郭亦晨，李珂，2，3，吳中琴，李宗軍，2，3，*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖南長沙410128；2.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙410128；3.國家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南長沙410128）

真菌污染食品主要發(fā)生在糧食作物、油料作物以及發(fā)酵食品上。真菌污染食品主要的危害在于真菌產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物——真菌毒素，它是由具有產(chǎn)毒功能的產(chǎn)毒菌株分泌的一種細(xì)胞外毒素，主要產(chǎn)生于含有豐富碳水化合物的食品原料或動(dòng)物飼料。能產(chǎn)生真菌毒素的真菌一般以霉菌為主，霉菌在自然界分布非常廣泛，同時(shí)霉菌可以產(chǎn)生許多細(xì)小的霉菌孢子，這些霉菌孢子很容易傳播進(jìn)而污染到食品原料和動(dòng)物飼料。真菌污染不僅可以造成腐敗變質(zhì)而且有可能造成人和動(dòng)物中毒，有些真菌毒素造成的危害是不可逆，甚至還有未知的毒害作用[1]?，F(xiàn)代毒理學(xué)研究通常是在模式生物上進(jìn)行試驗(yàn)，得到數(shù)據(jù)和結(jié)果后經(jīng)過一定的分析推及其至人體內(nèi)的毒性作用。研究真菌毒素的模式生物中豬和大鼠最為常見，其次是肉雞和小鼠，另外還有魚類、馬、火雞和兔子，近些年出現(xiàn)果蠅和秀麗隱桿線蟲等無脊椎動(dòng)物[2]。評(píng)價(jià)真菌毒素的毒理學(xué)評(píng)價(jià)試驗(yàn)可歸納為：急性毒性試驗(yàn)、亞急性毒性試驗(yàn)、亞慢性毒性試驗(yàn)、毒代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)和致畸試驗(yàn)。運(yùn)用傳統(tǒng)模式生物評(píng)價(jià)真菌毒素存在代謝情況比較復(fù)雜、繁殖周期過長和飼養(yǎng)條件與經(jīng)濟(jì)成本較高等缺點(diǎn)。由此看出發(fā)展一種簡單、高效和成本低廉的評(píng)價(jià)真菌毒素的模式生物迫在眉睫。

秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans，以下簡稱線蟲或C.elegans）作為模式生物始于20世紀(jì)60年代，英國科學(xué)家Sydney Brenner（Brenner S）發(fā)現(xiàn)了這種可以在土壤中自由生活的線蟲[3]，70年代中期，John Edward Sulston（Sulston J E）構(gòu)建了完整的線蟲細(xì)胞譜系圖[4]，并與Brenner S合作完成了線蟲神經(jīng)元的完整結(jié)構(gòu)圖[5]，90年代末他們完成了線蟲的全基因測(cè)序，使線蟲成為基因組被完整測(cè)序的第一個(gè)動(dòng)物。線蟲作為模式生物最初是應(yīng)用于發(fā)育生物學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)領(lǐng)域，而今線蟲已經(jīng)發(fā)展成為研究發(fā)育、壽命和環(huán)境毒理學(xué)等方面重要的模式生物[6]。

1 秀麗隱桿線蟲及真菌毒素簡介

1.1 秀麗隱桿線蟲

線蟲是一種可以生活在土壤中、個(gè)體微小的、以細(xì)菌為食的生物。成年線蟲呈蠕蟲狀，體長大概1.5 mm。線蟲身體全體通透，其表面有角質(zhì)層包裹。線蟲有雄性與雌雄同體兩種性別，其中雌雄同體占99.8%，雌雄同體線蟲交配時(shí)尾部可由錐形變成扇形，一條雌雄同體線蟲與雄性線蟲交配可產(chǎn)生1 000多條后代，雌雄同體線蟲能產(chǎn)生大概300枚受精卵[7]。

1.2 真菌毒素

常見的真菌毒素有黃曲霉毒素B1（aflatoxin，AFB1）、赭曲霉毒素A（ochratoxins A，OTA）、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEA）、T-2毒素以及脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）等。這些真菌毒素對(duì)人和動(dòng)物的危害包括致癌、致畸、致突變、生殖毒性、神經(jīng)毒性和基因毒性等。鑒于真菌毒素的危害，我國制定了相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)。幾種重要的真菌毒素及其生物學(xué)作用和中毒狀見表1[8]。

表1 重要的真菌毒素Table 1 Important mycotoxins

1.3 常用評(píng)價(jià)真菌毒素毒性的試驗(yàn)方法

常用于評(píng)價(jià)真菌毒素毒性的試驗(yàn)方法有急性毒性試驗(yàn)、亞急性毒性試驗(yàn)、亞慢性毒性試驗(yàn)、慢性毒性試驗(yàn)、致畸試驗(yàn)和毒物動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)，歸納如表2。

表2 常用評(píng)價(jià)真菌毒素毒性的試驗(yàn)方法Table 2 Common methods of evaluating mycotoxin toxicity

2 應(yīng)用線蟲評(píng)價(jià)真菌毒素的常用指標(biāo)

2.1 致死率

應(yīng)用線蟲研究真菌毒素常用的致死率指標(biāo)參數(shù)包括 LC10、LC20和 LC50，分別代表 10%、20%和 50%受試模式生物死亡所需要的毒物濃度，其中以LC50最為常見。因致死率指標(biāo)與其它指標(biāo)存在相當(dāng)大的關(guān)聯(lián)性，所以致死率指標(biāo)常與其它評(píng)價(jià)指標(biāo)共同使用[14]。Yang等[15]使用不同濃度的AFB1、DON、伏馬毒素B1（fumonisin B1，F(xiàn)B1）、T-2 毒素和 ZEA 處理野生型線蟲（N2）24 h，并計(jì)算它們的LC50，其試驗(yàn)結(jié)果顯示這5種真菌毒素的LC50為：T-2毒素（1mg/L）＞AFB1（20mg/L）＞ZEA（76 mg/L）＞FB1（235 mg/L）＞DON（657 mg/L）。致死率評(píng)價(jià)指標(biāo)分析過程簡易、效果顯著、試驗(yàn)周期短，是利用線蟲評(píng)價(jià)真菌毒素毒性的基本評(píng)價(jià)指標(biāo)。

2.2 個(gè)體發(fā)育與運(yùn)動(dòng)行為指標(biāo)

個(gè)體發(fā)育指標(biāo)通常包括體長、體寬和畸形指標(biāo)，體長指標(biāo)是在毒理學(xué)評(píng)價(jià)中最先使用的指標(biāo)[16]，常結(jié)合體寬應(yīng)用。研究中，一般將L4期的線蟲暴露一段時(shí)間，再通過Image-ProExpress software進(jìn)行后續(xù)的分析[17-21]。Yang等[15]使用 L2 時(shí)期的野生型線蟲（N2）進(jìn)行真菌毒素對(duì)線蟲個(gè)體發(fā)育影響的研究，線蟲染毒72 h，每24 h進(jìn)行比較觀察，該研究表明受試線蟲在5種真菌毒素的作用下，線蟲的發(fā)育都表現(xiàn)出一定的劑量效應(yīng)關(guān)系，隨著真菌毒素濃度的增加，其對(duì)線蟲形態(tài)發(fā)育的抑制也越明顯，且依據(jù)EC50來看，所用真菌毒素對(duì)線蟲發(fā)育影響的順序?yàn)椋篈FB1＞T-2毒素＞ZEA＞FB1＞DON。周鴻媛等[22]研究表明在 0～48 h 內(nèi)：AFB1隨著暴露時(shí)間的增加，它對(duì)線蟲體長增長的抑制作用越強(qiáng)；DON隨著暴露時(shí)間的增加，它對(duì)線蟲體長增長的抑制作用越弱；ZEA在此水平上則無明顯區(qū)別。研究表明，各種真菌毒素除獨(dú)自具有毒性外，它們的聯(lián)合作用毒性危害更大，且在實(shí)際生活中造成的危害往往是多種真菌毒素聯(lián)合作用的結(jié)果，其聯(lián)合毒性主要表現(xiàn)在干擾蛋白質(zhì)合成途徑、破壞機(jī)體免疫、引起氧化應(yīng)激和發(fā)育生殖毒性等[23-30]。周鴻媛等[22]用AFB1、DON、和ZEA 3種真菌毒素通過不同的組合分為不同的混合真菌毒素，且設(shè)置高、中和低3個(gè)劑量組，將其染毒L2時(shí)期的野生型線蟲（N2）并測(cè)量體長，該研究表明AFB1+DON和AFB1+ZEA較單一暴露對(duì)線蟲體長的抑制作用增強(qiáng)，表現(xiàn)出協(xié)同作用；DON+ZEA較單一暴露對(duì)線蟲體長的抑制作用減弱，表現(xiàn)出拮抗；AFB1+DON+ZEA因濃度、時(shí)間等表現(xiàn)出不同的聯(lián)合毒性類型。體長反映發(fā)育速率，體寬反映發(fā)育速率和生理狀態(tài)，畸形暗示著高強(qiáng)度毒性的存在[31]。運(yùn)動(dòng)行為指標(biāo)通常包括擺頭頻率、彎曲頻率、運(yùn)動(dòng)速率和基本運(yùn)動(dòng)能力，運(yùn)動(dòng)行為指標(biāo)是反映線蟲神經(jīng)系統(tǒng)的指標(biāo)。運(yùn)動(dòng)行為指標(biāo)具有操作簡易、效果直觀明了、周期短和成本低廉等優(yōu)點(diǎn)。此外，咽泵運(yùn)動(dòng)、化學(xué)趨向性行為、消化能力和攝食也常用做分析線蟲代謝與運(yùn)動(dòng)的指標(biāo)[32]。

2.3 生殖能力與壽命指標(biāo)

生殖能力指標(biāo)包括世代時(shí)間、后代數(shù)目與子宮內(nèi)卵數(shù)目。世代時(shí)間反映繁殖速度，后代數(shù)目反映繁殖能力，子宮內(nèi)卵數(shù)目反映繁殖能力與生理功能。楊振東等[33]利用ZEN對(duì)野生型線蟲（N2）進(jìn)行親代染毒，后代斷毒。研究結(jié)果表明ZEN可對(duì)線蟲產(chǎn)生可傳遞的發(fā)育與生殖能力缺陷，發(fā)育的缺陷尚可在子代中得到部分恢復(fù)，生殖缺陷并沒有明顯恢復(fù)。首次證實(shí)了ZEN對(duì)線蟲發(fā)育與生殖能力點(diǎn)破壞是長期的，但這種親本與自帶之間的傳遞并不能簡單的認(rèn)為是遺傳學(xué)上的“遺傳”，需進(jìn)一步研究。壽命指標(biāo)一般包括最長壽命和半致死天數(shù)，秀麗隱桿線蟲的壽命一般為25 d～30 d。有研究[34]發(fā)現(xiàn) AFB1、DON、FB1、T-2 毒素和 ZEA 5 種真菌毒素均對(duì)線蟲的壽命有較大的影響，表現(xiàn)為縮短線蟲的最長壽命和半致死天數(shù)，依據(jù)線蟲壽命縮短的速度，得到這5種真菌毒素對(duì)線蟲壽命影響的排序?yàn)椋篢-2 毒素＞AFB1＞ZEA＞FB1＞DON。在該研究中：對(duì)照組線蟲最大壽命和最長半致死天數(shù)分別為29、12 d；劑量組線蟲最大壽命和最長半致死天數(shù)分別為13、6 d。由此可見真菌毒素對(duì)線蟲壽命具有很強(qiáng)的抑制作用。

3 真菌毒素對(duì)線蟲先天免疫信號(hào)通路的影響

線蟲最先在土壤中被發(fā)現(xiàn)，它可在土壤中健康的生存，土壤中含有多種微生物、重金屬和有毒化學(xué)物質(zhì)等諸多不利因素[35]，所有動(dòng)物都具有先進(jìn)的先天免疫系統(tǒng)，以保護(hù)它們免受環(huán)境中的病原體的侵害[36]，線蟲也不例外，過去幾十年的研究表明這種防御機(jī)制的許多特征都是高等脊椎動(dòng)物所共有的，線蟲的先天免疫信號(hào)通路主要有：胰島素／類胰島素生長因子-1（insulin/Insulin-like growth factory-1，IIS）、細(xì)胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）、轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factorβ，TGF-β）、絲裂原激活的蛋白激酶（mitogen activated protein kinases，MAPK）。這些通路在線蟲抗病原甚至對(duì)抗外界不良刺激等方面都起到了積極的調(diào)控作用，但有關(guān)真菌毒素如何影響這些調(diào)控通路的研究很少，現(xiàn)將有關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行歸納。

3.1 IIS途徑

Kenyon等[37]發(fā)現(xiàn)了能影響線蟲壽命的IIS途徑，此后IIS與線蟲生長發(fā)育與壽命之間關(guān)系的試驗(yàn)越來越多。IIS對(duì)生物體生長、繁殖、新陳代謝乃至壽命是最重要生物調(diào)控通路之一，主要是通過DAF-16（其轉(zhuǎn)錄因子FOXO）同源物來實(shí)現(xiàn)的。Iser WB[38]首次提出了daf-2/IIS具有調(diào)控壽命的作用。有文獻(xiàn)報(bào)道[39]，外界不良環(huán)境、氧化應(yīng)激、饑餓和熱刺激等都會(huì)對(duì)IIS通路產(chǎn)生抑制。還有研究者[40]提出IIS和FOXO還具有調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物和線蟲神經(jīng)元的作用，他們首次鑒定了野生型線蟲和IIS/FOXO突變型成年神經(jīng)元轉(zhuǎn)錄組，IIS/FOXO神經(jīng)元特異性靶點(diǎn)是IIS/daf-2突變體延長記憶所必需的，轉(zhuǎn)錄因子fkh-9在神經(jīng)元中是daf-2突變體再生軸突所必需的，而在非神經(jīng)元組織中daf-2是突變體延長壽命所必需的，他們的研究印證了Iser WB等的假設(shè)。Senchuk等[41]研究了3種線蟲線粒體突變（clk-1，isp-1和nuo-6）來研究其長壽途徑，發(fā)現(xiàn)受FOXO轉(zhuǎn)錄因子DAF-16調(diào)控的基因在所有3個(gè)突變體品系中均上調(diào)，并且這些線蟲中存在的轉(zhuǎn)錄變化與IIS途徑突變體daf-2明顯相同。且DAF-16和多個(gè)DAF-16相互作用蛋白（MATH-33，IMB-2，CST-1/2，BAR-1）對(duì)于所有3個(gè)線蟲線粒體突變體的維持正常壽命而言是必需的，這些突變體中DAF-16的活化是由ROS水平升高引起的，總的來說該研究揭示了3種線蟲線粒體突變體中長壽的重疊遺傳途徑，此結(jié)果與之前的研究相結(jié)合，證明DAF-16是多種長壽途徑中延長壽命的介質(zhì)。

3.2 PCD途徑

程序性細(xì)胞死亡，通常稱為細(xì)胞凋亡，是多細(xì)胞生物生長發(fā)育過程中的重要過程，PCD的調(diào)控異?？赡軙?huì)導(dǎo)致機(jī)體疾病甚至癌癥、自身免疫病和視網(wǎng)膜變性等[42-43]，其過程見圖1。

圖1 PCD過程Fig.1 Process of PCD

線蟲是研究PCD的理想模式生物，因?yàn)榫€蟲的1090個(gè)體細(xì)胞中131個(gè)會(huì)發(fā)生PCD。促凋亡和促生存蛋白可能存在于大多數(shù)細(xì)胞中[44]，ced-9抑制凋亡，ced-3和ced-4促進(jìn)凋亡，還有吞噬基因ced-1、ced-2、ced-5、ced-6、ced-7、ced-8 和 ced-10，細(xì)胞死亡通常在促凋亡基因egl-1的轉(zhuǎn)錄控制水平上進(jìn)行，當(dāng)產(chǎn)生EGL-1 BH3蛋白時(shí)，它破壞抗凋亡ced-9 Bcl-2蛋白和ced-4 Apaf-1樣蛋白之間的細(xì)胞保護(hù)作用，釋放ced-4激活促凋亡胱天蛋白酶ced-3[45]，從而促進(jìn)凋亡。Feng等[46]將同期化的線蟲暴露在不同濃度的AFB1溶液中48 h，結(jié)果顯示當(dāng)AFB1濃度為10 mol/L較對(duì)照組無差異，然而當(dāng)濃度增至30 mol/L和90 mol/L時(shí)，線蟲體內(nèi)凋亡基因會(huì)明顯增加，分析后發(fā)現(xiàn)在10和30暴露組中，AFB1在xpa-1突變株中比N2品系中更容易誘導(dǎo)PCD。

3.3 TGF-β途徑

TGF-β途徑是進(jìn)化上高度保守的免疫防御途徑，在不良的環(huán)境條件下，線蟲可停止發(fā)育進(jìn)入dauer階段，當(dāng)環(huán)境條件改善時(shí)，它們會(huì)恢復(fù)發(fā)育并成年。調(diào)控線蟲進(jìn)入或退出dauer的3條關(guān)鍵的信號(hào)傳導(dǎo)途徑為TGF-β、IIS和鳥苷酸環(huán)化酶途徑。該途徑是參與調(diào)控細(xì)胞生長、分化和死亡的重要信號(hào)通路之一，雖然線蟲中有 5種 TGF-β 相關(guān)配體（dbl-1、daf-7、unc-129、tig-2和tig-3），但只有兩種完整的TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)通路被描述出來，分別是以daf-7和dbl-1為配體的Dauer pathway和Sma/Mad pathway。Dauer途徑中daf-7通過I型受體daf-1和II型受體daf-4發(fā)出信號(hào)，Sma/Mab途徑中dbl-1通過I型受體sma-6和II型受體daf-4發(fā)出信號(hào)。與人類一樣，線蟲通常在成年中期停止繁殖，線蟲平均生殖跨度約為3.5 d，而dbl-1突變線蟲的平均生殖跨度為7 d以上，dbl-1途徑通常限制生殖跨度并促進(jìn)及時(shí)停止生殖，從機(jī)理上講，DBL-1途徑通過調(diào)節(jié)種系和卵母細(xì)胞的質(zhì)量來調(diào)節(jié)生殖衰老[47]。

3.4 MAPK途徑

線蟲秀早已被確定在先天免疫上具有保守的機(jī)制[48]。哺乳動(dòng)物中3條高度保守的MAPK信號(hào)通路分別是：細(xì)胞因子抑制的抗炎藥物結(jié)合蛋白激酶（cytokine-suppressive anti-inflammatory drug-binding protein kinase，p38 MAPK）、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extra－cellular signal-regulated kinases，ERK MAPK）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK MAPK），這3條信號(hào)通路分別對(duì)應(yīng)線蟲中的PMK-1、MPK-1和KGB-1。Yang等[49]首次在DON的暴露下觀察到胃上皮細(xì)胞（GES-1）中ROS快速增加，同時(shí)觀察到線粒體DNA損傷、呼吸鏈?zhǔn)軗p、耗氧率降低、G2/M細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)FOXO3a是關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，能調(diào)節(jié)與線粒體DNA損傷和細(xì)胞損傷相關(guān)的凋亡基因。此外，敲除FOXO3a可降低DON對(duì)GES-1的毒性，F(xiàn)OXO3a通過ROS/JNK/FOXO3a起著關(guān)鍵作用，作為DON誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的負(fù)調(diào)節(jié)劑。有研究[50]將處于 L2時(shí)期的線蟲暴露于 125、250、500 μg/mL DON 中24 h，暴露于250、500 μg/mL DON會(huì)使線蟲的存活率從100%降低至95%，而暴露于125 μg/mL DON中則沒有影響。盡管對(duì)L2期線蟲的生存能力影響很小，但暴露于DON會(huì)導(dǎo)致線蟲繁殖力明顯降低，DON暴露24 h可使后線蟲產(chǎn)卵的數(shù)量分別減少36.7%，72.0%和92.7%。RT-qPCR分析表明DON顯著上調(diào)了C17H12.8，K08D8.5和 F35E12.5的 mRNA 水平，而C17H12.8和K08D8.5正是編碼 PMK-1的基因，RNAseq分析表明C17H12.8和K08D8.5基因表達(dá)分別增加了32.4倍和2倍。

4 總結(jié)與展望

真菌毒素作為危害糧食安全的重要因素，近些年越來越受到研究者的重視，據(jù)PubMed數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)，自2010年開始公開發(fā)表的關(guān)于真菌毒素的科研文章開始迅速增長。此前研究真菌毒素毒性的模式生物主要是豬、大鼠和雞等動(dòng)物，這些模式生物大都存在生命周期較長、生理結(jié)構(gòu)復(fù)雜、飼養(yǎng)環(huán)境要求苛刻、不易實(shí)驗(yàn)室研究等困難。自上個(gè)世紀(jì)90年代開始，研究者把秀麗隱桿線蟲應(yīng)用到模式生物毒理學(xué)中來，利用線蟲評(píng)價(jià)重金屬、農(nóng)藥和化學(xué)材料等外源毒物的毒性。不計(jì)其數(shù)的研究證實(shí)秀麗隱桿線蟲是理想的毒理學(xué)評(píng)價(jià)模式生物，其擁有全身透明、結(jié)構(gòu)簡單、生長繁殖速度快、周期短、與人類基因相似度高和可實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)等不可替代的優(yōu)點(diǎn)。近幾年，研究者才開始利用秀麗隱桿線蟲研究真菌毒素，研究者利用發(fā)育、運(yùn)動(dòng)、致死率、生殖能力和壽命等指標(biāo)證實(shí)了真菌毒素可顯著抑制線蟲的生長發(fā)育，減短壽命，減少后代數(shù)目和降低后代質(zhì)量，其對(duì)線蟲表現(xiàn)出“三致”毒性。這些是與之前利用其他模式生物研究真菌毒素的結(jié)果相符合的。雖然將線蟲應(yīng)用到環(huán)境評(píng)價(jià)和生態(tài)毒理學(xué)領(lǐng)域已有將近30年的歷史，但近幾年才初步構(gòu)建以秀麗隱桿線蟲為模式生物評(píng)價(jià)真菌毒素的體系。但在實(shí)驗(yàn)室條件下，線蟲的應(yīng)用仍存在以下問題：（1）液體試驗(yàn)中線蟲數(shù)量難以控制；（2）運(yùn)動(dòng)行為指標(biāo)在判斷時(shí)具有很大的主觀性；（3）各階段線蟲敏感性差異；（4）試驗(yàn)過程中各生物化學(xué)抑制劑對(duì)線蟲本身的影響；（5）各信號(hào)通路間的交聯(lián)作用不清晰。起步晚、發(fā)展快是基于線蟲的真菌毒素研究的特點(diǎn)，對(duì)于真菌毒素如何影響線蟲的IS、PCD、TGF-β和MAPK等通路的機(jī)制研究資料相當(dāng)缺乏，這是研究者未來工作的焦點(diǎn)，在后續(xù)的研究中也應(yīng)著重研究這些通路之間的相互作用。