陳璐婷 胡夢奕 潘 磊 陳培豐

β-欖香烯由溫郁金（溫莪術(shù)）中提取，具有抗癌作用強、細(xì)胞毒性小、抗癌譜廣等優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于臨床治療各種惡性腫瘤及癌性胸腹水。Liu 等[1]研究發(fā)現(xiàn)，β-欖香烯能夠誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生保護性自噬。Beclin1 基因又稱BECN1 基因，是自噬通路中的重要調(diào)控因子[2]，研究發(fā)現(xiàn)，Beclin1 基因在胃癌呈現(xiàn)高表達[3]。本課題組預(yù)實驗檢測了Beclin1 的mRNA 在SGC-7901、MKN-45、BGC-835 等多個胃癌細(xì)胞的表達水平，結(jié)果顯示在SGC-7901 細(xì)胞中表達最高，故選用SGC-7901 細(xì)胞為本次實驗的靶細(xì)胞[5]。本研究探討β-欖香烯作用SGC-7901 細(xì)胞前后細(xì)胞增殖和保護性自噬的變化，以及Beclin1 基因?qū)Ζ?欖香烯抗癌作用和誘導(dǎo)自噬的影響。

1 實驗材料

1.1 細(xì)胞株和慢病毒載體 人胃腺癌細(xì)胞株SGC-7901 購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所（批號TCHu 46）。本研究中GV112-NC-shRNA、GV112-Beclin1-shRNA1 慢病毒載體系課題組前期實驗構(gòu)建成功并通過驗證，且經(jīng)實時熒光定量PCR（Real Time PCR）及免疫蛋白印跡（Western blot）篩選出對Beclin1 基因沉默效率最高的慢病毒載體[4]。

1.2 實驗藥品 β-欖香烯注射液，購自大連華立金港藥業(yè)有限公司（批號1506221，規(guī)格:20mL:0.1g）。分子式:C15H24，相對分子量:204.351，以其為本實驗用β-欖香烯母液，濃度為5mg/mL。

1.3 主要試劑及儀器 胎牛血清（澳大利亞Ausbian公司，批號VS500T）；RPMI-1640 培養(yǎng)液（杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)公司，批號2017070304）；胰酶[（生工生物工程（上海）公司，批號T0458-50G]；Puromycin（美國Clontech 公司，批號631305）；四甲基偶氮唑藍（MTT，美國Genview 公司，批號JT343）；二甲基亞砜（DMSO，上海試一化學(xué)試劑公司，批號130701）；BCA Protein Assay Kit、RIPA 裂解液（碧云天研究所，批號P0010S、P0013B）；LC3A/B 抗體（美國CST 公司，批號#12741）；GAPDH 抗體（美國Santa Cruz 公司，批號sc-47724）；辣根過氧化酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔多克隆IgG 抗體（美國Santa Cruz 公司，批號sc-2004）；倒置顯微鏡（上海蔡康光學(xué)儀器公司，型號XDS-100）；酶標(biāo)儀（瑞士Tecan 公司，型號M2009PR）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（日本三洋公司，型號MCO-175）。

2 實驗方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將人胃癌SGC-7901 細(xì)胞置于體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實驗時取對數(shù)生長期細(xì)胞。

2.2 細(xì)胞感染 SGC-7901 細(xì)胞分為以下三組:空白對照組，未做特殊處理、常規(guī)培養(yǎng)的SGC-7901 細(xì)胞；陰性對照組，感染非特異性短發(fā)夾樣RNA（shRNA）慢病毒載體GV112-NC-shRNA 的SGC-7901 細(xì)胞；實驗組，感染GV112-Beclin1-shRNA1 慢病毒載體（即前期實驗篩選出的對Beclin1 基因沉默效率最高的慢病毒載體） 的SGC-7901 細(xì)胞。將SGC-7901 細(xì)胞接種于12 孔板中培養(yǎng)，根據(jù)預(yù)實驗所得的最佳感染參數(shù)[感染條件:Eni.S+polybrene，感染復(fù)數(shù)（MOI）:20]，取GV112-Beclin1-shRNA1 和GV112-NC-shRNA 慢病毒顆粒各4μL，分別感染實驗組、陰性對照組胃癌細(xì)胞，觀察細(xì)胞狀態(tài)，未出現(xiàn)細(xì)胞毒性反應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)并于感染后16h 換液；若出現(xiàn)細(xì)胞毒性則立即換液。感染72h 后換用含嘌呤霉素（Puromycin，3μg/mL）的培養(yǎng)基進行藥篩處理，至空白對照組細(xì)胞全部被殺死后（大約24h），收集存活的細(xì)胞并擴增培養(yǎng)建立穩(wěn)定表達GV112-shRNABeclin1 及陰性對照質(zhì)粒GV112-shRNA-NC 的細(xì)胞模型。

2.3 MTT 法檢測細(xì)胞增殖抑制率

2.3.1 劑量依賴實驗 收集對數(shù)生長期SGC-7901細(xì)胞并用胰酶消化處理，完全培養(yǎng)基重懸制成細(xì)胞懸液，計數(shù)。取96 孔板鋪板，細(xì)胞密度為10000 細(xì)胞數(shù)/孔（cell/well），100μL。統(tǒng)一鋪好后，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)37℃、5%CO2培養(yǎng)24h。分為空白對照組、空白對照加藥組（加入β-欖香烯藥物濃度分別為10、20、50、100μg/mL），每組設(shè)3 個復(fù)孔。藥物作用細(xì)胞24h后，每孔加入20μL 濃度為5mg/mL 的MTT 溶液。孵育4h 后徹底吸盡培養(yǎng)液，每孔加入150μL DMSO。經(jīng)振蕩器震蕩3～5min 后，用酶標(biāo)儀490nm 檢測OD值，計算抑制率。

2.3.2 β-欖香烯聯(lián)合Beclin1 shRNA 實驗 胰酶消化陰性對照組、實驗組胃癌細(xì)胞并制成細(xì)胞懸液，取96 孔板鋪板，細(xì)胞密度為10000cell/well，100μL。統(tǒng)一鋪好后，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)37℃、5%CO2培養(yǎng)24h。取上述MTT 實驗中最佳濃度的β-欖香烯處理胃癌細(xì)胞，實驗設(shè)置陰性對照不加藥組（即陰性對照組SGC-7901 胃癌細(xì)胞，不加藥）、陰性對照加藥組（即陰性對照組SGC-7901 胃癌細(xì)胞，加入濃度為100μg/mL 的β-欖香烯藥物）；實驗不加藥組（即實驗組SGC-7901 胃癌細(xì)胞，不加藥）、實驗加藥組（即實驗組SGC-7901 胃癌細(xì)胞，加入濃度為100μg/mL的β-欖香烯藥物），每組設(shè)3 個復(fù)孔。加藥處理24h后每孔加入20μL 濃度為5mg/mL 的MTT 溶液。孵育4h 后徹底吸盡培養(yǎng)液，每孔加入150μL DMSO。經(jīng)振蕩器震蕩3～5min 后，用酶標(biāo)儀490nm 檢測OD值，計算抑制率。細(xì)胞抑制率=（1-OD加藥組/OD對照組）×100%。

表1 針對Beclin1 基因的shRNA 和陰性對照shRNA

2.4 Western blot 檢測LC3-II、P62 蛋白 收集空白對照組、空白對照加藥組、實驗加藥組、陰性對照加藥組的胃癌細(xì)胞，提取總蛋白并測定蛋白質(zhì)濃度。取相同質(zhì)量的蛋白樣品上樣SDS-PAGE 凝膠（12%分離膠，5%濃縮膠）電泳分離。電泳結(jié)束后，使用轉(zhuǎn)移電泳裝置，在4℃、300mA 恒流條件下電轉(zhuǎn)150min，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。用封閉液（含5%脫脂牛奶的TBST 溶液）4℃下封閉PVDF 膜過夜，孵育一抗、二抗。PVDF 膜置于平鋪好的保鮮膜上，以1:40的比例混合ECL 試劑盒中的A 液和B 液，混合液均勻滴加在PVDF 膜上，避光反應(yīng)5min。將膜取出，稍稍瀝干多余的ECL 底物反應(yīng)液，放入暗盒，鋪上保鮮膜，放上X 光片，關(guān)上暗盒，曝光1～2min。取出X 光片，放入顯影液中，約1min 后取出，在清水中漂洗幾min，后放入定影液中至少2min，取出X 光片再次用清水漂洗，晾干。以GAPDH 為內(nèi)參。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（） 表示，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩組均數(shù)比較采用t 檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 重組慢病毒質(zhì)粒的鑒定 前期實驗中，課題組根據(jù) Genebank 提供的人 Beclin1 基因信息（NM_003766）設(shè)計3 條小干擾RNA（siRNA）序列，同時選用公認(rèn)陰性對照序列。合成上述序列的短發(fā)夾RNA（shRNA），分別命名為Beclin1-shRNA1、Beclin1-shRNA2、Beclin1-shRNA3，NC-shRNA（見表1）。退火反應(yīng)生成dsDNA，將獲得的dsDNA 連接到經(jīng)Age I、EcoR I 雙酶切的GV112 載體，即獲得Beclin1-shRNA 慢病毒載體，分別命名為實驗1（GV112-Beclin1-shRNA1）、實驗2（GV112-Beclin1-shRNA2）、實驗3（GV112-Beclin1-shRNA3）、陰性對照（GV112-NC-shRNA）。經(jīng)陽性克隆的PCR 鑒定及測序分析驗證，Beclin1 基因RNAi 慢病毒載體構(gòu)建成功。

3.2 基因沉默效果鑒定 Real Time PCR 檢測慢病毒感染后各組SGC-7901 細(xì)胞Beclin1 相對表達量，以陰性對照組（感染GV112-NC-shRNA 的SGC-7901 細(xì)胞）作為對照，采用2-ΔΔCt 法分析比較，結(jié)果顯示，相對于陰性對照組，實驗1 組（感染GV112-Beclin1-shRNA1 的SGC-7901 細(xì)胞）、實驗2 組（感染GV112-Beclin1-shRNA2 的SGC-7901 細(xì)胞）、實驗3 組（感染GV112-Beclin1-shRNA3 的SGC-7901細(xì)胞）的Beclin1 mRNA 相對表達量顯著降低（P＜0.01，見表2）。其中實驗1 組Beclin1 基因沉默效率達91.8%，判定實驗1 為最有效干擾載體。為進一步確定穩(wěn)定篩選是否成功，選取最有效干擾載體實驗1組和陰性對照組行Western blot 檢測，兩組樣本GAPDH 蛋白表達一致，實驗1 組Beclin1 目的條帶明顯減弱（見圖1），證明在蛋白質(zhì)水平實驗1 沉默目的基因有效。

圖1 Western blot 鑒定實驗1 組Beclin1 蛋白表達

表2 感染重復(fù)3 次Beclin1 基因相對表達量（）

表2 感染重復(fù)3 次Beclin1 基因相對表達量（）

注:陰性對照組為感染GV112-NC-shRNA 的SGC-7901 細(xì)胞；實驗1組為感染GV112-Beclin1-shRNA1 的SGC-7901 細(xì)胞；實驗2 組為感染GV112-Beclin1-shRNA2 的SGC-7901 細(xì)胞；實驗3 組為感染GV112-Beclin1-shRNA3 的SGC-7901 細(xì)胞；與陰性對照組比較，aP＜0.01

3.3 β-欖香烯抑制SGC-7901 細(xì)胞增殖作用 不同濃度的β-欖香烯作用人胃癌SGC-7901 細(xì)胞，24h后測定OD 值，計算抑制率。結(jié)果顯示，β-欖香烯能夠抑制胃癌細(xì)胞增殖，且抑制作用隨濃度的增加而遞增。濃度20、50、100μg/mL 時的抑制率分別為21.5%、31.7%和37.4%，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。濃度為10μg/mL 時抑制率14.0%，與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 MTT 法檢測不同濃度β-欖香烯對胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖的影響（）

表3 MTT 法檢測不同濃度β-欖香烯對胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖的影響（）

注:與0μg/mL 比較，bP＜0.05，bbP＜0.01

3.4 β-欖香烯誘導(dǎo)SGC-7901 細(xì)胞發(fā)生自噬作用選用濃度為100μg/mL 的β-欖香烯作用于SGC-7901 細(xì)胞，24h 后Western blot 檢測LC3-Ⅱ、P62 蛋白表達。與空白對照組比較，經(jīng)β-欖香烯處理24h后，空白對照加藥組的LC3-Ⅱ蛋白表達顯著上調(diào)，P62 蛋白表達下降（見圖2），表明β-欖香烯在抑制胃癌SGC-7901 增殖的同時，也誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生。

圖2 Western blot 檢測β-欖香烯處理SGC-7901 細(xì)胞后LC3-Ⅱ、P62 的蛋白表達

3.5 GV112-Beclin1-shRNA1 感染SGC-7901 細(xì)胞慢病毒感染人胃癌SGC-7901 細(xì)胞72h 后，加入Puromycin 進行藥篩處理，維持藥物濃度為3μg/mL，24h 后未感染慢病毒的空白對照組細(xì)胞全部死亡，感染重組慢病毒后的細(xì)胞存活且狀態(tài)良好（見圖3）。

圖3 倒置顯微鏡下，嘌呤霉素篩選后人胃癌SGC-7901 細(xì)胞的存活情況（×100 明亮視野）

3.6 沉默Beclin1 基因?qū)Ζ?欖香烯誘導(dǎo)自噬及抗癌效果的影響 GV112-Beclin1-shRNA1、GV112-NCshRNA 慢病毒顆粒感染SGC-7901 細(xì)胞后，Western blot 檢測發(fā)現(xiàn)，與陰性對照組比較，實驗組LC3-Ⅱ蛋白表達下降，P62 蛋白表達升高（見圖4），表明沉默Beclin1 基因可抑制胃癌細(xì)胞的自噬活性。加入濃度為100μg/mL 的β-欖香烯，24h 后采用Western blot 檢測自噬相關(guān)蛋白。與陰性對照加藥組比較，實驗加藥組的LC3-Ⅱ蛋白表達水平明顯下降，P62 蛋白表達增加（見圖4），表明自噬作用受到抑制。MTT 結(jié)果顯示，實驗加藥組細(xì)胞抑制率42.3%，陰性對照加藥組的細(xì)胞抑制率為36.1%，實驗加藥組對胃癌細(xì)胞的抑制效果強于陰性對照加藥組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表4。

圖4 沉默Beclin1 基因?qū)?xì)胞自噬及β-欖香烯自噬誘導(dǎo)作用的影響

表4 MTT 法檢測沉默Beclin1 基因?qū)Ζ?欖香烯抑制胃癌增殖的影響

4 討論

欖香烯注射液，由姜科植物溫郁金（溫莪術(shù)）中提取，以β-欖香烯為主要成分。本研究顯示，β-欖香烯對人胃癌SGC-7901 細(xì)胞有明顯的抑制增殖的作用，且該作用隨著β-欖香烯濃度的升高而增強，呈現(xiàn)劑量依賴性。自噬（Autophagy）被稱為Ⅱ型程序性死亡，是細(xì)胞降解并回收利用長壽蛋白質(zhì)及細(xì)胞器等成分而維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的分解代謝過程，與包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病有密切的關(guān)聯(lián)[5-6]。LC3 是自噬的標(biāo)志性因子，自噬發(fā)生時，LC3-I 酯化形成LC3-II 并定位于自噬體的膜上，LC3-II 的高低可反映自噬水平[6]。P62 是評價自噬體降解的重要指標(biāo)，當(dāng)自噬被激活時，P62 會與泛素化的蛋白質(zhì)及自噬體膜上的LC3-Ⅱ結(jié)合形成復(fù)合物，在自噬溶酶體內(nèi)完成降解過程[7]，P62 的表達水平與自噬活化程度呈負(fù)相關(guān)。本研究選用100μg/mL 的β-欖香烯作用于SGC-7901細(xì)胞，觀察到LC3-Ⅱ蛋白明顯增加，P62 蛋白明顯下降，提示β-欖香烯誘導(dǎo)SGC-7901 細(xì)胞發(fā)生了自噬，通過慢病毒顆粒感染SGC-7901 細(xì)胞后，加入β-欖香烯后細(xì)胞自噬活性較前增強，從而再次證明欖香烯誘導(dǎo)細(xì)胞自噬發(fā)生。

研究顯示，自噬在腫瘤細(xì)胞中具有抑制和保護的雙重作用，自噬與惡性腫瘤的關(guān)系可以根據(jù)腫瘤微環(huán)境、腫瘤類型和其他因素的變化而變化。有學(xué)者提出，在腫瘤早期，細(xì)胞自噬可以通過消除突變或受損的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器等成分以維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)、抑制腫瘤發(fā)展；在進展期，當(dāng)腫瘤細(xì)胞處于營養(yǎng)匱乏、缺氧及抗腫瘤治療等應(yīng)激環(huán)境時，升高的自噬活性通過介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)能量和代謝產(chǎn)物循環(huán)利用，協(xié)助癌細(xì)胞逃避損害，維持腫瘤的生長，即保護性自噬[8]。亦有研究表明，藥物誘導(dǎo)的自噬既可以是自噬性細(xì)胞死亡，也可以是保護性自噬拮抗其抗腫瘤活性[9]。

自噬的發(fā)生受到多種分子機制的調(diào)控影響，其中Beclin1 基因起到重要作用[10]。Beclin1 是自噬過程的正向調(diào)控基因[11]，通過與PI3K3 結(jié)合形成復(fù)合物，參與吞噬泡的聚集與組裝，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬[12]。研究證實，上調(diào)Beclin1 在哺乳動物細(xì)胞中的表達能夠刺激自噬的發(fā)生，而沉默Beclin1 基因則會引起自噬水平的降低[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，沉默Beclin1 基因可下調(diào)SGC-7901 細(xì)胞的自噬活性，并可抑制β-欖香烯對SGC-7901 細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)作用，但增強β-欖香烯對SGC-7901 細(xì)胞增殖的抑制作用。由此認(rèn)為，β-欖香烯誘導(dǎo)SGC-7901 細(xì)胞發(fā)生保護性自噬，這與Liu等[1]研究結(jié)果一致，沉默Beclin1 基因的表達能夠增強β-欖香烯的抗癌作用。

綜上所述，β-欖香烯能夠劑量依賴性的抑制胃癌細(xì)胞增殖，在抑制增殖的同時也誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生保護性自噬，Beclin1 基因或為其誘導(dǎo)保護性自噬的靶點。沉默Beclin1 基因能夠抑制保護性自噬的發(fā)生，并且提高β-欖香烯的抗腫瘤增殖作用。