徐冬梅　李亞英　耿海波　李玉靜

摘 要：為建立呋喃西林代謝物氨基脲（semicarbazide，SEM）的免疫學(xué)檢測(cè)方法，采用碳化二亞胺法成功合成人工免疫抗原SEM-牛血清白蛋白（bovine serum albumen，BSA）（SEM-BSA），并用該抗原免疫BALB/c小鼠，采用聚乙二醇介導(dǎo)的細(xì)胞融合技術(shù)制備SEM的單克隆抗體（SEM mAb），采用辛酸-硫酸銨沉淀法純化單抗，并對(duì)其效價(jià)、敏感性、特異性和親和力等免疫學(xué)特性進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明：成功制備SEM單克隆抗體SEM-3D9，抗體效價(jià)達(dá)到1∶5×106，敏感性半抑制質(zhì)量濃度為0.42 μg/L，亞型為IgG1，親和常數(shù)Ka=2.1×108 L/mol，與呋喃唑酮代謝物2-NP-3-氨基-2-惡唑酮、呋喃它酮代謝物2-NP-5-甲基嗎啉-3-氨基-2-唑烷基酮類(lèi)似物的交叉反應(yīng)率（cross reaction，CR）均小于0.01%，與呋喃妥因代謝物2-NP-1-氨基-2-乙內(nèi)酰的CR為0.016 8%，特異性良好。

關(guān)鍵詞：呋喃西林代謝物;氨基脲;細(xì)胞融合;單克隆抗體;免疫學(xué)特性

Abstract： In order to establish an immunological method for the detection of the furacillin metabolite semicarbazide （SEM）， a conjugate of SEM with bovine serum albumin （BSA） was synthesized by the carbodiimide method and was used as an immunogen to immunize BALB/c mice for the preparation of a monoclonal antibody against SEM （SEM mAb） by polyethylene glycol （PEG）-mediated cell fusion. SEM mAb was purified by caprylic acid-ammonium sulfate precipitation. Finally， the immunological characteristics of the monoclonal antibody including titer， sensitivity， specificity and affinity were identified. The results showed that the monoclonal antibody SEM-3D9 was successfully prepared. The serum titer of immunized mice was 1：5 × 106， the sensitivity IC50 was 0.42 μg/L， and the antibody belonged to IgG1 subtype with an affinity constant Ka of 2.1 × 108 L/mol. Its cross-reaction rate with 2-NP-3-amino-2-oxazolidinone and 2-nitrophenyl-5-morpholine-methyl-3-amino-2-oxazolidinone analogues was less than 0.01%， and its cross-reaction rate with 2-nitrophenyl-1-aminohydantoin was 0.016 8%， indicating good specificity.

Keywords： furacillin metabolite; semicarbazide; cell fusion; monoclonal antibody; immunological characteristics

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20191029-253

中圖分類(lèi)號(hào)：TS251.7? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2020）03-0058-05

呋喃西林是一種硝基呋喃類(lèi)藥物，可抑制或殺滅多種革蘭氏菌以及某些真菌和原蟲(chóng)，主要用于預(yù)防和治療腸道細(xì)菌感染，在畜牧、水產(chǎn)養(yǎng)殖中得到廣泛應(yīng)用[1]，該類(lèi)藥物及其代謝物屬于硝基雜環(huán)類(lèi)化合物，具有細(xì)胞誘變性和動(dòng)物致癌毒性[2]，已引起臨床高度重視，歐盟、日本和美國(guó)[3]等大部分國(guó)家和地區(qū)已禁止呋喃西林等4 種硝基呋喃類(lèi)藥物在肉類(lèi)食品中的殘留，我國(guó)在2002年也將該類(lèi)抗生素列為食源性動(dòng)物禁止使用藥物[4]。在4 種硝基呋喃類(lèi)藥物中，呋喃西林類(lèi)藥物殘留量最多[5]，毒性也最大[6]。在畜禽養(yǎng)殖過(guò)程中呋喃西林類(lèi)藥物中毒事件時(shí)有報(bào)道[7-8]。呋喃西林在動(dòng)物體內(nèi)會(huì)被迅速代謝[9]，不易檢測(cè)，其代謝產(chǎn)物氨基脲（semicarbazide，SEM）能與細(xì)胞內(nèi)蛋白長(zhǎng)期結(jié)合，存留較長(zhǎng)時(shí)間[10-12]，因此，通常將其代謝產(chǎn)物作為呋喃西林類(lèi)藥物殘留檢測(cè)的標(biāo)識(shí)物[13]。

目前，呋喃西林代謝物的檢測(cè)方法主要有紫外分光光度法[14-15]、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）等儀器方法，以及以酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、膠體金免疫層析為主的免疫學(xué)分析方法[16-17]。傳統(tǒng)紫外分光光度法檢測(cè)靈敏度低，不能滿足微量代謝物檢測(cè)要求。HPLC、LC-MS等方法能隨時(shí)進(jìn)行精確檢測(cè)[18-19]，靈敏、準(zhǔn)確，主要作為確證方法，目前已出臺(tái)多項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)，如GB/T 18932.24—2005《蜂蜜中呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃唑酮代謝物殘留量的測(cè)定方法 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》規(guī)定了蜂蜜中呋喃西林代謝物殘留量的LC-MS/MS測(cè)定方法，SN/T 3648—2013《飼料中呋喃唑酮、呋喃妥因、呋喃它酮、呋喃西林含量的檢測(cè)方法 液相色譜法》規(guī)定了飼料中呋喃西林含量的HPLC檢測(cè)方法，GB/T 22987—2008《牛奶和奶粉中呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃唑酮代謝物殘留量的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》規(guī)定了牛乳和乳粉中呋喃西林代謝物殘留量的LC-MS/MS檢測(cè)方法，但該方法儀器設(shè)備昂貴、操作繁瑣、檢測(cè)成本高，不適合現(xiàn)場(chǎng)批量檢測(cè)，嚴(yán)重影響了使用此方法進(jìn)行非法添加檢測(cè)的監(jiān)管和風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警。免疫學(xué)分析方法[20-21]具有快速、靈敏、準(zhǔn)確、方便、檢測(cè)成本低、分析容量大等優(yōu)點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)批量快速定性及定量分析，已成為目前最有效的初篩技術(shù)手段[22-25]。

目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已開(kāi)展了呋喃西林代謝物免疫學(xué)分析方法研究，但受抗體質(zhì)量的限制，方法的檢測(cè)靈敏度和特異性還有待提高，如吳鵬等[26]建立動(dòng)物性食品中呋喃西林代謝物間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法，該試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線的半抑制質(zhì)量濃度（half inhibitory concentration，IC50）為0.267 7 μg/L;趙承彪[27]制備了抗呋喃西林多克隆抗體，抗體的敏感性IC50為10.5 μg/L。本研究采用碳化二亞胺法[28-29]合成SEM人工抗原，制備其高特異、靈敏的單克隆抗體，并對(duì)抗體的免疫學(xué)特性進(jìn)行鑒定，為呋喃西林代謝物免疫學(xué)檢測(cè)方法的建立提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

骨髓瘤SP2/0細(xì)胞 本研究室保存;BALB/c小鼠? ?河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

PEG4000、鹽酸氨基脲（SEM·HCl）、牛血清白蛋白（bovine serum albumen，BSA）、卵清白蛋白（ovalbumin，OVA） 生工生物工程（上海）股份有限公司;免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）亞型試劑盒?Sigma-Aldrich（上海）貿(mào)易有限公司;HAT選擇性培養(yǎng)基 美國(guó)Gibico公司;弗氏完全與不完全佐劑?Pierce生物技術(shù)公司;SEM與對(duì)羧基苯甲醛的衍生物（CPSEM）、SEM-BSA、SEM-OVA 本研究室自制;N-羥基琥珀酰亞胺 北京百靈威科技有限公司;1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽 梯希愛(ài)（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司;鄰醛基苯甲酸、對(duì)醛基苯甲酸 阿拉丁試劑（上海）有限公司;N，N-二甲基甲酰胺 上海麥克林生物化學(xué)有限公司;辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠IgG 北京中杉金橋生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Milli-Qingegrallo超純水系統(tǒng) 德國(guó)密理博公司;BS 124S電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司;NanoDrop 2000紫外掃描儀、Micro17超速離心機(jī)、Wellwash AC洗板機(jī) 賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司;MCO-15AC二氧化碳培養(yǎng)箱 日本Sanyo公司;SW-CJ-1F凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司;IX51倒置顯微鏡 Olympus（中國(guó)）有限公司;MS105DU電子分析天平 梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司;YDS-65-216液氮罐 成都金鳳液氮容器有限公司;Avanti JXN-26高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Beckman Coulter公司;DK-S24電熱恒溫水浴鍋 上海精宏設(shè)備有限公司;Varioskan LUX酶標(biāo)儀 美國(guó)Bio-Tek儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 SEM人工抗原的合成與鑒定

抗原合成采用碳化二亞胺法，鑒定采用紫外分光光度法和十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）法[30]，并采用朗伯-比爾定律計(jì)算偶聯(lián)比[31-32]。

1.3.2 動(dòng)物免疫

用生理鹽水將免疫原CPSEM-BSA稀釋?zhuān)c等體積弗氏不完全佐劑混勻后頸背部免疫BALB/c小鼠，免疫劑量為40 μg/只，免疫4 次，每次間隔2 周。第4次免疫1 周后取血，用間接ELISA法測(cè)定抗血清效價(jià)，競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定抗血清是否敏感，最終選取效價(jià)高、敏感性好的免疫小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合。

1.3.3 雜交瘤細(xì)胞的制備

選擇敏感性好且血清效價(jià)高的小鼠進(jìn)行腹腔加強(qiáng)免疫，3 d后用于細(xì)胞融合。采用間接和競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)融合細(xì)胞上清的抗體效價(jià)和對(duì)呋喃西林代謝物的抑制率，采用有限稀釋方法將陽(yáng)性孔克隆化，直至成功建立單一分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株為止，將雜交瘤細(xì)胞株保存于-20 ℃待用。

1.3.4 單克隆抗體的制備與純化

采用小鼠體內(nèi)誘生腹水的方法獲取單克隆抗體。將篩選得到的能穩(wěn)定分泌SEM抗體的雜交瘤細(xì)胞（細(xì)胞數(shù)約為106 個(gè)/mL）注射到石蠟油致敏的BALB/c小鼠腹腔，每只注射1 mL，7～10 d后取腹水。腹水采用辛酸-硫酸銨方法純化，并采用考馬斯亮藍(lán)法對(duì)純化的抗體質(zhì)量濃度進(jìn)行測(cè)定[33]。

1.3.5 單克隆抗體抗效價(jià)測(cè)定

參照李春生等[34]的方法，采用間接ELISA法測(cè)定抗體效價(jià)。

1.3.6 單克隆抗體敏感性測(cè)定

將呋喃西林代謝物衍生物的標(biāo)準(zhǔn)品母液用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）稀釋成質(zhì)量濃度分別為8.1、2.7、0.9、0.3、0.1 μg/L，采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)SEM抗體敏感性，以IC50表示[35]。

1.3.7 單克隆抗體免疫球蛋白亞型鑒定

使用單克隆抗體亞型試劑盒測(cè)定抗體亞型。

1.3.8 單克隆抗體親和常數(shù)（Ka）測(cè)定

采用間接ELISA法[36]測(cè)定Ka，按下式計(jì)算。

式中：ρ為當(dāng)抗原質(zhì)量濃度為a時(shí)，吸光度最高值的50%所對(duì)應(yīng)的抗體質(zhì)量濃度/（μg/mL）;ρ為當(dāng)抗原質(zhì)量濃度為b時(shí)，吸光度最高值的50%所對(duì)應(yīng)的抗體質(zhì)量濃度/（μg/mL）;a=nb;n為稀釋倍數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Statistica統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用Origin制圖軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 單克隆抗體的獲取

4 免后，3 只小鼠抗血清經(jīng)測(cè)定，效價(jià)均達(dá)到1∶105以上，敏感性IC50小于7 ng/mL。其中SEM-3號(hào)小鼠抗血清效價(jià)為1∶2×105，敏感性IC50小于1.5 ng/mL，選擇該小鼠加強(qiáng)免疫后用于細(xì)胞融合。融合5 板，融合率達(dá)到88.7%，陽(yáng)性克隆率達(dá)到19.6%，經(jīng)亞克隆，篩選得到1 株能夠穩(wěn)定分泌SEM抗體的細(xì)胞株，命名為3D9。擴(kuò)大培養(yǎng)后，采用小鼠體內(nèi)誘生腹水的方法制備腹水，腹水經(jīng)辛酸-硫酸銨法純化后得到抗SEM單克隆抗體，命名為SEM-3D9，經(jīng)測(cè)定抗體質(zhì)量濃度為8.6 mg/mL。

2.2 SEM-3D9效價(jià)測(cè)定結(jié)果

P為待測(cè)陽(yáng)性對(duì)照孔A450 nm）作為效價(jià)測(cè)定結(jié)果。由表1可知，當(dāng)SEM-3D9稀釋比例為1∶512 000時(shí)，P/N為3.38，確定SEM-3D9的效價(jià)為1∶5×106。

2.3 SEM-3D9敏感性測(cè)定結(jié)果

用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定SEM-3D9對(duì)不同質(zhì)量濃度呋喃西林代謝物2-NP-二硝基苯甲醛酸脲（2-NP-benzaldehydesemicarbazone，NPSEM）的標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線。以B/B0（%）（B為不同質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的A450 nm，B0為零濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的A450 nm）為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)（lg ρNPSEM）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線，進(jìn)行回歸分析，并計(jì)算IC50。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度0.1～8.1 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-0.335 1x+0.384 2（R2=0.992 7），IC50為0.42 μg/L。

2.4 SEM-3D9亞型測(cè)定結(jié)果

雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體與不同亞型的免疫球蛋白反應(yīng)后顯色有明顯差異。由圖1可知，SEM-3D9與IgG1抗體反應(yīng)的A450 nm最高，與IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM和IgA反應(yīng)的A450 nm小于0.5，為陰性，因此SEM-3D9單克隆抗體亞型為IgG1。

2.5 SEM-3D9 Ka測(cè)定結(jié)果

以SEM-3D9質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，A450 nm為縱坐標(biāo)繪制“S”型曲線。由圖2可知，SEM-3D9的Ka為2.1×108 L/mol。

2.6 SEM-3D9特異性測(cè)定結(jié)果

通過(guò)將SEM-3D9與NPSEM、呋喃唑酮代謝物2-NP-3-氨基-2-惡唑酮（2-nitrophenyl-3-amino-2-oxazolidinone，NPAOZ）、呋喃它酮代謝物2-NP-5-甲基嗎啉-3-氨基-2-唑烷基酮（2-nitrophenyl-5-morpholine-methyl-3-amino-2-oxazolidinone，NPAMOZ）、呋喃妥因代謝物2-NP-1-氨基-2-乙內(nèi)酰（2-nitrophenyl-1-aminohydantoin，NPAHD）分別進(jìn)行交叉反應(yīng)，檢測(cè)SEM-3D9的特異性。計(jì)算交叉反應(yīng)率（cross reaction ratio，CR），表示為SEM-3D9的IC50與各結(jié)構(gòu)類(lèi)似物的IC50比值。

由表2可知，SEM-3D9與NPAOZ、NPAMOZ的CR均小于0.01%，與NPAHD的CR為0.016 8%，特異性良好。

3 結(jié) 論

使用SEM-BSA作為抗原，免疫BALB/c小鼠，獲得分泌抗SEM特異性抗體的融合細(xì)胞，篩選出1 株效果較好的細(xì)胞株3D9。通過(guò)小鼠體內(nèi)誘生腹水，采用辛酸-硫酸銨方法進(jìn)行純化，得到單克隆抗體SEM-3D9。免疫學(xué)特性測(cè)定結(jié)果表明，SEM-3D9效價(jià)為1∶5×106，亞型為IgG1，Ka為2.1×108 L/mol，敏感性IC50為0.42 μg/L，與NPAOZ、NPAMOZ類(lèi)似物的CR均小于0.01%，與NPAHD的CR為0.016 8%，特異性良好。本研究得到的高特異性、高靈敏度的SEM單克隆抗體為SEM代謝物殘留免疫檢測(cè)方法的建立提供了參考。

參考文獻(xiàn)：

[1] NOUWS J F M， LAURENSEN J. Postmortal degradation of furazolidone and furaltadone in edible tissues of calves[J]. Tijdschrift voor diergeneeskunde， 1991， 116（7）： 359-362. DOI：10.1080/01652176.

1990.9694243.

[2] ALI B H. Pharmacological therapeutic and toxicological properties of furazolidone： some recent research[J]. Veterinary Research Communications， 1999， 23（6）： 343-360. DOI：10.1023/a：1006333608012.

[3] 曉林. FDA： 進(jìn)口動(dòng)物食品禁用11 種藥物[J]. 中國(guó)家禽， 2002， 24（14）： 47. DOI：10.3969/j.issn.1004-6364.2002.14.027.

[4] 中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部. 動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量[EB/OL].

[2002-12-24] （2019-10-28）. http：//www.moa.gov.cn/gk/tzgg_1/gg/200302/t20030226_59300.htm.

[5] VASS M， HRUSKA K， FRANEK M. Nitrofuran antibiotics： a review on the application， prohibition and residual analysis[J]. Veterinarni Medicina， 2008， 53（9）： 469-500. DOI：10.1111/j.1865-1682.2008.01041.x.

[6] 王習(xí)達(dá)， 陳輝， 左健忠， 等. 水產(chǎn)品中硝基呋喃類(lèi)藥物殘留的檢測(cè)與控制[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技， 2007（18）： 152-153. DOI：10.3969/j.issn.1007-5739.2007.18.120.

[7] 葉培芝. 慎防呋喃西林中毒[J]. 福建農(nóng)業(yè)， 2002， 2（1）： 19.

[8] 林锏銳， 唐媛媛， 詹海毅， 等. 2013—2018年湛江進(jìn)出口水產(chǎn)品獸藥殘留結(jié)果分析[J]. 檢驗(yàn)檢疫學(xué)刊， 2019， 3（1）： 1-4.

[9] MCCRACKEN R J， JOHN B W， CHRIS R， et al. Determination of furazolidone in porcine tissue using thermospray liquid chromatographymass spectrometry and a study of the pharmacokinetics and stability of its residues[J]. Analyst， 1995， 120（9）： 2347-2351. DOI：10.1039/AN9952002347.

[10] 劉永濤， 艾曉輝， 索紋紋， 等. 呋喃唑酮代謝物AOZ在斑點(diǎn)叉尾體內(nèi)組織分布與消除規(guī)律研究[J]. 淡水漁業(yè)， 2012， 42（5）： 38-44. DOI：10.3969/j.issn.1000-6907.2012.05.008.

[11] WICKRAMANAYAKE P U， TRAN T C. Simultaneous separation of nitrofuran antibiotics and their metabolites by using micellar electrokinetic capillary chromatography[J]. Electrophoresis， 2006， 27（20）： 4069-4077. DOI：10.1002/elps.200600105.

[12] HOOGENBOOM L A P， TOMASSINI O， OORSPRONG M B M， et al. Use of pig hepatocytes to study the inhibition of monoamine oxidase by furazolidone[J]. Food and Chemical Toxicology， 1991， 29（3）： 185-191. DOI：10.1016/0278-6915（91）90036-7.

[13] MCCRACKENN R J， KENNEDY D G. Detection， accumulation and distribution of nitrofuran residues in egg yolk， albumen and shell[J]. Food Additives and Contaminants， 2007， 24（1）： 26-33. DOI：10.1080/02652030600967214.

[14] 歐翠華， 陳江飛， 胡毅堅(jiān)， 等. 紫外分光光度法測(cè)定呋喃西林氧化鋅搽劑中主藥的含量[J]. 中國(guó)藥房， 2007， 18（31）： 2461-2462. DOI：10.3969/j.issn.1001-0408.2007.31.028.

[15] 吳誠(chéng)， 曹淼， 張麗平， 等. 高效液相色譜法和紫外分光光度法測(cè)定呋喃西林含量的比較研究[J]. 中國(guó)藥業(yè)， 2015（4）： 34-36.

[16] 李斌. 呋喃西林代謝物SEM單克隆抗體的制備及其熒光定量檢測(cè)試紙條的研究[D]. 廣州： 華南理工大學(xué)， 2017： 44-67.

[17] 桂文龍， 蘇治國(guó)， 徐婷婷. HPLC-MS/MS檢測(cè)豬肉中4 種硝基呋喃類(lèi)代謝物殘留[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2018， 46（23）： 220-223. DOI：10.15889/j.issn.1002-1302.2018.23.0540.

[18] RADOVNIKOVIC A， MOLONEY M， BYRNE P. Detection of banned nitrofran metabolites in animal plasma samples using UHPLC-MS/MS[J]. Journal of Chromatography B， 2011， 879（2）： 159-166. DOI：10.1016/j.jchromb.2010.11.036.

[19] HORMAZ?BAL V， NORMAN ASP T. Determination of the metabolites of nitrofuran antibiotics in meat by liquid chromatography-mass spectrometry[J]. Journal of Liquid Chromatography and Related Technologies， 2004， 27（17）： 2759-2770. DOI：10.1081/JLC-200029335.

[20] 中華人民共和國(guó)江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局， 中華人民共和國(guó)常州出入境檢驗(yàn)檢疫局， 中華人民共和國(guó)山東出入境檢驗(yàn)檢疫局， 等.

出口動(dòng)物源食品中硝基呋喃代謝物殘留量的測(cè)定 酶聯(lián)免疫吸附法： SN/T 3380—2012[S]. 北京： 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社， 2012.

[21] 中華人民共和國(guó)商務(wù)部. 動(dòng)物組織中呋喃唑酮代謝物殘留的測(cè)定 酶聯(lián)免疫吸附法： SB/T 10927—2012[S]. 北京： 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社， 2013.

[22] 羅杰， 李健. 呋喃唑酮間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA（ciELISA）檢測(cè)法的建立[J]. 中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2005， 35（2）： 213-218. DOI：10.3969/j.issn.1672-5174.2005.02.008.

[23] 任海濤， 沈玉棟， 徐振林， 等. 呋喃西林代謝物多克隆抗體制備及酶聯(lián)免疫吸附分析方法[J]. 食品工業(yè)科技， 2012， 33（5）： 330-333; 379.

[24] 常文保， 張柏林， 慈云祥. 藥物免疫分析及其進(jìn)展[J]. 分析化學(xué)， 1994， 11（1）： 1167-1175.

[25] 李興霞， 王國(guó)霞， 潘家榮. 免疫分析新方法在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用[J]. 生物技術(shù)通報(bào)， 2006（1）： 42-45. DOI：10.3969/j.issn.1002-5464.2006.01.011.

[26] 吳鵬， 萬(wàn)宇平， 陶光燦， 等. 呋喃西林代謝物酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法的建立[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2013， 41（5）： 1969-1971. DOI：10.3969/j.issn.0517-6611.2013.05.034.

[27] 趙承彪. 加替沙星、呋喃西林在食品中殘留的酶聯(lián)免疫檢測(cè)法的研究[D]. 濟(jì)南： 山東大學(xué)， 2008： 48-52.

[28] CLIQUET P， COX E， VAN DORPE C， et al. Generation of class-selective monoclonal antibodies against the penicillin group[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2001， 49（7）： 3349-3355. DOI：10.1021/jf001428k.

[29] 李君華， 吳萌， 程華， 等. 西馬特羅單克隆抗體的制備及免疫學(xué)特性鑒定[J]. 畜牧與獸醫(yī)， 2016， 48（3）： 123-126.

[30] KAMPS-HOLTZAPPLE C， CARLIN R J， SHEFFIELD C， et al. Analysis of hapten-carrier protein conjugates by nondenaturing gel electrophoresis[J]. Journal of Immunological Methods， 1993， 164（2）： 245-253. DOI：10.1016/0022-1759（93）90317-Z.

[31] 楊利國(guó)， 胡少昶， 魏平華， 等. 酶免疫測(cè)定技術(shù)[M]. 南京： 南京大學(xué)出版社， 1998： 252-258.

[32] 呂會(huì)田， 樂(lè)加昌， 陳存社. 克倫特羅小分子半抗原偶聯(lián)比率的測(cè)定方法研究[J]. 中國(guó)飼料， 2005， 26（7）： 33-35. DOI：10.3969/j.issn.1001-991X.2005.03.018.

[33] LI Junhua， LI Chunsheng， WU Meng， et al. Development of an ultrasensitive immunochromatographic assay （ICA） strip for the rapid detection of phenylethanolamine a in urine and pork samples[J]. Journal of Food Science， 2015， 80（4）： T894-T899. DOI：10.1111/1750-3841.12814.

[34] 李春生， 劉靜靜， 杜順豐， 等. 呋喃唑酮代謝物單克隆抗體和膠體金免疫層析試紙條的研制[J]. 現(xiàn)代食品科技， 2017， 33（6）： 1-6.

[35] LI Chunsheng， LI Yujing， ZHANG Yan， et al. Preparation of an anti-formoterol monoclonal antibody for indirect competitive ELISA detection of formoterol in urine and pork samples[J]. Analytical Methods， 2018， 10（5）： 548-553. DOI：10.1039/c7ay02562a.

[36] BEATTY J D， BEATTY B G， VLAHOS W G. Measurement of monoclonal antibody affinity by non-competitive enzyme immunoassay[J]. Journal of Immunological Methods， 1983， 100（1/2）： 173-179. DOI：10.1016/0022-1759（87）90187-6.