郭小媛 董俊杰 葉 影 葉儉慧* 梁月榮

(1.浙江大學茶葉研究所，浙江 杭州 310058; 2.浙江駱駝九宇有機食品有限公司，浙江 杭州 310000)

茶是世界主流飲品之一，具有獨特風味和多重保健功效，如降血壓、降血脂、抗輻射、抑菌消炎等。茶多酚(主要包括兒茶素類化合物和黃酮醇類化合物)、氨基酸、咖啡堿和香氣物質是茶葉重要的品質成分，與茶的生理活性有關。茶葉的化學組分受到茶樹品種、加工方式、采摘季節(jié)和栽培環(huán)境等因素的影響，與此同時也是茶樹鮮葉對外界環(huán)境刺激反應的結果，不同樣品之間成分的差異，如同人的指紋一般表征茶樣各自的特質。

近年來，指紋圖譜技術已越來越多地應用于藥用植物和食品領域的品質控制和鑒定?；跈z測對象，指紋圖譜技術大致可分為兩大類：化學指紋圖譜和生物指紋圖譜?；瘜W指紋圖譜主要借助多種分析化學檢測手段，獲得與檢測樣品相關的波譜數(shù)據(jù)，結合化學計量法，得到表征樣品特征信息的指紋圖譜[1-3]；生物指紋圖譜的構建依托分子生物技術、計算機統(tǒng)計分析技術等，包括DNA指紋圖譜和蛋白組學指紋圖譜等[4]，對檢測技術和計算機統(tǒng)計分析技術要求較高?；瘜W指紋圖譜可獲得多重組分含量，與茶葉的品質特征具有直接相關性，且檢測手段和技術相對更為常見，同時具備系統(tǒng)性、全面性和可比性等優(yōu)勢。本文就近年來化學指紋圖譜技術檢測和分析機理及其在茶葉研究領域的應用進行了綜述。

1 常用的化學指紋圖譜檢測技術

化學指紋圖譜檢測技術主要涉及化學指紋的提取和計算機分析處理兩個方面。目前常見的提取化學指紋圖譜的檢測技術主要包括色譜、近紅外/中紅外光譜和非靶向質譜檢測。

1.1 色譜檢測分析技術

色譜檢測分析技術主要包括液相色譜和氣相色譜。高效液相色譜(HPLC)和超高壓液相色譜(UHPLC)是應用最廣的液相色譜檢測技術。液相色譜技術基于樣品溶液中各組分在固定相和流動相的分配系數(shù)差異，利用高壓高速使得各組分隨流動相在色譜柱內經(jīng)反復多次吸附-解吸后產(chǎn)生流速差異而分離，再經(jīng)檢測器將濃度轉換為電信號以色譜圖形式輸出。常見的液相檢測器有紫外/可見光檢測器、光電二極管矩陣檢測器、示差折光檢測器、熒光檢測器、電化學檢測器，可用于多種類型化合物的檢測。液相色譜技術具有分離效果佳、穩(wěn)定性好、檢測精度高等特點，且對樣品的熱穩(wěn)定性與揮發(fā)性無要求，適合多組分的物質的定性和定量分析[1-2]。而UHPLC在超高壓的條件下進行，相對分析時間更短、分離效果更好且溶劑消耗量和樣品上樣體積少，且通常與質譜一同聯(lián)結使用，適用于樣品化學組分的高通量定性和定量分析[5]。 圖1 為不同波長下綠茶UHPLC色譜圖[6]?？梢愿鶕?jù)物質對紫外波段的吸收特性，選擇不同的紫外波段進行物質的定量分析，圖1中360 nm處對黃酮醇苷物質進行檢測， 280 nm處對兒茶素類化合物進行檢測。對于未知物質的液相色譜圖，可以通過比較色譜圖各個峰的位置和面積，結合化學計量法，獲得樣品的特征圖譜以及樣品間的差異。

氣相色譜技術(gas chromatography， 簡稱GC) 是研究茶葉揮發(fā)性成分的主要手段。通常以惰性氣體(如氦氣)作為載氣，各組分在兩相間經(jīng)反復多次的吸附-脫附而彼此分離，在檢測器中將濃度變化轉化為相應的電信號，在記錄器上得到各組分的色譜峰，通常聯(lián)結質譜進行定性分析。氣相色譜檢測的精度和準確度受到揮發(fā)性物質提取和衍生方法的影響。目前常用的萃取方法有常壓蒸餾萃取法(SDE)、減壓蒸餾萃取法 (VDE)、超臨界萃取法(SFE)、頂空吸附法(HAS)、固相微萃取(SPME)、頂空固相微萃取( HS-SPME)等。相對于其他萃取方法的長時間高溫蒸餾、大量使用有機溶劑、結果重現(xiàn)性差等缺陷，SPME法集樣品的采集、萃取、濃縮、進樣一體，萃取條件相對溫和，且靈敏度高、重現(xiàn)性較好[7-10]，近年來已較多應用于茶葉揮發(fā)性成分的檢測[11-15]。目前，通過GC-MS已從茶葉中檢測出50余種香氣揮發(fā)性物質[16-23]。

當目標物質沸點較高時，可通過衍生化反應改變目標物質的原子或基團，降低目標物的沸點，便于檢測。GC-MS常用的衍生化方法有硅烷化、?；?、烷基化。硅烷化試劑是GC-MS分析中應用最廣的衍生化試劑，在酚類、胺類、酸類化合物的衍生分析中都能發(fā)揮很大的作用，三甲基硅烷是GC分析最常用的通用硅烷化試劑[24-25]。結合衍生技術，GC-MS不僅僅用于揮發(fā)性物質的檢測，還可用于較高沸點物質的檢測，是全面研究樣品化學組分的有效手段之一[26]。胡慈杰等采用衍生法結合氣質聯(lián)用技術，從茶湯中同時檢測出26種氨基酸，43種可溶性糖、43種有機酸等171種代謝產(chǎn)物，對應的GC-MS總離子流色譜圖如圖2所示[27]。茶香氣指紋圖譜結合化學計量法在區(qū)別名優(yōu)茶香氣類型，明確特征香氣組分，基于化學成分的感官科學和感官評價等方面具有應用前景[28-32]。

1.2 近紅外/中紅外光譜檢測技術

紅外檢測技術是基于不同有機物官能團對紅外光波段具有不同吸收，從而獲得物質結構和含量信息的技術。根據(jù)紅外波段，可分為近紅外(4000～12820 cm-1)與中紅外(400～4000 cm-1)技術。根據(jù)特征吸收峰的波數(shù)位置和強弱，可對茶葉中特定化學組分含量進行初步檢測，可用于茶葉的無損檢測，在判定茶葉類型， 快速測定基礎化學成分方面具有應用前景[33-35]。在中紅外光譜波段內，1300～4000 cm-1波段可用于官能團結構解析，400～1500 cm-1波段被稱為“指紋區(qū)”，即每個樣品擁有其獨一無二的特征光譜波段[36-37]。表1為兒茶素類化合物在400～4000 cm-1波段內不同官能團所對應的特征吸收峰，根據(jù)特征吸收峰的吸收值可對不同茶樣進行分類和區(qū)分[38]。

1.3 非靶向質譜檢測技術(Non-target MS)

質譜檢測主要是利用高能電子流轟擊樣品，生成具有不同質荷比的帶電離子，通過其在磁場中發(fā)生偏轉，捕獲后確定分子或分子碎片分子量，可分為有檢測目標的靶向質譜檢測技術和非靶向質譜檢測技術。基于高分辨質譜的非靶向質譜檢測技術(Non-target MS)，通過分子量小數(shù)點后四位，比對化合物分子量數(shù)據(jù)庫，從高精度分子量角度判定物質成分，目前已應用于代謝組學等方面的研究，在檢測樣品中的未知成分方面具有優(yōu)勢，然而非靶向質譜檢測技術對儀器設備和從業(yè)技術人員要求較高，且關于特定組分的定量分析仍需進一步通過液相等方法進行確認[39]。

注：表內數(shù)據(jù)改編自參考文獻[37-38]。

2 常用的化學計量法

指紋圖譜數(shù)據(jù)需結合化學計量法通過統(tǒng)計分析，獲得有效結論。常用的化學計量法有主成分分析(PCA)、聚類分析(CA)、人工神經(jīng)網(wǎng)絡法(ANN)、偏最小二乘判別分析法( PLS-DA)等。不同分析方法的聯(lián)用，可以互證結果，有應用于茶類判別、茶原產(chǎn)地溯源、茶樹親緣溯源等[40-42]。最常用的PCA是利用降維的思想，將多個指標轉化為少數(shù)幾個綜合指標(一般是原指標的主成分)，以客觀確定的權數(shù)得到數(shù)據(jù)間影響因素的貢獻率的分析方法；聚類分析(CA)的特點是根據(jù)研究對象的個體特征(即一些能度量樣品間相似程度的統(tǒng)計量)，將不同樣品進行相近性歸類[7]。人工神經(jīng)網(wǎng)絡法(ANN)是通過不斷逼近從無規(guī)律和模糊的大量數(shù)據(jù)中提煉出趨勢和傾向性，在處理海量且規(guī)律不明的數(shù)據(jù)上有明顯優(yōu)勢，如建立茶葉品種的判別分類模型[43]。偏最小二乘回歸法(PLS)基于多元線性回歸模型，對所有變量進行分解后提取因子間的相關性，再按相關性由大而小排列，得到線性模型(如Y=b0+b1X1+b2X2+b3X3+…+bpXp)，可以在此基礎上選擇因子參與后續(xù)建模。判別分析(DA)是基于一定判別標準，利用一個或多個判別函數(shù)將樣品進行歸類的分類方法。對于判別分析而言，準確有效的判別函數(shù)往往起著關鍵性作用。PCA提取相關性較高的變量以簡化展示不同樣品間的異同，但某些相關性很小的有用變量很可能被忽視，而PLS采用多變量的回歸建模方式可以彌補這一缺陷，其中PLS-DA是最常見的方差分析法[36]。

3 指紋圖譜技術在茶葉領域的應用

基于化學組分的指紋圖譜技術與化學計量法相結合，在辨別茶葉原料的品質、溯源地，區(qū)分制作工藝，判定茶葉等級等方面具有應用價值，近年來已成為茶葉研究領域熱點之一[44]。該技術的建立和推廣對于制定茶葉等級的客觀評定體系，設定茶葉質量標準，明確茶葉溯源地，維持茶葉市場健康發(fā)展具有積極意義。

3.1 溯源地區(qū)分

不同地域的茶葉通常具有不同的品質特征，這是由于不同產(chǎn)地的地理環(huán)境和氣候差異導致了茶葉化學組成的差異。胡燕和齊桂年(2014年)比較了來自四川、湖南、湖北、云南、廣西和陜西6省的37個黑茶樣品的紅外吸收光譜，通過聚類分析結合二階導數(shù)譜的相似度分析可以區(qū)分不同產(chǎn)地黑茶樣品，此外還通過HPLC-DAD-ELSD聯(lián)用技術，構建了不同產(chǎn)地黑茶的HPLC指紋圖譜，為黑茶產(chǎn)地鑒別和質量控制提供了參考[38，45-46]。He Yong等(2007年)對八種不同產(chǎn)區(qū)的綠茶樣進行近紅外光譜檢測，基于PCA法得到8個主成分并應用于反向傳播神經(jīng)網(wǎng)絡的輸入，建立了BP-ANN模型。試驗結果表明通過WT和PCA對40個未知樣品的光譜數(shù)據(jù)預處理后，利用該模型進行種類預測，識別準確率達到了100%[43]。He等(2012年) 結合偏最小二乘分析和歐氏距離法對從中國浙江省四個不同地區(qū)收集的857個茶樣品的近紅外光譜數(shù)據(jù)進行分析，采用兩步判別法建立判別模型，能夠有效驗證茶樣品的真實性和來源，對校正集和驗證集茶樣的識別準確率分別達到98.43%和96.84%，[36]。辛中權(2017年)采用色譜質譜聯(lián)用技術對云南和湖南兩個產(chǎn)地的72批綠茶樣品進行化學成分檢測，建立了不同產(chǎn)地綠茶的色譜指紋圖譜，并結合化學計量學方法構建了能夠區(qū)分云南和湖南綠茶的判別模型[47]。中國茶葉種質資源豐富，不同品種、產(chǎn)區(qū)的茶葉適制性亦不同，尤以名優(yōu)茶類對茶葉原料的要求更高，指紋圖譜技術在識別茶葉產(chǎn)地上的準確率和普適性仍有待提高。

3.2 不同茶類和等級區(qū)分

不同茶類因加工工藝的差異直接導致干茶中化學組分的含量和種類的顯著區(qū)別，如綠茶中氨基酸含量較高，發(fā)酵茶類含有茶紅素、茶黃素、茶褐素，而綠茶由于殺青工藝不含有兒茶素類的氧化產(chǎn)物。不同采摘標準和原料配比制作出的干茶在滋味和內含成分上也有較大差異，如茶嫰葉的氨基酸、咖啡堿含量高于老葉，而老葉的纖維素含量較嫩葉高等。Yang Zhao等(2011年) 運用UPLC-DAD-MS對普洱生茶、綠茶、白茶進行化學成分檢測，并采用主成分分析(PCA)對茶葉樣品進行區(qū)別和歸類，結果表明優(yōu)化的UHPLC指紋技術結合化學計量法能夠較好地對茶葉樣品進行分類[48]。陳維等(2018年)對不同堆青處理的白茶樣品進行GC-MS全掃描檢測，通過香氣組分差異結合PCA成功區(qū)分不同堆青處理的白茶樣品，并建立聚類分析譜系圖[7]。Anupma Sharma等采用RP-HPLC對Kangra，Darjeeling和Nilgiri三個產(chǎn)區(qū)的印度紅茶樣品進行化學成分檢測，PCA結果顯示可以依據(jù)茶葉萎凋和發(fā)酵的不同程度來區(qū)分不同產(chǎn)區(qū)的茶，該結果有助于開發(fā)HPLC在線監(jiān)控系統(tǒng)對茶葉加工過程進行技術控制[49]。利用色譜指紋圖譜與品質成分檢測結果，結合計算機模型建立茶葉綜合評價體系和等級評判標準，進而構建茶葉科學的質量監(jiān)測體系，這已成為當前茶葉領域研究的熱點。

3.3 茶樹品種區(qū)分

我國具有豐富的茶樹品種資源，茶樹品種間內含組分有明顯差異，這是茶樹生長生態(tài)條件的多樣性和人工長期選擇的結果。周健、王麗鴛等(2010年)對浙江省不同產(chǎn)區(qū)的四個不同品種的838份扁形綠茶進行紅外光譜檢測，結合PLS、歐式距離等分析方法成功區(qū)分所制干茶的不同品種(最終識別準確率：定標集為90.3%，驗證集為83.5%)，為實現(xiàn)茶葉品種溯源提供了借鑒[50]。陳林等(2012年)基于鐵觀音、黃棪、金觀音和黃觀音四個品種春季新梢的游離氨基酸指紋圖譜，結合化學計量法成功區(qū)分烏龍茶適制品種的類群，為清香型烏龍茶鮮葉原料的選取和制作工藝控制提供了參考[51]。王斌等(2017年)對22個安化黑茶樣品以及云南普洱茶、湖北青磚茶、廣西六堡茶、四川土司黑茶的主要化學成分進行色譜定量分析，找到了可用于安化黑茶鑒定和評價的標志性化學成分—茯磚素A[52]。Zheng等(2018)通過UHPLC-DAD-MS / MS同時測定茶葉中13種黃酮醇苷和8種兒茶素的濃度，結果表明黃酮糖苷含量具有明顯的種間差異， 或可成為區(qū)別茶樹品種的重要化學成分[6]。指紋圖譜技術在茶葉品種判別方面的應用，有助于名優(yōu)茶種質資源的保護和利用。

3.4 茶葉陳新區(qū)分

白茶、普洱茶的化學組分隨著貯藏年份的增加而發(fā)生轉變，主要表現(xiàn)為氨基酸和茶多酚含量下降，茶色素和水溶性蛋白等濃度上升，另有復雜多聚物的生成，這導致隨著貯藏年份的增加茶葉品質特征發(fā)生明顯變化。譬如新制成的白茶茶香氣較清純，而存放后會顯現(xiàn)甜香毫香，隨著存放年份的增加陳香、棗香出現(xiàn)，乃至發(fā)展成為“藥香”。同樣，普洱茶隨著貯藏年份的增加品質也有明顯變化，陳香更為明顯，而滋味更醇和。研究表明基于普洱茶的紅外光譜特征結合HPLC-MS技術和化學計量法，可區(qū)分普洱生茶和熟茶[53-54]。劉興勇等(2015年)采用 HPLC檢測了不同陳化年限的云南普洱茶的化學成分，通過聚類及判別分析建?？沙醪脚卸ㄆ斩璧年惢晗?初始分組和交叉驗證判別正確率分別為100%和89.5%)，但其準確率受到樣品來源及加工工藝等因素的影響[55]。

3.5 數(shù)字化感官評價體系建立

目前，茶葉質量評價體系主要是感官評價定級外加相關生化成分檢測。感官評價定級以專業(yè)人士審評為主，審評結果易受到審評員主觀因素和外在環(huán)境的影響，較難實現(xiàn)大批量茶葉樣品的同期審評，且審評結果的重復性有待考量。因而，建立起客觀，公正，重復性高，同期處理量大的數(shù)字化感官評價體系是茶葉審評科學的主要發(fā)展方向。史波林等(2011年)利用電子鼻傳感器分別檢測西湖龍井茶的干茶、葉底和茶湯的香氣，建立了正確率高達95%以上的西湖龍井茶等級判別模型[56]。Danqun Huo等(2014年)采用人造舌頭和鼻子檢測來自不同地域的綠茶茶湯或香氣，結合PCA成功區(qū)分了不同地理來源和等級的中國綠茶[57]；王銀誠等(2017年)采用電子舌對茶湯滋味進行檢測、打分，結合PCA和CA分析對紅茶滋味進行區(qū)分，其結果與人工審評結果一致[58]。基于化學組分、電子感官系統(tǒng)結合化學計量法建模進行茶葉感官審評和等級判定具有簡單快速、結果客觀、重復性高等優(yōu)點，有助于促進茶葉感官評價的科學化和茶葉質量數(shù)字化控制體系的建立。

4 展望

基于化學組分的指紋圖譜技術結合化學計量法，在茶葉的原產(chǎn)地和品種溯源，干茶等級和陳新區(qū)分、建立數(shù)字化感官評價體系方面具有應用前景?；瘜W計量法分析結果的可靠性受到所采用的指紋圖譜準確性和全面性的影響。由于茶葉種類繁多、工藝多樣，導致茶葉的內含成分復雜且不同茶類之間存在較大差異，因此需進一步提高茶葉化學組分檢測技術手段，從而獲得更為可靠和全面的茶葉指紋圖譜，用于化學計量分析，提高模型區(qū)分或判定的準確性?；诩t外光譜技術的無損檢測是目前食品類無損檢測技術研發(fā)的熱點，具有快速分析、操作簡單、數(shù)據(jù)信息量大等優(yōu)勢；但由于物質官能團對紅外光吸收靈敏度的限制，在采用紅外光譜數(shù)據(jù)進行建模時，應采用較大的樣品量進行建模，同時確定相應的樣品選擇標準和模型的應用范圍。隨著多重組學的發(fā)展，能檢測和需要檢測的物質大量增加，化學計量法的引入使得樣品間差異信息的獲取更有效率、識別準確率更高。通過統(tǒng)計學手段對獲得的大數(shù)據(jù)進行分析從而獲得可靠結論是未來食品化學發(fā)展的重要趨勢之一。