季 慧

(臨沂大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，臨沂 276000)

花生分離蛋白(peanut protein isolate, PPI)，因其蛋白質(zhì)含量較高，其功能性質(zhì)與花生蛋白相比有一定的提高，但是和大豆分離蛋白[1]相比，溶解性、乳化性和凝膠性等仍然較差，在一定程度上限制了花生分離蛋白在食品工業(yè)中的應(yīng)用?；ㄉ蛛x蛋白組分中，75%的為花生球蛋白，由于花生球蛋白的堿性亞基具有很強(qiáng)的疏水結(jié)構(gòu)[2]，導(dǎo)致花生分離蛋白的溶解性較差，同時(shí)是花生分離蛋白功能性較差的主要原因之一。如何破壞花生分離蛋白分子的表面疏水結(jié)構(gòu)，提高花生分離蛋白的溶解性，是當(dāng)前提高花生產(chǎn)業(yè)資源附加值和延長花生產(chǎn)業(yè)鏈的關(guān)鍵技術(shù)問題。

介質(zhì)阻擋放電(Dielectric Barrier Discharge，DBD)是當(dāng)前低溫非平衡等離子體研究的一個(gè)熱點(diǎn)[3]。低溫等離子由于在放電過程中產(chǎn)生臭氧，已廣泛用于廢水的處理。介質(zhì)阻擋放電等離子體用于廢水處理時(shí)其作用機(jī)理一般認(rèn)為是：低溫等離子產(chǎn)生的高能粒子轟擊水溶液，水分子發(fā)生電離反應(yīng)生成高活性游離態(tài)氧、羥基自由基及臭氧等，這些活性基團(tuán)能夠攻擊廢水中有機(jī)物使其分解為小分子物質(zhì)，此外，臭氧的氧化及紫外線的吸收作用也會(huì)照成污染物的降解[4, 5]。

近年來，CP對(duì)蛋白質(zhì)改性一直是研究的熱點(diǎn)。Takai以溶菌酶為模型，研究了低溫常壓等離子體蛋白在水溶液中的化學(xué)效應(yīng)。等離子體處理降低了酶活性，改變了溶菌酶的分子量和化學(xué)修飾的分子量[6]。Misra采用低溫等離子對(duì)面粉進(jìn)行研究，利用FTIR光譜學(xué)對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果表明了在強(qiáng)和弱的小麥面粉中，β-折疊的減少和α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角含量的增加[7]。Segat對(duì)低溫等離子處理乳清蛋白溶液進(jìn)行研究，研究了低溫等離子體與乳清蛋白分離模型溶液的相互作用。結(jié)果表明，在等離子體處理15 min后，乳清蛋白質(zhì)中發(fā)生輕度氧化。羰基含量和表面的疏水性增加，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)在一定程度上展開[8]。Dong 采用等離子體處理降低了玉米醇溶蛋白膠束的平均直徑并增加了玉米醇溶蛋白在中性和酸性水溶液中的溶解度[9]。 然而，有關(guān)CP技術(shù)改性花生分離蛋白的研究很少。

本研究采用低溫等離子技術(shù)處理花生分離蛋白溶液，研究低溫等離子對(duì)花生分離蛋白溶解行為的影響，探求等離子作用花生分離蛋白分子機(jī)理，以期為低溫等離子改性蛋白提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

低溫花生粕；血清白蛋白;其他試劑都是分析純級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

DBD-50低溫等離子體；F-4600熒光分光光度計(jì)；PQ001核磁共振分析儀；傅里葉變換紅外光譜NicoletiS50。

1.3 方法

1.3.1 花生分離蛋白的制備

低溫脫脂花生粉與蒸餾水 1∶10 (g∶m L)混合，以1 mol/L Na OH 調(diào)節(jié)體系pH 值至 8. 0，在室溫下攪拌提取 2 h，4 000 r/min 離心15 min，取上清液，以 1 mol/L HCL調(diào)節(jié)體系 pH 值至4.5產(chǎn)生沉淀，將沉淀溶解在蒸餾水中。以 1mol/L NaOH 調(diào)節(jié)體系 pH 值至 7.0，用透析袋在 4 ℃條件下透析24 h。真空冷凍干燥，得到花生分離蛋白，于4 ℃ 條件下保存?zhèn)溆肹13]。PPI的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 83.0% (凱氏常數(shù)5.46)。

1.3.2 低溫等離子(CP)處理樣品處理

用0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液(PBS)(7.0)配成1%的花生分離蛋白溶液，取10 mL 花生分離蛋白溶液放入介質(zhì)阻擋DBD-50 反應(yīng)器中處理，在預(yù)試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取等離子放電功率為70 W, 處理時(shí)間為0、1、2、3、4 min 對(duì)花生分離蛋白溶液進(jìn)行放電處理。處理后的樣品一部分直接用于測(cè)定，另一部分真空冷凍干燥后備用。低溫等離子體示意圖如圖1所示。

圖1 低溫等離子系統(tǒng)簡易示意圖

1.3.3 溶解度測(cè)定

根據(jù)Kong等[10]的方法，將低溫等離子處理后花生蛋白溶液在3 000 r /min下離心15 min。取1 mL上清液加入4 mL雙縮脲試劑，旋渦充分混合。反應(yīng)30 min后，在540 nm下測(cè)定溶液的吸光度，不添加花生分離蛋白的樣品為空白。

1.3.4 凝膠的制備

將CP處理后的花生分離蛋白用含有 0.06 mol/L CaCl2，0.1 mol/L PBS(pH值 7.0)中充分溶解，將其濃度調(diào)至 150 mg/mL 后，分別稱取 50 g的蛋白液于100 mL燒杯中，用保鮮膜密封，放入90 ℃水浴鍋中保溫 60 min 后，立即取出冷水浴后，于4 ℃冰箱中放置24 h后，進(jìn)行后續(xù)指標(biāo)測(cè)定。

凝膠持水性測(cè)定：稱取蛋白凝膠樣品 5 g 左右，于 15 mL 干燥并已稱重的離心管(記離心管的質(zhì)量為W0)中，凝膠樣品和離心管的總質(zhì)量為W1。8 000 r/min 離心15 min，將析出的水倒掉，并使用濾紙吸取殘留的水分后，稱重并記錄此時(shí)凝膠樣品和離心管的總質(zhì)量(W2)。凝膠持水能力(WHC)采用公式計(jì)算：

(1)

核磁共振分析：采用低場(chǎng)核磁共振技術(shù)(LF- NMR)測(cè)定凝膠樣品的橫向弛豫時(shí)間T2，測(cè)定條件：質(zhì)子共振頻率為22.6 MHz，測(cè)量溫度為32 ℃。取花生蛋白凝膠直接放入直徑25 mm 核磁管中，隨后立即放入PQ-001 核磁共振儀中進(jìn)行分析。采用Carr-Purcell-Meiboom-Gill(CPMG)脈沖序列進(jìn)行自旋-自旋弛豫時(shí)間 T2、T2峰面積比的測(cè)定。參數(shù)設(shè)定：Tw=2 000 ms; NS=8; NECH=10 000。

1.3.5 蛋白光譜分析

蛋白紫外吸收光譜分析： 2 mg/ml 樣品在 200～400 nm 波長范圍內(nèi)掃描，截取蛋白樣品的紫外吸收光譜值(250～300 nm)進(jìn)行分析。

表面疏水性：將2 mg/mL樣品溶液用0.1 mol/L，pH 7.0的磷酸鹽緩沖液分別稀釋至0.05、0.1、0.2、0.5、1 mg/mL濃度，每種濃度下分別取 4 mL 樣品溶液加入 20 μL ANS。在 390 nm 激發(fā)波長和 470 nm 發(fā)射波長下記錄各樣品溶液的熒光強(qiáng)度，狹縫寬度均為 5 nm。以熒光強(qiáng)度對(duì)樣品濃度作圖，曲線的初始斜率即為蛋白質(zhì)的表面疏水性(H0)[11]。

1.3.6 巰基基團(tuán)含量的測(cè)定

參照Beveridge 等[12]的Ellman 試劑分析方法。加4 mg DTNB 試劑于1 mL的 Tris-甘氨酸緩沖液(0.086 mol/L Tris，0.09 mol/L 甘氨酸，4mmol/L EDTA，pH8.0)中，配成Ellman 試劑。分別稱取15 mg樣品溶于5 mL的Tris-甘氨酸-8 mol/L尿素緩沖液(測(cè)游離SH)和Tris-甘氨酸緩沖液(測(cè)暴露SH)中，漩渦震蕩，加入50 μL Ellman試劑，將懸浮液置于室溫下保溫1 h，以未加蛋白混合液為空白，測(cè)定412 nm 處吸光值(A412)。

(2)

式中：A412為421 nm處的吸光值；C為樣品質(zhì)量濃度/mg/mL；D為樣品稀釋倍數(shù)。

1.3.7 熱穩(wěn)定性測(cè)定

花生分離蛋白的熱力學(xué)特性主要采用DSC來測(cè)定，將經(jīng)過等離子處理的花生分離蛋白凍干，過 100 目篩后備用。稱取花生分離蛋白粉 3～ 5 mg 放置在坩堝中，置于固體壓樣機(jī)壓制密封，以空坩堝作為空白對(duì)照，設(shè)置掃描范圍為 30～200 ℃，升溫速度為10 ℃/min。并采用 TA-60WS 軟件讀取DSC譜圖中樣品的變性溫度(Td)、焓變(ΔH)。

1.3.8 能譜測(cè)定

采用能譜儀(Energy Dispersive Spectrometer， EDS)分別對(duì)CP處理前后的花生分離蛋白表面元素的種類及含量進(jìn)行測(cè)定，將樣品置于與SEM連接的能譜儀中，每個(gè)樣品隨機(jī)選擇5個(gè)區(qū)域進(jìn)行能譜掃描，元素含量取平均值。

1.3.9 傅里葉紅外光譜分析

準(zhǔn)確稱量 0.001 g 花生分離蛋白樣品，加入一定量的KBr至0.15 g，用研缽研磨成均勻粉末，壓制成薄片，用傅里葉紅外光譜儀做全波段掃描 (4 000～400 cm-1) ，掃描次數(shù)為32[13]。每個(gè)樣品做3次平行實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 CP處理對(duì)花生分離蛋白溶解性影響

從圖2可以看出，隨著CP處理時(shí)間的延長，PPI溶液的pH值即使在0.1 mol/L PBS在(pH值7.0)中逐漸降低(P<0.05), pH從6.92(0 min)下降到6.80(4 min)，這一結(jié)果與Segat等[8]報(bào)道的結(jié)果類似。pH下降的原因可以解釋為低溫等離子在放電過程中會(huì)產(chǎn)生大量的高能粒子使氧分子電離單分子氧，使NO 氧化成 NO2，生成亞硝酸(HNO2)和硝酸(HNO3)，以及水分子與過氧化氫(H2O2)在空氣或液體中反應(yīng)生成酸性H3O+離子，產(chǎn)生的酸性H3O+離子超出了緩沖液的緩沖范圍。

隨著CP處理時(shí)間的延長，花生分離蛋白的溶解度顯著增加(P<0.05)，在處理3 min時(shí)，花生分離蛋白的溶解度達(dá)到最大，與未處理相比，PPI溶液的溶解度提高了13.4%。隨后略有下降(圖2)，等離子處理前3 min內(nèi)，花生分離蛋白溶液pH值從6.92降至6.80 (花生蛋白的等電點(diǎn)約為5，pH>5后，花生蛋白溶液的溶解度隨著pH值的降低而降低)[14]?；ㄉ鞍兹芤旱娜芙舛戎饾u增加，可能是由于CP處理促使花生蛋白表面結(jié)構(gòu)被破壞，親水基團(tuán)暴露，親水性增加，從而加速了蛋白質(zhì)與水分子的親和力，提高蛋白溶解度。處理3 min后花生分離蛋白溶液溶解度下降，可能是由于隨著處理時(shí)間的增加，高能粒子的持續(xù)放電處理使蛋白分子之間交聯(lián)，活性位點(diǎn)減少，導(dǎo)致溶解度降低。

圖2 不同低溫等離子處理時(shí)間對(duì)花生蛋白溶解度及pH影響

2.2 PPI凝膠化性能

2.2.1 PPI凝膠持水能力(WHC)

圖3 不同低溫等離子處理時(shí)間對(duì)花生分離蛋 白熱誘導(dǎo)凝膠的持水力(WHC)的影響

持水能力是熱致蛋白凝膠最重要的功能特性之一。大量的水、脂肪和其他食物成分可能會(huì)進(jìn)入凝膠結(jié)構(gòu)[15]。CP處理后氯化鈣(CaCl2)誘導(dǎo)的PPI凝膠體系的WHC如圖3所示。在2 min內(nèi)，在隨著低溫等離子處理時(shí)間的延長，蛋白凝膠持水性顯著增加，這可能是由于低溫等離子處理花生分離蛋白，導(dǎo)致其表面結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，親水基團(tuán)的增加，結(jié)合水的能力增強(qiáng)。隨后隨CP處理時(shí)間的增加而減少。處理后的樣品WHC在2 min時(shí)達(dá)到最大值，比未處理時(shí)增加6.96%。2 min后CaCl2誘導(dǎo)的PPI凝膠的WHC逐漸下降。WHC趨勢(shì)與PPI溶液溶解度趨勢(shì)一致?？傮w而言，所有處理過的樣品的WHC都高于未處理樣品。

2.2.2 核磁共振分析

從圖4可以看出，花生蛋白凝膠的T2在0.1～2 000 ms的弛豫時(shí)間分布上均出現(xiàn)了3 種峰，分別用T2b、T21和T22表示，其水分分布與豆腐相似[16],分別對(duì)應(yīng)于樣品中水分的3種狀態(tài)結(jié)合水T2b、不易流動(dòng)水T21和自由水T22。T21對(duì)應(yīng)凝膠中的不易流動(dòng)水。不易流動(dòng)水均占絕大部分，這可能是因?yàn)樵诩訜岬淖饔孟?，花生分離蛋白分子發(fā)生變性，經(jīng)分子間和分子內(nèi)相互作用交聯(lián)凝聚，反應(yīng)過程中與體系中的水通過化學(xué)鍵合而形成凝膠三維空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，而且體系中的自由水吸附填充在凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中，轉(zhuǎn)變?yōu)椴灰琢鲃?dòng)水。隨著CP處理時(shí)間的延長，T21比例顯著提高，從76.28%(0 min)增加到80.98%(2 min)，說明CP處理可以明顯增加蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò)表面的水基團(tuán)數(shù)量,該結(jié)果與WHC結(jié)果相一致。

圖4 低溫等離子處理后花生蛋白凝膠水分子的T2弛豫特性

2.3 光譜變化分析

2.3.1 花生分離蛋白紫外光譜變化

圖5 低溫等離子處理對(duì)花生分離蛋白紫外吸收光譜影響

CP處理對(duì)PPI紫外吸收光譜影響如圖5所示，從圖5中可以看出，PPI的紫外吸收曲線在波長209～212 nm和275～280 nm處有兩個(gè)吸收峰。波長209～212 nm的峰通常被看作是肽鏈。275～280 nm處的峰則是典型的芳香族氨基酸的吸收峰，特別是色氨酸和酪氨酸。CP處理后，275～280 nm處的吸收峰沒有明顯的偏移(藍(lán)移或紅移)，說明CP處理沒有引起PPI的主體結(jié)構(gòu)的改變。花生蛋白紫外吸收光譜的吸光度隨著CP處理時(shí)間的延長呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)，CP 處理3 min時(shí)，光譜吸光度最大?？赡艿脑蚴荂P產(chǎn)生的高能粒子轟擊花生蛋白使蛋白的表面結(jié)構(gòu)打開，緊密結(jié)構(gòu)變疏松，表面生色基團(tuán)暴露從而引起蛋白紫外吸光度增加。隨著處理時(shí)間進(jìn)一步延長，高能粒子的持續(xù)放電使部分蛋白交聯(lián)，生色基團(tuán)重新被包埋，紫外吸收光譜的吸光度降低。

2.3.2 表面疏水性

CP處理前后PPI表面疏水性結(jié)果如表1所示，H0代表蛋白質(zhì)表面與極性水環(huán)境接觸的疏水基團(tuán)數(shù)量的指數(shù)。由表2可以看出，隨著CP處理時(shí)間的延長，PPI表面疏水性逐漸降低，H0從6 607.8 (0 min) 降低到4 568.8(4 min), 降低了30.86%。PPI表面疏水性的逐漸降低揭示了花生蛋白分子間疏水性相互作用的減少，親水性相互作用的增加，使得花生蛋白溶液親水性增加。PPI表面疏水性下降的原因可是由于等離子處理后，高能粒子的轟擊，表面結(jié)構(gòu)被氧化刻蝕，表面活性位點(diǎn)被激發(fā)，引起大量水分子或水膠束與活性位點(diǎn)相結(jié)合，阻礙了內(nèi)部疏水基團(tuán)與熒光探針的結(jié)合，故表面疏水性降低。

2.4 總游離巰基及暴露巰基的變化

CP處理可能引發(fā)不同的氨基酸側(cè)鏈的變化, 如—SH基團(tuán)。由于半胱氨酸殘基具有極高的敏感性[17-19]，芳香型和含硫氨基酸側(cè)鏈尤其容易氧化。CP處理后游離巰基變化如表1所示。CP處理后，總巰基含量逐漸減少，暴露巰基逐漸增加，處理3min時(shí)，總巰基含量與未經(jīng)處理的花生分離蛋白相比，降低了50%左右，隨后總巰基含量有小幅增加。總巰基的減少可能使由于低溫等離子產(chǎn)生一些氧化劑(O3·，H2O2等)，使—SH被氧化成—S—S[20]。總巰基的小幅增加是由于高能粒子持續(xù)轟擊使生成的—S—S斷裂重新生成—SH。暴露巰基含量隨CP處理時(shí)間的延長先增加后降低，是由于CP處理使蛋白分子表面結(jié)構(gòu)打開，包埋在分子內(nèi)部的巰基暴露，故暴露巰基含量增加。隨著處理時(shí)間的延長，溶液總的蛋白膠束發(fā)生聚集，巰基重新被包埋。該結(jié)果與PPI紫外吸收光譜結(jié)果相一致。

表1 表面疏水性指數(shù)、游離巰基(總巰基、暴露巰基)變化

注：采用 Duncan’s multiple range test 方法分析，同列小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)，余同。

2.5 PPI熱力學(xué)分析

差示掃描量熱法(DSC)是研究蛋白質(zhì)穩(wěn)定性熱力學(xué)的一項(xiàng)強(qiáng)有力的技術(shù)。它提供了蛋白質(zhì)變性的基本參數(shù)[21, 22]，并被應(yīng)用于各種其他的食物系統(tǒng)[23, 24]。

CP處理后，PPI的熱穩(wěn)定性參數(shù)變化如表2所示。變性溫度(Td)反映了蛋白的熱穩(wěn)定性和聚集程度。從表3可以看出，CP處理2 min后，Td的值從85.07下降到82.53 ℃，表明CP處理后PPI的熱穩(wěn)定性降低。分子間作用力減弱，花生蛋白聚集程度降低。PPI的焓值(ΔH)與蛋白的疏水相互作用有關(guān)[25]。CP處理后，ΔH呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，CP處理2 min后ΔH降到87.80 J/g，說明CP處理后花生蛋白間的PPI疏水相互作用減少，親水性相互作用增加，這一結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了PPI表面疏水性的結(jié)果。

表2 PPI熱力學(xué)參數(shù)變化

2.6 能譜分析

采用能譜儀對(duì)CP處理前后的花生分離蛋白表面的元素進(jìn)行了測(cè)定，并對(duì)其主要元素(C、N、O、S)進(jìn)行了歸一化。表3表示了PPI的表面元素圖譜和元素相對(duì)百分含量。表3可以看出，隨著CP處理時(shí)間的延長，氧元素含量顯著增加，碳、氮元素含量有所降低。CP處理2 min時(shí)蛋白表面氧元素達(dá)最高，為39.55%，與未處理相比，氧元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加了42.27%。 氧元素含量增加可能是由于高能粒子通過能量傳遞給蛋白表面引發(fā)化學(xué)反應(yīng)，引入一些含氧基團(tuán)至蛋白表面，如—COOH、—CO、—OH等親水基團(tuán)增加了蛋白表面的親水性，這與CP處理后花生蛋白的溶解性增加結(jié)果相一致；同時(shí)高能粒子中的臭氧的氧化作用使蛋白表面的C、N等元素被氧化后生成氣體[8, 26]，引起溶液pH值下降，與等離子處理后花生蛋白溶液pH值下降的結(jié)果相一致。

表3 CP體處理PPI表面元素相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%

2.7 花生分離蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)

選取紅外光譜中的酰胺Ⅰ帶(1 600～1 700 cm-1)進(jìn)行詳細(xì)研究，參照辛佩賢[27]的方法，用Omnic軟件對(duì)蛋白質(zhì)各二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行定量分析。結(jié)果如表4所示。

在CP處理的前3 min內(nèi)，β-折疊(除1 min 外)與無規(guī)則卷曲含量顯著增加，在處理3 min時(shí)，β-折疊質(zhì)量分?jǐn)?shù)比未處理時(shí)增加了7.29%；α-螺旋+β-轉(zhuǎn)角含量顯著降低。說明適當(dāng)?shù)腃P處理使花生分離蛋白表面結(jié)構(gòu)被打開，結(jié)構(gòu)由緊密變疏松，更多的活性位點(diǎn)被暴露，親水性增強(qiáng)，蛋白溶解度增加。3 min后，隨著處理時(shí)間進(jìn)一步延長，α-螺旋+β-轉(zhuǎn)角含量增加，這說明低溫等離子產(chǎn)生的高能粒子的持續(xù)放電作用使蛋白分子間交聯(lián)聚集，活性位點(diǎn)減少，親水性下降。該結(jié)果與蛋白紫外吸收光譜結(jié)果相一致。

表4 低溫等離子處理對(duì)花生分離蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

3 結(jié)論

低溫等離子技術(shù)處理有助于提高花生分離蛋白的溶解性， 與未處理相比，花生分離蛋白的溶解度和凝膠持水性分別提高了13.4%和6.96%。CP處理后，PPI由于高能粒子的轟擊，蛋白表面粗糙度增加，表面生色基團(tuán)暴露，內(nèi)源色氨酸熒光強(qiáng)度降低，表面疏水性顯著降低；蛋白表面氧元素含量顯著增加， CP處理2 min時(shí)蛋白表面氧元素達(dá)最高，與未處理相比，氧元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加了42.27%。PPI分子中α-螺旋含量減少，無規(guī)卷曲含量增加，蛋白有序結(jié)構(gòu)被破壞，PPI的表面結(jié)構(gòu)被打開，蛋白結(jié)構(gòu)由緊密變疏松。

CP處理提高PPI溶解性的原因可能是CP體產(chǎn)生的高能粒子對(duì)PPI表面進(jìn)行轟擊，蛋白表面結(jié)構(gòu)被打開，蛋白由緊密結(jié)構(gòu)變成疏松的表面親水結(jié)構(gòu)，活性位點(diǎn)被激發(fā)，大量水膠束與PPI相水合，同時(shí)，—COOH、—CO、—OH等親水基團(tuán)被引入到花生分離蛋白分子表面，蛋白表面親水性增強(qiáng)，蛋白溶解度增加。本研究結(jié)果為CP處理提高花生蛋白功能性質(zhì)提供參考。