張明，帥希祥，馬飛躍，杜麗清

（中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所，農(nóng)業(yè)部熱帶果樹(shù)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東湛江524091）

澳洲堅(jiān)果（Macadamia tetraphylla L.），又稱(chēng)夏威夷果、昆士蘭果等，是一種原產(chǎn)于澳大利亞?wèn)|部亞熱帶雨林的山龍眼科澳洲堅(jiān)果屬多年生常綠果樹(shù)[1]。1979年，我國(guó)開(kāi)始引進(jìn)商業(yè)性品種并進(jìn)行環(huán)境適應(yīng)性試驗(yàn)[2]。經(jīng)過(guò)近40年的研究與發(fā)展，我國(guó)澳洲堅(jiān)果種植面積已超越澳大利亞和南非，成為種植面積最大的國(guó)家[3]，相關(guān)研究也日益增多。

當(dāng)前，國(guó)內(nèi)外對(duì)澳洲堅(jiān)果的研究主要集中于種植技術(shù)、病蟲(chóng)害防治，果仁油脂加工及副產(chǎn)物的綜合利用等[4-9]，對(duì)澳洲堅(jiān)果葉片的報(bào)道相對(duì)較少。R.A.Step-henson等[10]研究了氣候、品種、土壤和葉片營(yíng)養(yǎng)狀況等對(duì)澳洲堅(jiān)果產(chǎn)量的影響。Stephen Wesley Herbert等[11]對(duì)昆士蘭東南部澳洲堅(jiān)果葉片中氮、鉀、磷、鈣、硼等的營(yíng)養(yǎng)水平季節(jié)性模式進(jìn)行研究。已有研究表明，植物葉片中含有豐富的酚類(lèi)等活性成分，如芒果、番石榴等[12-13]。朱澤燕等[14]采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS） 對(duì)澳洲堅(jiān)果幼葉揮發(fā)性成分進(jìn)行鑒定，其中，共鑒定出對(duì)羥基苯甲醛、3，5-二叔丁級(jí)-4-羥基苯甲醛2種酚類(lèi)揮發(fā)性成分，但并未對(duì)其提取工藝條件進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化。因此，本研究以總酚提取量為考察指標(biāo)，從提取溶劑種類(lèi)、料液比、溶劑濃度、提取溫度和提取時(shí)間5個(gè)方面對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化；同時(shí)，對(duì)澳洲堅(jiān)果葉片總酚的體外抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期為澳洲堅(jiān)果葉片的綜合利用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

澳洲堅(jiān)果葉片：由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所種質(zhì)資源圃提供，品名為南亞1號(hào)。新鮮澳洲堅(jiān)果葉片經(jīng)粉碎后保存于-20℃冰箱備用。

1.2 試劑與設(shè)備

沒(méi)食子酸（＞99%）：阿拉丁化學(xué)試劑有限公司；水溶性維生素E（Trolox）、1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）：sigma公司；福林酚、碳酸鈉、無(wú)水乙醇：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒（FRAP法）：碧云天生物技術(shù)有限公司。

CP214分析天平：奧康斯儀器有限公司；ST40高速冷凍離心機(jī)：賽默飛世爾科技（中國(guó)有限公司）；BCD-539WT冰箱：青島海爾股份有限公司；VB-250A高速多功能粉碎機(jī)：浙江永康市速峰工貿(mào)有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鄭州杜甫儀器廠；Spark 10M酶聯(lián)免疫分析儀：瑞士TECAN公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 澳洲堅(jiān)果葉片酚類(lèi)物質(zhì)提取方法

取一定量粉碎后的澳洲堅(jiān)果葉片置于三角瓶，按試驗(yàn)設(shè)定的料液比加入一定濃度提取溶劑，在設(shè)定的提取溫度、提取時(shí)間條件下進(jìn)行提取。提取結(jié)束后，于8 000 r/min條件下離心10 min，取上清液保存于4℃冰箱備用。

1.3.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.2.1 提取溶劑種類(lèi)對(duì)澳洲堅(jiān)果葉片酚類(lèi)物質(zhì)提取的影響

分別準(zhǔn)確稱(chēng)取2.00 g澳洲堅(jiān)果葉片置于150 mL三角瓶，按料液比為1∶40（g/mL）分別加入40%甲醇、水、40%丙酮、40%乙醇，于提取溫度40℃、磁力攪拌速度150 r/min條件下提取90 min。提取結(jié)束后按1.3.1進(jìn)行操作。

1.3.2.2 乙醇濃度對(duì)澳洲堅(jiān)果葉片酚類(lèi)物質(zhì)提取的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取2.00 g澳洲堅(jiān)果葉片置于150 mL三角瓶，分別加入濃度為20%、30%、40%、50%、60%、70%的乙醇作為提取溶劑，在料液比1∶40（g/mL）、提取溫度在40℃條件下提取60 min。提取結(jié)束后按

1.3.1 進(jìn)行操作。

1.3.2.3 提取溫度對(duì)澳洲堅(jiān)果葉片酚類(lèi)物質(zhì)提取的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取2.00 g澳洲堅(jiān)果葉片置于150 mL三角瓶，按料液比為1∶40（g/mL）加入40%乙醇，分別在20、30、40、50、60、70 ℃條件下提取 60 min。提取結(jié)束后按1.3.1進(jìn)行操作。

1.3.2.4 料液比對(duì)澳洲堅(jiān)果葉片酚類(lèi)物質(zhì)提取的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取2.00 g澳洲堅(jiān)果葉片置于150 mL三角瓶，分別按料液比為 1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50、1∶60（g/mL）加入40%乙醇，在提取溫度為50℃條件下提取60 min。提取結(jié)束后按1.3.1進(jìn)行操作。

1.3.2.5 提取時(shí)間對(duì)澳洲堅(jiān)果葉片酚類(lèi)物質(zhì)提取的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取2.00 g澳洲堅(jiān)果葉片置于150 mL三角瓶，按料液比為1∶40（g/mL）加入40%乙醇，在50℃條件下分別提取 10、15、20、25、40、60 min。提取結(jié)束后按1.3.1進(jìn)行操作。

1.3.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在1.3.2單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以總酚提取量為考察指標(biāo)，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)。因素水平設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factor level of orthogonal tests

1.3.4 總酚提取量的測(cè)定方法

取0.2 mL澳洲堅(jiān)果葉片提取液于15 mL離心管，然后依次加入5.8 mL去離子水、2 mL 10%福林酚試劑和2 mL 10%Na2CO3，充分混合后避光反應(yīng)45 min，于765 nm處測(cè)吸光值，平行測(cè)3次。以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=0.107 9X+0.011（R2=0.999 1。式中：Y為吸光值；X為沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，mg/L）。澳洲堅(jiān)果葉片總酚提取量計(jì)算公式如下[15]：

澳洲堅(jiān)果葉片總酚提取量/（mg/100 g）=50X·V/（10M）

式中：X為標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的沒(méi)食子酸濃度，mg/L；V為提取液體積，mL；M為樣品質(zhì)量，g。

1.3.5 抗氧化能力測(cè)定方法

1.3.5.1 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

將澳洲堅(jiān)果葉片提取液按不同濃度梯度進(jìn)行稀釋?zhuān)謩e取稀釋后的澳洲堅(jiān)果葉片提取液2.0 mL于10 mL離心管，加入2.0 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液，充分混合后避光反應(yīng)30 min，于517 nm處測(cè)吸光值A(chǔ)s；空白對(duì)照吸光值記為A0。以Trolox為陽(yáng)性對(duì)照，平行測(cè)3次。通過(guò)以下公式計(jì)算澳洲堅(jiān)果葉片總酚與Trolox對(duì)DPPH自由基的清除率（P），并計(jì)算半數(shù)清除率IC50[16]。

1.3.5.2 總抗氧化還原能力的測(cè)定

總抗氧化還原能力采用檢測(cè)試劑盒（FRAP法）進(jìn)行測(cè)定，具體步驟如下：取180 μL FRAP工作液（TPTZ稀釋液、TPTZ溶液以及緩沖液按體積比為10∶1∶1充分混合即為FRAP工作液）加入96孔板的檢測(cè)孔，再分別加入5 μL不同濃度FeSO4溶液，于37℃水浴中反應(yīng)5 min，593 nm處測(cè)吸光值，平行測(cè)3次。通過(guò)吸光值與FeSO4溶液濃度的關(guān)系制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算澳洲堅(jiān)果葉片總酚的當(dāng)量濃度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每組試驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù)，結(jié)果取平均值。試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 提取溶劑種類(lèi)對(duì)澳洲堅(jiān)果葉片酚類(lèi)物質(zhì)提取的影響

溶劑種類(lèi)是影響植物活性物質(zhì)提取率的主要因素之一[17]。提取溶劑種類(lèi)對(duì)澳洲堅(jiān)果葉片總酚提取量的影響見(jiàn)圖1。

由圖1可知，在設(shè)定試驗(yàn)條件下，總酚提取量由高到低依次為：40%丙酮、40%乙醇、40%甲醇、水。這可能是提取溶劑極性不同導(dǎo)致了對(duì)酚類(lèi)物質(zhì)的溶解差異。此外，提取溶劑對(duì)植物次級(jí)代謝產(chǎn)物的溶解也會(huì)競(jìng)爭(zhēng)酚類(lèi)物質(zhì)與提取溶劑-水的結(jié)合，從而造成酚類(lèi)物質(zhì)提取差異[18]。由顯著性分析可知，提取溶劑為40%乙醇時(shí)總酚提取量與40%丙酮無(wú)顯著差異（p＞0.05），且與丙酮相比，乙醇毒性及價(jià)格較低。綜合考慮，選取乙醇為提取溶劑對(duì)澳洲堅(jiān)果葉片酚類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行提取。

圖1 提取溶劑種類(lèi)對(duì)澳洲堅(jiān)果葉片總酚提取量的影響Fig.1 Effects of extraction solvents on total phenol content from macadamia leaves

2.1.2 乙醇濃度對(duì)澳洲堅(jiān)果葉片酚類(lèi)物質(zhì)提取的影響

乙醇濃度對(duì)澳洲堅(jiān)果葉片總酚提取量的影響見(jiàn)圖2。

圖2 乙醇濃度對(duì)澳洲堅(jiān)果葉片總酚提取量的影響Fig.2 Effects of ethanol concentration on total phenol content from macadamia leaves

由圖2可知，乙醇濃度為20%～70%時(shí)，澳洲堅(jiān)果葉片總酚提取量隨乙醇濃度增加呈先增加后減少的趨勢(shì)。當(dāng)乙醇濃度為40%時(shí)，總酚提取量達(dá)到最大，為1 056.48 mg/100 g，且與其他條件存在顯著性差異（p＜0.05）。乙醇濃度對(duì)酚類(lèi)物質(zhì)提取具有雙重作用：一方面，水分使物料細(xì)胞溶脹增加，增加了溶劑向細(xì)胞的滲透，從而加大了溶劑與物料的接觸面積，故總酚提取量隨乙醇濃度增加而增加[19]；另一方面，與高濃度乙醇溶液相比，低濃度乙醇溶液中水分比例較高，故極性較大，而總酚是一類(lèi)極性物質(zhì)的結(jié)合，因此乙醇濃度超過(guò)一定范圍時(shí)，與目標(biāo)物質(zhì)極性差異增大，從而總酚提取量隨乙醇濃度增加而減少[20]。Pattrathip等[21]的研究表明乙醇濃度為55%時(shí)，酸橙皮中酚類(lèi)物質(zhì)提取量最高，本試驗(yàn)與其趨勢(shì)一致。同時(shí)，由于濃度增加，會(huì)導(dǎo)致溶劑使用量及成本增加，故乙醇濃度宜選為40%。

2.1.3 提取溫度對(duì)澳洲堅(jiān)果葉片酚類(lèi)物質(zhì)提取的影響

提取溫度對(duì)澳洲堅(jiān)果葉片總酚提取量的影響見(jiàn)圖3。

圖3 提取溫度對(duì)澳洲堅(jiān)果葉片總酚提取量的影響Fig.3 Effects of extraction temperature on total phenol content from macadamia leaves

由圖3可知，在20℃～70℃范圍內(nèi)，澳洲堅(jiān)果葉片總酚提取量隨溫度升高而增加。這可能是由于提取溫度升高，提取溶劑與材料之間的傳質(zhì)增強(qiáng)，目標(biāo)化合物的溶解度增加，從而總酚提取量增加[22]。同時(shí)，由圖3可知，在30℃～50℃范圍內(nèi)，提取溫度對(duì)澳洲堅(jiān)果葉片總酚提取量具有顯著性影響（p＜0.05）；在50℃～70℃范圍內(nèi)，提取溫度對(duì)澳洲堅(jiān)果葉片總酚提取量無(wú)顯著性影響，且當(dāng)提取溫度從50℃升高到70℃時(shí)，澳洲堅(jiān)果葉片總酚提取量?jī)H增加33.34 mg/100 g。此外，溫度升高會(huì)引起溶劑揮發(fā)以及能耗增加，故提取溫度宜選為50℃。

2.1.4 料液比對(duì)澳洲堅(jiān)果葉片酚類(lèi)物質(zhì)提取的影響

料液比對(duì)澳洲堅(jiān)果葉片總酚提取量的影響見(jiàn)圖4。

料液比是影響生物活性物質(zhì)提取的重要因素之一，其主要通過(guò)溶解度和平衡常數(shù)的改變影響目標(biāo)化合物得率。由圖4可知，料液比對(duì)澳洲堅(jiān)果葉片總酚提取量具有顯著影響（p＜0.05）。隨料液比增加，澳洲堅(jiān)果葉片總酚提取量先增加后減少，當(dāng)料液比為1∶50（g/mL）時(shí)，澳洲堅(jiān)果葉片總酚提取量最高，為1 108.72 mg/100 g。料液比在一定范圍內(nèi)，料液比增加，傳質(zhì)推動(dòng)力增加，擴(kuò)散速率增加，從而提取量增加[23]；而超過(guò)一定范圍時(shí)，色素等雜質(zhì)的傳質(zhì)增加，會(huì)抑制總酚向提取溶劑中擴(kuò)散，從而提取量減少。本研究與前期對(duì)澳洲堅(jiān)果青皮中酚類(lèi)物質(zhì)提取研究趨勢(shì)一致[9]。綜合考慮，料液比宜選為1∶50（g/mL）。

圖4 料液比對(duì)澳洲堅(jiān)果葉片總酚提取量的影響Fig.4 Effects of solid to solvent ratio on total phenol content from macadamia leaves

2.1.5 提取時(shí)間對(duì)澳洲堅(jiān)果葉片酚類(lèi)物質(zhì)提取的影響

提取時(shí)間對(duì)澳洲堅(jiān)果葉片總酚提取量的影響見(jiàn)圖5。

圖5 提取時(shí)間對(duì)澳洲堅(jiān)果葉片總酚提取量的影響Fig.5 Effects of extraction time on total phenol content from macadamia leaves

由圖5可知，澳洲堅(jiān)果葉片總酚提取量隨提取時(shí)間增加而增加，當(dāng)提取時(shí)間大于25 min時(shí)，澳洲堅(jiān)果葉片總酚提取量增加不顯著（p＞0.05）。這可能是因?yàn)椋弘S提取時(shí)間增加，傳質(zhì)推動(dòng)力逐漸減小，總酚在提取溶劑中逐漸達(dá)到溶解平衡；同時(shí)，在酚類(lèi)物質(zhì)向提取溶劑擴(kuò)散的過(guò)程中，酶降解以及氧化等反應(yīng)會(huì)造成酚類(lèi)化合物破壞，從而提取時(shí)間超過(guò)一定范圍時(shí)，其對(duì)酚類(lèi)物質(zhì)提取影響不顯著。本研究與Una-Jovana Vaji等[24]的研究結(jié)果相近，其研究表明在提取時(shí)間大于30 min時(shí)，酚類(lèi)物質(zhì)提取量增加不顯著。由于提取時(shí)間增加，會(huì)導(dǎo)致能耗等增加，因此，提取時(shí)間宜選為25 min。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test

由表2極差分析可知，4個(gè)因素對(duì)澳洲堅(jiān)果葉片酚類(lèi)物質(zhì)的影響順序依次為：料液比、提取溫度、提取時(shí)間、乙醇濃度，澳洲堅(jiān)果葉片酚類(lèi)物質(zhì)提取的最優(yōu)條件為A2B3C3D3，即乙醇濃度為40%，提取溫度為60 ℃，料液比為1∶60（g/mL），提取時(shí)間為 25 min。正交試驗(yàn)組內(nèi)不包含此組合，故需進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)，在最佳提取工藝條件下，澳洲堅(jiān)果葉片總酚提取量為1 176 mg/100 g。

2.3 澳洲堅(jiān)果葉片總酚抗氧化活性研究

2.3.1 DPPH自由基清除能力

澳洲堅(jiān)果葉片總酚與Trolox對(duì)DPPH自由基的清除作用見(jiàn)圖6。

圖6 澳洲堅(jiān)果葉片總酚與Trolox對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig.6 Scavenging ability of total phenols from macadamia leaves and Trolox on DPPH

由圖 6 可知，在 2 mg/L～10 mg/L、1.25 mg/L～15 mg/L濃度范圍內(nèi)，澳洲堅(jiān)果葉片總酚與Trolox對(duì)DPPH自由基的清除率與濃度呈線性關(guān)系，擬合得到線性方程：Y1=5.885 0X1+7.446 0（R2=0.991 2）；Y2=5.006 3X2-0.806 6（R2=0.999 5）。通過(guò)線性方程計(jì)算，澳洲堅(jiān)果葉片總酚與Trolox對(duì)DPPH自由基的半數(shù)清除率IC50分別為7.23、10.15 mg/L，其中，IC50指DPPH自由基清除率為50%時(shí)的濃度。由此表明，澳洲堅(jiān)果葉片酚類(lèi)物質(zhì)具有較強(qiáng)的抗氧化活性，且優(yōu)于Trolox。

2.3.2 總抗氧化還原能力

總抗氧化能力標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖7。

圖7 總抗氧化能力標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.7 Standard curve of total antioxidant capacity

FRAP法是待測(cè)樣品中抗氧化成分在酸性條件下將Fe3+還原為藍(lán)色Fe2+，在一定波長(zhǎng)條件下測(cè)其吸光值，吸光值越大，則表示抗氧化能力越強(qiáng)。通過(guò)FeSO4溶液濃度與吸光值的關(guān)系，以FeSO4溶液濃度（mg/L）為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=0.309 4X+0.016 9（R2=0.993 4）。當(dāng)澳洲堅(jiān)果葉片總酚及Trolox濃度分別為200 mg/L時(shí)，F(xiàn)eSO4當(dāng)量濃度分別為2.40、1.72 mmol/L，表明澳洲堅(jiān)果葉片總酚具有較強(qiáng)的總抗氧化還原能力。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)正交試驗(yàn)以及極差分析，得到澳洲堅(jiān)果葉片酚類(lèi)物質(zhì)最佳提取工藝條件：乙醇濃度40%、提取溫度 60℃、料液比 1∶60（g/mL）、提取時(shí)間 25min，此時(shí)提取量為1 176 mg/100 g。通過(guò)與Trolox和FeSO4對(duì)比，澳洲堅(jiān)果葉片酚類(lèi)物質(zhì)在體外對(duì)DPPH自由基具有較好的清除效果。此研究可為后續(xù)酚類(lèi)物質(zhì)分離純化以及抗氧化機(jī)制研究奠定試驗(yàn)基礎(chǔ)。