HCY的存在與否對IMT進(jìn)行回歸。隨后，這些假定的預(yù)測因子和IMT被納入另一個(gè)以MMSE為因變量的回歸設(shè)計(jì)中。為了評估IMT是否是與認(rèn)知能力下降相關(guān)的中間因素，采用漸進(jìn)分布自由Gramian程序進(jìn)行了結(jié)構(gòu)方程建模(SEM)，將傳統(tǒng)的血管危險(xiǎn)因素和TT677MTHFR作為外生變量，并將HCY血漿水平、IMT和MMSE作為內(nèi)生變量。

2 結(jié) 果

2.1兩組基線資料比較 兩組年齡、性別、血脂異常、高血壓、糖尿病、三酰甘油、LDL-C、總膽固醇、維生素B12、肌酐和TSH水平等方面比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。病例組MMSE評分、葉酸水平顯著低于對照組(P<0.05)，IMT和HCY濃度顯著高于對照組(P<0.05)。見表1。

2.2MTHFR基因C677T位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分布 兩組MTHFR基因C677T位點(diǎn)TT基因型和T等位基因分布差異顯著(P<0.05)。采用χ2檢驗(yàn)分別計(jì)算C677T位點(diǎn)基因型頻率在兩組間的分布，結(jié)果均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，吻合度檢驗(yàn)良好。見表2。

2.3兩組HCY、IMT與MMSE評分的相關(guān)性 控制年齡的情況下，IMT值和血漿HCY均與MMSE評分呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.74，P<0.001;r=-0.70，P<0.001)。見圖1。

表1 兩組一般資料比較

表2 兩組MTHFR基因C677T位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分布比較〔n(%)〕

圖1 年齡調(diào)整后HCY、IMT與MMSE評分的相關(guān)性

2.4MTHFR基因C677T位點(diǎn)不同基因型血漿HCY和IMT水平 校正年齡和血漿葉酸后，單因素方差分析顯示，兩組血漿HCY和IMT差異顯著(P<0.05)。病例組MTHFR TT677基因型血漿HCY和IMT含量顯著最高。見表3。

表3 MTHFR不同基因型血漿HCY和IMT水平

與對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01

2.5認(rèn)知障礙患者的IMT、高血壓、MTHFR TT677基因型、HCY與MMSE評分、IMT的關(guān)系 在認(rèn)知障礙患者中，簡單線性回歸顯示IMT和MMSE評分與血漿HCY(均β=0.58、0.72；均P<0.001)、TT677MTHFR基因型(β=0.49、0.58，均P<0.001)和高血壓(β=0.35、P<0.001，β=0.28、P=0.030)顯著相關(guān)。這些變量包括在多元回歸模型中，該模型證實(shí)了血漿HCY、TT677MTHFR基因型和高血壓與IMT之間存在顯著相關(guān)性。多重回歸顯示，血漿HCY和TT677 MTHFR基因型對MMSE評分有顯著影響，而高血壓則顯示出臨界相關(guān)性。在該回歸模型中加入IMT后，其他預(yù)測變量的部分回歸系數(shù)也隨之減少，提示其可能是一種中間因子。見表4。

表4 多元回歸分析認(rèn)知障礙患者的IMT、高血壓、MTHFR TT677基因型、HCY與MMSE評分、IMT的關(guān)系

1)線性回歸系數(shù)R2=0.63，調(diào)整后的擬合系數(shù) =0.38。2)線性回歸系數(shù)R2=0.75，調(diào)整后的擬合系數(shù)=0.54

2.6線性方程模型分析IMT、高血壓、MTHFR TT677基因型、HCY與MMSE評分的相關(guān)性 IMT對認(rèn)知的影響與所有預(yù)測因子的預(yù)測值有關(guān)。此外，對擬合優(yōu)度的檢查顯示，觀察到的相關(guān)矩陣與預(yù)期的相關(guān)矩陣之間沒有顯著差異(χ2=0.85，df=2，P=0.650；RMS標(biāo)準(zhǔn)化殘差=0.02)。由于在簡單回歸分析中，血脂異常和糖尿病與IMT(分別為β=0.03、P=0.784和β=0.10、P=0.342)和MMSE評分(分別為β=0.01、P=0.764和β=-0.08、P=0.457)無顯著相關(guān)性，因此它們不包括在兩個(gè)多重回歸模型中，也不包括在線性方程模型分析中。

3 討 論

本研究的主要發(fā)現(xiàn)是HHCY與認(rèn)知功能障礙嚴(yán)重程度和IMT有關(guān)。與非攜帶者相比，攜帶MTHFR TT677基因型的患者的這種相關(guān)性更強(qiáng)。HHCY是心腦血管疾病的一個(gè)眾所周知的危險(xiǎn)因素〔10，11〕。盡管有一些有爭議的研究結(jié)果，但大量的橫斷面研究表明，血漿HCY升高也是認(rèn)知障礙〔12〕和AD〔3〕的危險(xiǎn)因素。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)還證實(shí)了認(rèn)知障礙與HHcy之間的關(guān)系。HHCY的小鼠在Morris水迷宮測試中顯示出顯著的認(rèn)知障礙，同時(shí)微血管中β淀粉樣蛋白(Aβ)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白含量顯著升高，而Aβ對認(rèn)知有極大損害作用〔5，13〕。在伴有Willis多邊形動(dòng)脈粥樣硬化的AD患者中觀察到與缺血性病變無關(guān)的神經(jīng)炎斑塊的面積增加〔14〕。這些發(fā)現(xiàn)與神經(jīng)放射學(xué)研究一致，證明了存在輕微腦血管損傷的情況下，血漿HCY與整個(gè)大腦和顳部萎縮之間的關(guān)系，而不僅僅是神經(jīng)元數(shù)量的丟失〔15，16〕。此外，在冠心病患者中，高水平的HCY與腦N-乙酰-天冬氨酸(一種神經(jīng)損傷的特殊標(biāo)志物)濃度的降低有關(guān)，這表明HCY具有直接的神經(jīng)毒性作用〔17〕。

本研究還表明，即使在控制了年齡，其他心血管危險(xiǎn)因素和肌酐、葉酸、維生素B12水平等潛在混雜因素后，TT677 MTHFR基因型也可通過增加血漿HCY對IMT發(fā)揮作用。新疆維吾爾族T677 MTHFR等位基因的頻率低于其他民族和國家的人群〔18〕。在魏亮妹等〔19〕篩選的病例中，有33.8%的人群攜帶 MTHFR基因TT677基因型。本研究在31.7%的患者中確定了MTHFR TT677基因型，與Passaro等〔20，21〕的結(jié)果一致：意大利老年婦女IMT與TT677 MTHFR基因型相關(guān)的增加，并且Meta分析也同樣證明了具有此基因型的受試者IMT增加。

本研究觀察到高血壓與MMSE評分之間存在顯著的相關(guān)性，但與IMT升高無直接相關(guān)性。橫斷面研究顯示，高血壓與認(rèn)知障礙之間的關(guān)系有著相互矛盾的結(jié)果〔22〕。本研究顯示，對患者簡單線性回歸分析后，高血壓與MMSE有輕微的相關(guān)性。當(dāng)將高血壓與IMT、血漿HCY和TT677 MTHFR基因型一起納入多元回歸分析時(shí)，這種效應(yīng)消失。這一發(fā)現(xiàn)可以解釋為高血壓對動(dòng)脈粥樣硬化介導(dǎo)的MMSE的間接影響。線性方程模型分析進(jìn)一步支持這一假設(shè)，證明了高血壓，內(nèi)膜中層增厚程度和認(rèn)知障礙嚴(yán)重程度之間的關(guān)系。IMT增加可能是動(dòng)脈粥樣硬化的標(biāo)志，也可能是腦微循環(huán)的標(biāo)志。腦循環(huán)微環(huán)境的改變可能導(dǎo)致彌漫性低灌注和慢性缺氧，最終引發(fā)神經(jīng)退行性改變〔23〕。

在本研究中，血漿HCY和MMSE評分之間的關(guān)系由兩個(gè)偶然的聯(lián)系來解釋：(1)血漿HCY直接影響認(rèn)知狀態(tài)；(2)HCY水平對MMSE的影響部分由IMT增加對認(rèn)知能力的影響介導(dǎo)。本研究表明，MTHFR基因TT677基因型可以作為鑒定AD患者的一個(gè)因素。HHCY具有直接的神經(jīng)毒性，并可能導(dǎo)致亞臨床微血管損傷，可能與神經(jīng)退行性過程在認(rèn)知功能下降的發(fā)展中相互作用。

本研究主要局限性是篩選隊(duì)列的小樣本量，盡管統(tǒng)計(jì)功率分析顯示篩選出的研究設(shè)計(jì)病例數(shù)量符合要求。此外，作為一項(xiàng)病例對照研究，無法評估HCY水平、IMT和MMSE之間的時(shí)間關(guān)系。

綜上MTHFR基因TT677基因型促進(jìn)血漿HCY的增加，這反過來可能有利于認(rèn)知障礙患者內(nèi)膜增厚。HCY可能通過多種機(jī)制促進(jìn)神經(jīng)元損傷，包括IMT增加介導(dǎo)的微血管損傷和直接的神經(jīng)毒性作用。