林文海 福建省永春縣鄉(xiāng)鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站 福建永春 362600

肝病是一個(gè)全球高發(fā)又會(huì)引起死亡的疾病，嚴(yán)重威脅著社會(huì)發(fā)展，一直是廣大醫(yī)學(xué)界一個(gè)重要研究課題[1]。肝臟是動(dòng)物體代謝和解毒的主要器官，它可以把多種毒物、藥物分解成小分子物質(zhì)以便進(jìn)一步吸收、排泄，從而減少毒物、藥物對(duì)動(dòng)物體的破壞。許多原因都會(huì)引起肝損傷，現(xiàn)在醫(yī)學(xué)界主要研究化學(xué)性、酒精性、病毒性和免疫性等因素引起的肝損傷[2]。在肝臟發(fā)生病理改變后，動(dòng)物體內(nèi)多個(gè)系統(tǒng)也會(huì)因此受到影響，并且內(nèi)源性小分子代謝物轉(zhuǎn)歸也會(huì)發(fā)生變化[3]。我國畜禽急性肝損傷性情況持續(xù)增多，但目前又沒有切實(shí)有效的治療方法，嚴(yán)重制約畜禽業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[4]。重點(diǎn)研究急性肝損傷發(fā)病機(jī)理和探討一些比較有實(shí)效的治療方法，對(duì)慢性肝病防治有十分顯著的作用[5]。由于復(fù)雜性的肝臟功能和多樣性的肝損害因素，造成沒有一個(gè)試驗(yàn)?zāi)Ｐ涂梢韵到y(tǒng)、準(zhǔn)確地反映特定肝損傷的本質(zhì)。另外，已有的急性肝損傷試驗(yàn)?zāi)Ｐ筒僮鞣爆?、穩(wěn)定性不高、計(jì)量方法不同，因此有待進(jìn)一步完善，以便進(jìn)一步研究肝損傷機(jī)理[6]。本試驗(yàn)選擇雛雞為試驗(yàn)動(dòng)物，旨在建立藥物性和化學(xué)性急性肝損傷試驗(yàn)?zāi)Ｐ停瑸檠芯扛螕p傷機(jī)理和保肝藥物選擇提供參考基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料與試劑 芪苓散粗多糖粉末；甲醛、四氯化碳和市售普通食用花生油；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）試劑盒和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）試劑盒。

1.1.2 主要儀器 DHG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；TGL-16B高速臺(tái)式離心機(jī)；VIS-7220可見光分光光度計(jì)；XD-811L半自動(dòng)生化分析儀。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 1日齡三黃雞雛雞若干，購自永春某雞場(chǎng)。

1.2 方法

1.2.1 低劑量組和高劑量組芪苓散粗多糖制備（1）低劑量組(濃度125mg/L)：精密稱取芪苓散粗多糖12.5mg，溶于100mL超純水中，充分混勻，貼上“低劑量組”標(biāo)簽，置低溫下保存、待用。（2）高劑量組(濃度500mg/L)：精密稱取芪苓散粗多糖50mg，溶于100mL超純水中，充分混勻，貼上“高劑量組”標(biāo)簽，置低溫下保存、待用。

1.2.2 四氯化碳-花生油混合溶劑配制 把四氯化碳（濃度≥99.5%）和市售普通花生油根據(jù)體積比1:1均勻混合。

1.2.3 試驗(yàn)動(dòng)物分組與處理 將32羽1日齡健康三黃雛雞平均分為空白對(duì)照組、四氯化碳模型組、芪苓散粗多糖低劑量組和芪苓散粗多糖高劑量組(以下分別簡(jiǎn)稱空白組、模型組、低劑量組、高劑量組)?？瞻捉M和模型組不飼喂多糖，低劑量組、高劑量組分別灌喂125mg/L、500 mg/L芪苓散粗多糖。除空白組外，其他三組在喂芪苓散粗多糖2周后的第1 d、第4 d和第7 d灌喂四氯化碳-花生油混合溶劑(按12mL/kg)。各組進(jìn)行隔離飼養(yǎng)，試驗(yàn)期2周。最后一次灌喂四氯化碳-花生油溶液24 h后，各組試驗(yàn)動(dòng)物心臟采血致死。

1.2.4 血清的制備 雛雞心臟采血，5 000 r/min離心5min，將血清分裝在eppendorf管中，置-20℃保存，待測(cè)。

1.2.5 樣品的測(cè)定 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶使用連續(xù)監(jiān)測(cè)的方法進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定方法根據(jù)試劑盒說明書要求進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理 所有數(shù)據(jù)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0進(jìn)行LSD方差分析和差異顯著性檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)均以X±SD表示。

2 結(jié) 果

芪苓散粗多糖對(duì)急性肝損傷的雛雞血清ALT和AST活性影響情況見表1。對(duì)比各組數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)：模型組與空白組比較，模型組的酶指標(biāo)水平極顯著升高（P＜0.01）。多糖組與模型組比較，可見多糖組明顯降低CCl4肝損傷血清ALT與AST水平。高劑量多糖組與低劑量多糖組比較，可見高劑量多糖組的效果更明顯。

表1 芪苓散粗多糖對(duì)急性肝損傷雛雞血清ALT、AST活性的影響（n=8）

3 討 論

3.1 CCl4引起雛雞肝損傷的機(jī)理 肝臟會(huì)把進(jìn)入體內(nèi)的藥物進(jìn)行氧化、還原、聚合、羥化以及去甲基化等，因此，肝臟是機(jī)體內(nèi)器官中最容易被藥物所攻擊的臟器[7]。

如今醫(yī)學(xué)界普遍認(rèn)為CCl4對(duì)肝臟中毒的主要機(jī)制是自由基的形成及其引發(fā)的鏈?zhǔn)竭^氧化反應(yīng)。經(jīng)肝微粒體細(xì)胞色素P450依賴性混合功能氧化酶的代謝作用，四氯化碳在體內(nèi)生成三氯甲基自由基和三氯甲基過氧自由基及一系列氧活性物。這些產(chǎn)物不僅可與細(xì)胞內(nèi)多種大分子成分發(fā)生不可逆的共價(jià)結(jié)合而導(dǎo)致肝損傷，也會(huì)與胞內(nèi)脂質(zhì)、蛋白、核脂質(zhì)、核蛋白和DNA等多種細(xì)胞內(nèi)大分子進(jìn)行不可逆共價(jià)結(jié)合而導(dǎo)致細(xì)胞死亡，特別是自由基還會(huì)破壞核酸分子的完整性和構(gòu)型，損傷DNA[8-9]。并且CCl4還會(huì)抑制鈣泵的活性，使Ca2+內(nèi)流增加，從而導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙，胞漿Ca2+濃度升高，胞漿內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶滲入血液，肝微粒體和線粒體功能喪失，肝細(xì)胞代謝紊亂，最終死亡[8]。明確肝損傷作用機(jī)制可以為治療肝臟疾病提供理論基礎(chǔ)，為尋找和開發(fā)新的保肝護(hù)肝藥物提供有效途徑[10]。

3.2 芪苓散粗多糖對(duì)CCl4致動(dòng)物肝損傷后ALT和AST的影響 據(jù)資料表明，在動(dòng)物肝臟中，轉(zhuǎn)氨酶是催化氨基酸與酮酸之間氨基轉(zhuǎn)移的一類酶，其中以ALT和AST最為重要[11]。ALT主要分布于肝細(xì)胞漿的可溶性部分，AST主要分布于肝細(xì)胞漿的可溶性部分及線粒體中。CCl4的破壞性主要是在肝細(xì)胞代謝過程中所產(chǎn)生的自由基會(huì)破壞肝細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，使得肝細(xì)胞膜通透性變高，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)一些酶類進(jìn)入血液中，從而使血液中的一些酶類指數(shù)升高[12]。只要有1%肝細(xì)胞發(fā)生壞死，血清中轉(zhuǎn)氨酶活力就會(huì)增加1倍，因此ALT、AST等血清轉(zhuǎn)氨酶含量是肝細(xì)胞損傷情況的重要指標(biāo)，通過測(cè)定血清或血漿中ALT、AST等的活性變化就能夠知道肝臟受到損害的情況[13]。有研究認(rèn)為ALT是肝損傷的一個(gè)很靈敏指標(biāo)，ALT只能反映肝細(xì)胞的完整性，ALT增高往往說明肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞受到損傷[14]。

正常情況下，AST主要存在于組織細(xì)胞中，血清中可檢測(cè)到的含量極少[15-16]。但當(dāng)肝臟細(xì)胞受到損傷后，AST會(huì)進(jìn)入血液中，從而血液中酶活力明顯增加，可以發(fā)現(xiàn)血清中AST指數(shù)偏高。因?yàn)锳ST在血清中的含量能夠反映肝臟和心臟等內(nèi)臟器官受損害情況，所以，在臨床中測(cè)定血清中該酶含量有利于疾病的診斷和預(yù)后的觀察。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)采用CCl4對(duì)雛雞的肝臟進(jìn)行攻毒，引起雛雞肝臟急性損傷，效果明顯。CCl4模型組雛雞血清ALT、AST的活性均比空白組極顯著升高，充分說明試驗(yàn)建模是成功的。

試驗(yàn)結(jié)果顯示，灌喂芪苓散粗多糖組能夠降低雛雞血清中ALT、AST的活性，且隨著劑量的增高效果更明顯，表明芪苓散粗多糖對(duì)CCl4引起的雛雞急性肝損傷有一定的保護(hù)作用。