張?jiān)茲?馬向瑞 王松松 劉菲

(濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔科，山東 濱州 256600)

種植修復(fù)已成為當(dāng)今的主流修復(fù)方式，其中骨質(zhì)疏松的問題給種植手術(shù)及預(yù)后帶來了極大的挑戰(zhàn)。絕經(jīng)后的女性由于雌激素的降低，骨質(zhì)疏松的發(fā)生率較高〔1〕，從而影響種植修復(fù)中的骨結(jié)合。研究表明，亞麻木酚素(SDG)能提高患者體內(nèi)血清鈣含量并增加甲狀腺旁腺激素與骨的敏感性〔2〕，促進(jìn)體內(nèi)新骨的形成，減少骨質(zhì)的流失〔3〕。因此，通過本實(shí)驗(yàn)觀察SDG對(duì)成骨細(xì)胞的增殖分化及護(hù)骨素(OPG) mRNA表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1主要器材和材料 激光掃描共聚焦顯微鏡(TCS SPE，Leica，德國(guó))；紫外-可見光分光光度計(jì)( Eppendorf，德國(guó))；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scientific，美國(guó))；酶標(biāo)儀(Thermo lab systems multiskan mk3，美國(guó))；熒光實(shí)時(shí)定量-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀(Rotor-Gene 3000，Corbett，澳大利亞)；α-MEM 培養(yǎng)液(Hyclone)；噻唑藍(lán)(Sigma，美國(guó) )；SDG(美侖生物meilunbio?)；堿性磷酸酶(ALP)檢測(cè)試劑盒(碧云天)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser)；總RNA 提取試劑(RNAiso Plus)；PCR試劑盒(Takara，日本)；Rhodamine Phalloidin(Cytoskeleton，美國(guó))。

1.2MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng) 由華西口腔醫(yī)學(xué)院贈(zèng)送。用含 10%胚牛血清(FBS)，青霉素 100 U/ml，鏈霉素100 μg/ml的α-MEM培養(yǎng)液，置于37℃、5% CO2的環(huán)境中培養(yǎng)，取3 次傳代后處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3不同濃度梯度SDG培養(yǎng)液的配制 配制含SDG培養(yǎng)液：0、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L，共6個(gè)濃度組。

1.4噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)成骨細(xì)胞增殖 將MC3T3-E1細(xì)胞接種于96孔板，密度為5×104個(gè)/ml，每孔加200 μl細(xì)胞懸液，設(shè)3個(gè)復(fù)孔；細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，更換為含SDG濃度為0、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L的培養(yǎng)液；培養(yǎng)1 d、2 d、3 d時(shí)，每孔加入濃度為5 mg/ml MTT 20 μl及無血清培養(yǎng)基100 μl，要求在避光環(huán)境下進(jìn)行。5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中孵育4 h，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，置搖床上低速振蕩10 min，取下96孔板在酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處測(cè)量各孔的吸光值(A值)，同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔。

1.5ALP活性檢測(cè) 以 3×104個(gè)細(xì)胞/ml的密度接種于6孔板，毎孔1 ml細(xì)胞懸液，每組設(shè)3復(fù)孔，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，更換為含SDG濃度為0、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L的培養(yǎng)液，培養(yǎng)3、7、14 d，每孔加入細(xì)胞裂解液200 μl，裂解后離心機(jī)離心取上清液，參照ALP試劑盒說明書操作剩余步驟，設(shè)定酶標(biāo)儀405 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其A值。

1.6RT-qPCR 檢測(cè)細(xì)胞OPG mRNA 的表達(dá) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MC3T3細(xì)胞計(jì)數(shù)為3×104/ml的混懸液接種在6孔板，每孔添加2 ml，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，24 h細(xì)胞充分貼壁后，更換為含SDG濃度為0、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L的培養(yǎng)基，細(xì)胞培養(yǎng)3 d后提取，分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA純度，結(jié)果顯示各組 A260/A280值均在1.7～2.1之間，參照說明書合成 cDNA。內(nèi)參GADPH及OPG 引物的合成見表1，RT-qPCR 反應(yīng)采用熒光染料法(參照寶生物染料法熒光定量試劑盒SYBR Premix Ex Taq 說明)，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30 s，1個(gè)循環(huán)；95℃變性5 s，60℃退火30 s，45個(gè)循環(huán)。選擇20 μl體系：SYBRⅡ 10 μl，上游引物下游引物各0.8 μl，RT反應(yīng)液1.6 μl，焦碳酸二乙酯(DEPC)水，6.8 μl。收集熒光信號(hào)進(jìn)行分析，使用熒光閾值表示RT-qPCR 結(jié)果，定義對(duì)照組基因表達(dá)量為1，根據(jù)公式(2-ΔΔCt)計(jì)算目的基因表達(dá)量，獲得每組基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 RT-qPCR 引物序列

1.7細(xì)胞骨架染色 24孔板中接種處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，并制作細(xì)胞爬片，每孔置密度為5×104個(gè)/ml的細(xì)胞懸液1 ml，細(xì)胞貼壁后，更換為含SDG濃度為0、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L的培養(yǎng)液，設(shè)置3復(fù)孔，孵育24 h后，去除原培養(yǎng)液后磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，4%多聚甲醛固定10 min，再次清洗3次，每次10 min。200 μl濃度為100 nmol/L的Rhodamine Phalloidin覆蓋爬片，避光環(huán)境下室溫孵育30 min后充分沖洗3次，每次5 min，抗熒光淬滅封片，置于激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀察爬片。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1MTT法檢測(cè)成骨細(xì)胞增殖情況 與空白組比較，10-5mol/L組細(xì)胞在1、2 d時(shí)增殖受到抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，3 d時(shí)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；10-6mol/L與10-9mol/L組均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；10-7mol/L組、10-8mol/L組顯著增加(P<0.05)，見表2。

表2 不同濃度SDG對(duì)MC3T3增殖的影響

與空白組對(duì)比:1)P<0.05;下表同

2.2ALP活性測(cè)定 與空白組比較，10-7、10-8mol/L組ALP活性顯著增高(P<0.05)，其中10-7mol/L組ALP最高；10-5mol/L組ALP活性顯著降低(P<0.05)，10-6、10-9mol/L兩組ALP活性無明顯變化(P>0.05)，見表3。

表3 不同濃度SDG對(duì)ALP的影響

2.3OPG mRNA表達(dá)情況 與空白組(1.00±0.04)比較：10-5mol/L組OPG表達(dá)水平(0.75±0.04)顯著下調(diào)(P>0.05)，10-6、10-7mol/L組OPG mRNA表達(dá)水平(1.50±0.10，2.25±0.12)顯著上升(P<0.05)，10-8、10-9mol/L組DPG mRNA表達(dá)水平(1.25±0.18、1.22±0.03)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4細(xì)胞骨架形態(tài)的染色 10-5mol/L組細(xì)胞伸展面積較小，內(nèi)部結(jié)構(gòu)層疊不清晰，肌動(dòng)蛋白纖維不甚清晰，10-9～10-6mol/L組，隨著濃度的升高，細(xì)胞伸展面積增大，細(xì)胞骨架的內(nèi)部結(jié)構(gòu)更為清晰。其中10-7、10-6mol/L兩組中可清晰看見纖維走行及細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)。見圖1。

圖1 不同濃度SDG作用24 h對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞骨架形態(tài)的影響(激光掃描共聚焦顯微鏡，× 400)

3 討 論

有資料表明，60 歲以上中老年絕經(jīng)后女性成為骨質(zhì)疏松的高危人群，其發(fā)病率約為67.80%，而老年女性則高達(dá)82.30%〔4〕，由于此類群體處于絕經(jīng)期，體內(nèi)雌性激素分泌降低，最終導(dǎo)致骨的流失。目前臨床上常用雌激素類藥物治療及預(yù)防骨質(zhì)疏松，然而此類藥物存在明顯的副作用，而且長(zhǎng)期使用會(huì)增加子宮內(nèi)膜癌和乳腺癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)〔5〕。植物雌激素是一類來源于植物的化合物，常以糖苷的形式存在植物中，在結(jié)構(gòu)和功能上與甾體類激素相似，具有弱雌激素活性作用〔6，7〕。SDG與雌激素結(jié)構(gòu)十分相似，相關(guān)研究認(rèn)為其對(duì)雌激素依賴性疾病骨質(zhì)疏松有預(yù)治作用〔8，9〕。因此用毒副作用小的天然植物替代雌激素藥物，對(duì)于治療骨質(zhì)疏松成為新的療法。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明SDG低濃度時(shí)能增進(jìn)成骨細(xì)胞的活性，在高濃度時(shí)抑制其活性，與李高舜等〔10〕通過實(shí)驗(yàn)所得結(jié)論基本一致。

新的骨質(zhì)形成及鈣化的發(fā)生需要ALP的存在〔11〕。ALP活性代表了細(xì)胞分化的能力，ALP活性越高成骨細(xì)胞的分化能力越強(qiáng)。本研究中SDG培養(yǎng)液可以促進(jìn)成骨細(xì)胞ALP的表達(dá)活性，說明低濃度時(shí)能增進(jìn)成骨細(xì)胞的活性，與李高舜等〔10〕的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。

研究表明，OPG起到了防止骨質(zhì)吸收發(fā)生的作用〔12〕。成骨細(xì)胞中存在著大量OPG，隨著成熟細(xì)胞分化成熟而相應(yīng)的增加。因此OPG的表達(dá)可以反映成骨能力。本研究表明，中低濃度SDG能夠促進(jìn)護(hù)骨素基因水平的表達(dá)，對(duì)成骨細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用，高濃度時(shí)抑制其基因水平的表達(dá)〔13〕。

高濃度SDG可明顯地抑制成骨細(xì)胞增殖、成骨相關(guān)基因的表達(dá)及細(xì)胞伸展黏附，SDG濃度為10-7、10-6mol/L可促進(jìn)細(xì)胞增殖、成骨相關(guān)基因的表達(dá)及細(xì)胞伸展黏附，提示合適濃度的SDG可能促進(jìn)種植體的骨結(jié)合，提高種植成功率。