陳文龍, 張陽陽, 張生英, 邢小勇, 胡永浩

(甘肅農業(yè)大學 動物醫(yī)學院, 蘭州 730070)

牛病毒性腹瀉是由牛病毒性腹瀉/黏膜病毒(Bovineviraldiarrheavirus/mucosalvirus, BVDV/MDV)導致的一種以急性黏膜病、持續(xù)性感染及免疫抑制為主要特征的病毒性傳染病, 臨床癥狀以高熱、出血性腹瀉及血小板減少癥為主[1].BVDV病毒嚴重影響母牛生殖、產(chǎn)奶及與牛源相關的生物制品, 如血清、抗體、凍精和疫苗等[2], 使畜牧地區(qū)經(jīng)濟損失嚴重[3].文獻[4]發(fā)現(xiàn)首例BVDV病毒(Changchun 184株), 任敏[5]首次發(fā)現(xiàn)BVDV-2型毒株.2017年我國BVDV陽性率為46.7%, 持續(xù)性感染率為2.2%[6].目前以疫苗免疫為主防控該病[7], E2可誘導機體同時產(chǎn)生細胞免疫和體液免疫[8], 是制備BVDV DNA疫苗和亞單位疫苗的首選抗原.

當病毒感染或接種滅活苗時, 動物機體主要產(chǎn)生抗E2抗體[9], 在免疫應答過程中具有重要作用[10]； 針對E2蛋白制備的多克隆抗體可結合多個病毒抗原決定簇, 與更多的BVDV毒株發(fā)生反應, 用于檢測生物制品[11].E2蛋白又稱為gP53, 位于閱讀框2077-3198 nt, 編碼374個氨基酸, 分子量為53 000, 屬于囊膜蛋白[12]； E2是BVDV 4個結構蛋白(C,E0,E1,E2)中免疫原性最好的結構蛋白, 具有中和表位, 可誘導機體產(chǎn)生中和抗體以保護機體免受病毒感染[13]； E2有5個糖基化位點和一個疏水性序列, 是BVDV的疏水結合位點及跨膜結構域, E2靠近N端部分含有多種構象依賴性抗原結構域, 其N端伸出囊膜表面, 是決定BVDV抗原性的主要部位[14].但E2基因突變概率極高, 其可變區(qū)占BVDV基因組可變區(qū)的1/3, 導致不同毒株間的免疫原差異較大, 使疫苗免疫失敗[15].E2蛋白是維持病毒周期的重要因子, 主要參與病毒的免疫逃逸, 并參與病毒與宿主細胞的識別、吸附及結合過程[16]； 重組E2蛋白可阻止BVDV感染體外培養(yǎng)的細胞[17].高欲燃等[18]利用原核表達系統(tǒng)表達E2蛋白; 吳立君[19]利用昆蟲系表達E2蛋白; 范晴等[20]利用桿狀病毒系統(tǒng)表達E2蛋白； Grigera等[21]利用黑腹果蠅表達E2蛋白; Bolin等[22]利用昆蟲系統(tǒng)表達E2重組蛋白并對牛進行免疫, 證明了E2重組蛋白可保護機體免受同源毒株的感染.

在懷孕母牛妊娠期120 d內, 胎兒感染BVDV形成免疫耐受狀態(tài), 可進一步發(fā)展為持續(xù)感染牛(persistent infection, PI), 這種PI牛不易死亡, 可終生持續(xù)性向畜群排毒, 是牛群最主要的傳染源[23], 目前檢測PI牛難度較大.酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法是診斷BVDV最簡便、快捷的方法, 本文通過原核表達方法得到活性良好的E2蛋白抗原, 制備高效價的鼠源多克隆抗體, 其反應性和特異性良好, 為ELISA檢測方法提供抗原和抗體, 為檢測BVDV PI動物及研究E2功能得出一種新思路.

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 實驗動物 Balb/c小鼠(雌性, 42 d)購于中國科學院蘭州獸醫(yī)研究所.

1.1.2 載體和菌株 BVDV C24V標準毒株購于蘭州民海生物公司； MDBK(madin-darby bovine kidney)細胞由甘肅農業(yè)大學動物醫(yī)學院傳染病學實驗室保存； PEASY-Blunt Cloning Vector和pET-30a(+)表達載體均購于南京諾唯贊公司； 大腸桿菌E.coliDH5α和BL21(DE3)感受態(tài)細胞均購于北京全式金公司.

1.1.3 主要試劑 高糖DMEM基礎培養(yǎng)液、胎牛血清和胰蛋白酶均購于北京元亨圣馬公司； TRIzol@Reagent購于上海生工生物工程公司； AMV反轉錄酶、RNase Inhibitor、EcoRⅠ、XhoⅠ和T4DNA Ligase均購于山東寶生物工程公司； BCA蛋白濃度測定試劑盒和BeyoECL Star化學發(fā)光試劑盒均購于南京碧云天公司； 氟氏完全佐劑和不完全佐劑均購于美國Sigma試劑公司； Goat Anti-mouse IgG(HRP標記)和FITC標記山羊抗小鼠(H+L)均購于北京博奧森公司.

1.1.4 主要實驗儀器 8000WJ型CO2細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司), nexus GSX1型PCR儀(德國Eppendorf公司), HH·B11-BS-Ⅱ型電熱恒溫培養(yǎng)箱和THZ-82N型恒溫震蕩培養(yǎng)箱(上海躍進醫(yī)療器械有限公司), Biorad Powerpac Bacsic164-5050型電泳儀、電泳槽和Trans-Blot SD型半干式轉印儀(美國Bio-rad公司), DFM-60C型倒置熒光顯微鏡(德國ZEISS公司).

1.2 方 法

1.2.1 病毒RNA提取和鑒定 取病毒感染狀態(tài)良好的MDBK細胞, 待細胞病變穩(wěn)定, 收集病毒, 濃縮, 用0.22 μm濾器過濾備用.按TRIzol試劑說明提取RNA, 并將其反轉錄為cDNA, -20 ℃保存?zhèn)溆?參考NCBI BVDV 5’UTR(GenBank: MF347401.1)序列設計保守序列引物； 參考文獻[11]獲得BVDV-Ⅰ鑒別引物B3B4； 使用兩種引物通過多聚酶鏈式反應(PCR)技術鑒定病毒.

1.2.2E2全長基因擴增 參考NCBI BVDV-Ⅰ V074株(GenBank: KX170165.1)設計E2基因全長引物, 由南京金唯智公司合成.通過PCR技術擴增目的基因,E2反應條件： 98 ℃, 5 min； 98 ℃, 45 s； 48 ℃, 1 min； 72 ℃, 80 s； 72 ℃, 10 min, 循環(huán)數(shù)為35； 擴增產(chǎn)物經(jīng)質量分數(shù)為1.5%凝膠驗證后回收, 基因片段連接PEASY-Blunt Cloning Vector, 轉化DH5α, 陽性克隆菌由南京金唯智公司測序.

1.2.3E2原核表達載體構建 將測序正確的E2全長基因序列進行生物信息學分析, 選取抗原位點集中的區(qū)域.設計截短引物, 利用PCR技術擴增截短片段, 反應條件為： 95 ℃, 6 min； 95 ℃, 50 s； 62.1 ℃, 50 s； 72 ℃, 80 s； 72 ℃, 10 min, 循環(huán)數(shù)為35； 擴增產(chǎn)物經(jīng)質量分數(shù)為1.5%凝膠驗證后回收；EcoRⅠ，XhoⅠ雙酶切后連接pET-30a(+)載體, 產(chǎn)物轉化DH5α并進行菌液PCR及雙酶切驗證； 陽性克隆菌測序后, 提取質粒, 轉化BL21.

表1 引物信息

1.2.4 原核表達 挑取重組E2菌落和pET-30a(+)載體菌落分別接種于培養(yǎng)基中培養(yǎng), 用分光光度計測定A600=0.6時, 加入1 mol/mL異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)誘導重組菌表達蛋白； 超聲波破碎, 分離上清液和沉淀, 制備蛋白樣品, 經(jīng)質量分數(shù)為10%的SDS-PAGE電泳驗證蛋白表達結果； 優(yōu)化表達條件, 提升蛋白表達量； 先用2-YT培養(yǎng)基按相同條件大量培養(yǎng)菌體, 再純化和復性蛋白, 并測定含量.

1.2.5 多克隆抗體制備 以重組E2蛋白為免疫原, 選取健康Balb/c小鼠3只, 首次免疫用100 μg/只的重組蛋白和等體積弗式完全佐劑, 背部多點注射免疫小鼠； 首次免疫14 d后, 每隔7 d, 按50 μg/只的重組蛋白和等體積弗式不完全佐劑免疫小鼠, 共免疫4次.重組蛋白為抗原, 間接ELISA測定小鼠血清多克隆抗體效價； 若抗體效價高于1∶20 000, 則處死小鼠, 大量收集抗體.

1.2.6 多克隆抗體鑒定 效價測定： 蛋白定量, 以每孔5 μg重組蛋白混合碳酸鹽緩沖液包被酶標板, 經(jīng)包被、封閉、洗滌后酶標板于-20 ℃保存?zhèn)溆?小鼠尾靜脈采血并分離血清； 實驗設置空白和陰性對照, 將多抗血清以1∶200稀釋, 依次加入蛋白酶標板中, 37 ℃孵育2 h, 磷酸鹽吐溫緩沖溶液(PBST)洗滌； 加入1∶3 000的稀釋辣根過氧化酶(HRP)標記的羊抗鼠二抗, 37 ℃孵育2 h, PBST洗滌； 加入3,3′，5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)酶-底物顯色液于37 ℃作用15 min； H2SO4終止反應, 酶標儀于450 nm波長下測定結果.多克隆抗體效價測定設置3個平行組, 以未免疫小鼠血清為陰性血清, 判定標準：S/N=實組A值/陰性組A值,S/N>2.1為陽性.

免疫印跡(Western blot, WB)實驗: 將純化后的蛋白、病毒制樣經(jīng)質量分數(shù)為10% SDS-PAGE電泳分離, 通過半干式電轉膜法將蛋白及病毒抗原轉至硝酸纖維素薄膜上, 加入質量分數(shù)為5%脫脂奶粉于4 ℃封閉12 h后, 用PBST洗滌； 用1∶1 000稀釋的多抗血清于37 ℃孵育2 h, PBST洗滌； 用1∶500稀釋HRP標記的羊抗鼠二抗孵育2 h, PBST洗滌； 進行化學發(fā)光顯色反應.

免疫熒光(IFA)實驗： 設置無病變細胞組、細胞病變組、陰性對照組、陽性對照組和實驗組； 用六孔板(內置無菌載玻片)培養(yǎng)MDBK細胞, 當細胞生長密度適中時接種病毒, 當細胞產(chǎn)生大量病變且尚未脫落時, 磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌； 用多聚甲醛于37 ℃固定10 min, PBS洗滌, 用質量分數(shù)為5%的脫脂奶粉于37 ℃封閉1 h, PBST洗滌； 腹水抗體1∶800稀釋, 37 ℃孵育2 h， PBST洗滌； 用1∶500 稀釋HRP標記的羊抗鼠二抗于37 ℃避光孵育2 h, PBST避光充分洗滌； 爬片置于滴有抗熒光淬滅劑的載物片上, 用熒光顯微鏡觀察和拍照.

2 結果與討論

2.1 BVDV增殖

對照組細胞與感染病毒MDBK細胞的熒光顯微照片如圖1所示.由圖1(B)可見, 感染病毒的MDBK細胞出現(xiàn)脫落和圓縮等病變, 符合預期結果, 可用于提取病毒RNA.

圖1 對照組細胞(A)和感染病毒細胞(B)的熒光顯微照片F(xiàn)ig.1 Fluorescence micrographs of control cells (A) and infected virus cells (B)

2.2 病毒RNA驗證結果

用RT-PCR驗證BVDV的結果如圖2所示.由圖2可見: 第一泳道BVDV鑒別引物PCR擴增大小為221 bp, 與預期結果相符； 第二泳道5′UTR保守序列引物PCR擴增大小為381 bp, 與預期結果相符, 即病毒鑒定為BVDV-Ⅰ型, 提取的RNA可用于克隆E2基因.

2.3 E2全長基因PCR擴增及鑒定

以cDNA為模板, 用PCR技術擴增得到大小為1 122 bp基因片段， 如圖3所示.由圖3可見, 所得結果與預期結果一致.連接克隆載體, 菌液經(jīng)PCR驗證正確后測序.E2全長基因測序結果如圖4所示.由圖4可見, 擴增片段為BVDV-Ⅰ型E2序列, 同源性99%, 表明已擴增出E2全長基因.

M： DNA標準DL 2 000； 1： 鑒別引物擴增產(chǎn)物；2： 保守序列引物擴增產(chǎn)物.圖2 BVDV的RT-PCR鑒定結果Fig.2 RT-PCR identification results of BVDV

M： DNA標準DL 10 000； 1： 全長基因擴增產(chǎn)物.圖3 PCR反應擴增E2全長基因結果Fig.3 Results of amplification of E2 full-length gene by PCR reaction

2.4 pET-30a-E2重組質粒的構建與鑒定

以E2全長基因為模板, 用截短引物通過PCR技術擴增得到大小為1 026 bp基因片段, 如圖5所示.由圖5可見, 所得結果與預期結果一致.將其與pET-30連接后, 雙酶切鑒定結果如圖6所示.由圖6可見, 2條帶的大小分別為5 423 bp和1 026 bp, 符合預期結果, 即成功構建了pET-30a-E2原核表達載體.

圖4 E2全長基因測序結果Fig.4 Sequencing results of E2 full-length gene

M： DNA標準DL 10 000； 1： E2截短基因擴增產(chǎn)物.圖5 PCR反應擴增截短基因Fig.5 Amplification of truncated genes by PCR reaction

M： DNA標準DL 10 000； 1： 重組質粒； 2： 雙酶切產(chǎn)物.圖6 pET-30a-E2重組質粒雙酶切鑒定結果Fig.6 Identification results of pET-30a-E2 recombinant plasmid by double enzyme digestion

2.5 原核表達產(chǎn)物

重組蛋白經(jīng)質量分數(shù)為10%的SDS-PAGE電泳結果如圖7所示.由圖7可見: 第一孔的空質粒組在特定大小處沒有條帶； 第二孔全菌表達的蛋白大小為32 000； 第三孔超聲波破碎后菌體沉淀蛋白大小為32 000； 第四孔純化后蛋白大小為32 000, 符合預期結果, 但包涵體純化法得到的蛋白純度較差, 雜帶較多.表明實驗構建的重組大腸桿菌成功表達了大小為32 000、表達形式為不可溶性的E2蛋白.

2.6 多克隆抗體鑒定

2.6.1 間接ELISA結果 小鼠在5次免疫后, 以未免疫前小鼠血清為陰性對照, 測定多克隆抗體效價, 其陰性均值為0.208 4, 制備的多克隆抗體稀釋29倍后, 其OD450=0.804 1, 大于2.1倍的陰性值, 計算的抗體效價大于2×104, 表明實驗所用制備抗體的抗原活性較好, 免疫原性較強, 可刺激小鼠產(chǎn)生強免疫反應.

M: 蛋白分子質量標準； 1: 空質粒組； 2: pET-E2全菌誘導；3: pET-E2誘導沉淀； 4: pET-E2蛋白純化.圖7 重組蛋白的SDS-PAGE分析Fig.7 SDS-PAGE analysis of recombinant protein

M: 蛋白分子質量標準； 1: E2蛋白； 2: BVDV.圖8 多克隆抗體的Western blot鑒定結果Fig.8 Western blot identification results of polyclonal antibody

2.6.2 Western blot結果 多克隆抗體的Western blot鑒定結果如圖8所示.由圖8可見, 多克隆抗體與第一孔的重組蛋白抗原在32 000結合, 與第二孔的病毒抗原在35 000特異性結合, 表明制備的鼠源多克隆抗體反應性和特異性良好.

2.6.3 IFA結果 多克隆抗體的IFA鑒定結果如圖9所示.由圖9可見: MDBK細胞在感染病毒后產(chǎn)生病變； 無病變對照(圖9(B))與陰性血清組(圖9(C))均未出現(xiàn)熒光現(xiàn)象； 陽性對照出現(xiàn)較大范圍熒光(圖9(D))； E2多克隆抗體組出現(xiàn)較多熒光(圖9(E)).表明抗體可與細胞中的BVDV結合, 抗體反應性和特異性良好, 但低于陽性血清的純度.

圖9 多克隆抗體的IFA鑒定結果Fig.9 IFA identification results of polyclonal antibody

綜上, 本文以Balb/c小鼠及原核表達載體pET-30a為材料制備多克隆抗體, 其背景信息清晰, 可降低對實驗準確性的影響； 截短后的E2基因, 親水性和抗原表位點更集中, 可更有效加強重組E2蛋白對動物機體的刺激作用, 有利于制備抗體.蛋白表達測定結果表明, 構建的重組E2大腸桿菌表達效率達50%, 蛋白表達量為0.4 mg/mL, 處于較高水平； ELISA測定結果表明, 制備的多克隆抗體效價大于200 000, 即實驗得到的重組蛋白活性良好, 可刺激小鼠免疫細胞產(chǎn)生抗體, 從而為ELISA準備良好抗原, 進一步檢測患病及PI動物； WB和IFA結果表明, 多克隆抗體的反應性和特異性良好, 可作為檢測BVDV病原的抗體.